Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Фенибут и кислота салициловая: физико химические свойства и методы анализа. взаимодействие лекарственных веществ 10
1.1. Общая характеристика фенибута и кислоты салициловой 10
1.2. Общая характеристика салифена 17
1.3. Методы анализа фенибута и кислоты салициловой
1.3.1. Химические методы анализа фенибута, кислоты салициловой и их некоторых производных 18
1.3.2. Физико-химические методы анализа фенибута, кислоты салициловой и их некоторых производных 22
1.4. Взаимодействие лекарственных веществ 25
Выводы по главе 1 26
ГЛАВА 2. Изучение взаимодействия фенибута и кислоты салициловой в салифене 28
2.1. Изучение взаимодействия фенибута и кислоты салициловой в салифене термическими методами 28
2.2. Изучение взаимодействия фенибута и кислоты салициловой в салифене спектральными методами 34
Выводы по главе 2 45
ГЛАВА 3. Использование хроматографических методов для анализа салифена 46
3.1. Обнаружение у-амино-Р-фенилмасляной кислоты, кислоты салициловой и продуктов деструкции в субстанции салифена с помощью хроматографии в тонком слое сорбента 46
3.1.1. Выбор оптимальной системы растворителей 46
3.1.2. Выбор оптимального проявителя и установление пределов обнаружения 50
3.1.3. Разработка методик идентификации и контроля чистоты субстанции салифена
3.2. Качественное и количественное определение салифена и продуктов его деструкции с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии 55
3.2.1. Выбор условий анализа субстанции салифена методом ВЭЖХ 56
3.2.2. Валидация ВЭЖХ методик контроля подлинности, количественного определения и чистоты субстанции салифена 62
Выводы по главе 3 76
ГЛАВА 4. Разработка методик качественного и количественного определения салифена 77
4.1. Разработка методик качественного анализа салифена 77
4.2. Разработка методик количественного определения салифена 81
4.2.1. Разработка методик количественного определения кислоты салициловой в субстанции салифена 81
4.2.1.1. Выбор условий количественного определения кислоты салициловой в субстанции салифена с помощью обратного броматометрического титрования 81
4.2.1.2. Выбор условий количественного определения кислоты салициловой в субстанции салифена фотометрическим методом на основе реакции с железа (III) хлоридом 90
4.2.2. Разработка методик количественного определения у-амино-Р-фенилмасляной кислоты в субстанции салифена 93
4.2.2.1. Выбор условий количественного определения у-амино-р-фенилмасляной кислоты с помощью титрования в среде неводного растворителя 93
4.2.2.2. Выбор условий количественного определения у-амино-Р-фенилмасляной кислоты фотометрическим методом на основе реакции с нингидрином 95
4.2.3. Разработка методики количественного определения у-амино-Р-фенилмасляной кислоты и кислоты салициловой в одной навеске субстанции салифена 100
4.3. Сравнительная оценка методик количественного определения у-амино-(3-фенилмасляной кислоты и кислоты салициловой в субстанции салифена 108
Выводы по главе 4 111
ГЛАВА 5. Разработка норм качества на субстанцию салифена 112
5.1. Описание 112
5.2. Растворимость 112
5.3. Подлинность 112
5.4. Температура плавления 112
5.5. Прозрачность и цветность 113
5.6. Водородный показатель (рН) 114
5.7. Посторонние примеси 114
5.8. Потеря в массе при высушивании 116
5.9. Сульфатная зола и тяжелые металлы 118
5.10. Микробиологическая чистота 118
5.11. Количественное определение 118
5.12. Срок годности 119
Выводы по главе 5 125
Общие выводы 126
Список литературы
- Химические методы анализа фенибута, кислоты салициловой и их некоторых производных
- Изучение взаимодействия фенибута и кислоты салициловой в салифене спектральными методами
- Выбор оптимального проявителя и установление пределов обнаружения
- Разработка методик количественного определения кислоты салициловой в субстанции салифена
Введение к работе
Актуальность темы. Стандартизация и контроль качества лекарственных средств играют важнейшую роль в обеспечении населения эффективными и безопасными лекарственными препаратами. Это в бльшей степени относится к лекарственным средствам, применяемым для лечения больных с нарушениями мозгового кровообращения. Поэтому наряду с поисками новых средств для лечения указанных заболеваний, необходимо решать вопросы разработки методов их анализа.
К числу таких лекарственных препаратов относятся производные -аминомасляной кислоты (ГАМК). Они показали свою эффективность при терапии различных форм ишемии головного мозга. ГАМК-ергические лекарственные вещества, к числу которых относится фенибут (-амино--фенилмасляной кислоты гидрохлорид), способны сохранять высокие показатели кардио- и гемодинамики в условиях ишемии мозга и миокарда. Однако имеются возможности повышения эффективности фенибута путем его сочетания с другими биологически активными соединениями. С этой целью на кафедре органической химии Российского государственного педагогического университета им. А.И. Герцена (г. Санкт-Петербург) был синтезирован ряд биологически активных соединений, одним из которых является салифен – аддукт -амино--фенилмасляной кислоты (АФМК) и кислоты салициловой в молярном соотношении 2:1. Предварительные доклинические исследования салифена, проведенные на базе Волгоградского государственного медицинского университета, показывают перспективность его применения в медицинской практике в качестве нейропротекторного и противоишемического лекарственного средства. В то же время для его внедрения в медицинскую практику необходимы объективные и надежные методы контроля качества. До настоящего времени разработкой методов анализа салифена не занимались. Необходимость их разработки связана также и с тем, что неизвестен характер взаимодействия фенибута и салициловой кислоты в салифене, а, следовательно, не выяснены вопросы взаимного влияния компонентов на результаты определения каждого из них.
Поэтому разработка методов стандартизации и контроля качества салифена является актуальным вопросом для фармацевтической науки и практики.
Цели и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось изучение взаимодействия АФМК с кислотой салициловой и стандартизация нового биологически активного соединения салифен.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
-
Изучить взаимодействие АФМК и кислоты салициловой с помощью термических и спектральных методов.
-
Исследовать возможность использования химических и физико-химических методов анализа для подтверждения подлинности салифена в субстанции.
-
Изучить возможность применения хроматографических, оптических и химических методов для количественного определения АФМК и кислоты салициловой в субстанции салифена.
-
Обосновать условия применения хроматографического анализа для контроля чистоты субстанции салифена.
-
Изучить факторы, обусловливающие стабильность и установить срок годности субстанции салифена.
-
Разработать нормы качества и подготовить проект ФСП на субстанцию салифена.
Научная новизна. Проведено изучение характера взаимодействия фенибута с салициловой кислотой с помощью ПМР- и ИК-спектрометрии, а также термических методов. Показано, что взаимодействие между компонентами происходит за счет аминогруппы фенибута и карбоксильной группы салициловой кислоты. Установлено, что в ИК-спектре салифена отсутствует полоса поглощения неионизированной карбоксильной группы, в спектре ПМР также не регистрируется сигнал протона карбоксильной группы. В связи с этим высказано предположение об образовании водородной связи между карбоксильной группой фенибута и фенольным гидроксилом салициловой кислоты. На основании изучения физико-химических свойств салифена и его составных частей обоснованы методики качественного и количественного определения салифена. В результате валидационной оценки доказана приемлемость методик количественного определения салифена с помощью физико-химических и химических методов. Обоснована методика количественного определения фенибута и кислоты салициловой в субстанции салифена, позволяющая проводить анализ в одной навеске без разделения. Осуществлен выбор условий контроля чистоты субстанции салифена с помощью ТСХ и ВЭЖХ. Методом ускоренного старения изучена стабильность субстанции салифена и установлен срок годности.
Практическая значимость результатов исследования. Разработаны и валидированы методики испытаний на подлинность, чистоту и количественного определения салифена химическими и физико-химическими методами. Валидационная оценка предлагаемых методик показала, что они отличаются простотой выполнения, высокой чувствительностью, отсутствием систематической погрешности и позволяют достоверно оценивать качество субстанции салифена. Разработанные методики анализа и нормы качества включены в проект ФСП.
Внедрение результатов исследования в практику. Разработаны проект фармакопейной статьи предприятия и пояснительная записка на субстанцию салифен. Получен акт апробации предлагаемых методик анализа салифена от ОАО «Щелковский витаминный завод», г. Щелково.
Положения, выносимые на защиту:
-
Результаты изучения взаимодействия между фенибутом и кислотой салициловой с помощью термических и спектральных методов.
-
Результаты качественного и количественного определения -амино--фенилмасляной кислоты и кислоты салициловой в субстанции салифена, а также сравнительная оценка разработанных методик.
-
Результаты использования тонкослойной и высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения потенциальных примесных соединений в субстанции салифена.
-
Нормы качества, стабильность и срок годности субстанции салифена.
Апробация и публикация результатов исследования. Основные положения диссертационной работы доложены на региональных конференциях (Пятигорск, 2007 и 2008 гг., Владикавказ, 2007 г., Воронеж, 2007 г.). По теме диссертации опубликовано 6 научных работ.
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО Пятигорская государственная фармацевтическая академия Росздрава (номер государственной регистрации 01.2.00101060).
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 170 страницах машинописного текста, выполненного с помощью компьютерного набора, содержит 40 таблиц, 30 рисунков, состоит из «Введения», «Обзора литературы», 4-х глав собственных исследований, общих выводов, списка литературы, включающего 131 источник, в том числе 33 иностранных, и приложений.
Химические методы анализа фенибута, кислоты салициловой и их некоторых производных
Идентификация фенибута и его производных. Фенибут по своей структуре представляет собой у-аминокислоту и химические методы его анализа основаны на наличии в молекуле карбоксильной группы, первичной алифатической аминогруппы, фенильного радикала и связанной хлороводородной кислоты.
с /
По ФСП 42-03482164-01 подлинность фенибута устанавливают с помощью реакции со спиртовым раствором нингидрина. В результате образуется сине-фиолетовое окрашивание [83].
В ФСП 42-00380051-00 для идентификации фенибута предлагается использовать реакцию, основанную на образовании N-гидроксиметильного производного с раствором формальдегида. Для этого к раствору лекарственного вещества прибавляют фенолфталеин и натрия гидроксид, при этом раствор окрашивается в розовый цвет. Далее к полученному раствору добавляют раствор формалина, что сопровождается обесцвечиванием раствора [82].
Фенибут также дает характерную реакцию на хлориды с серебра нитратом в азотнокислой среде. В результате образуется белый творожистый осадок, растворимый в аммиаке [82, 83].
В. А. Дубовик с соавт. предложено использовать для идентификации производных фенибута - гаммоксина, мефебута и пикамилона реакцию на фенильный радикал с формальдегидом в среде кислоты серной концентрированной. В результате реакции образуются продукты конденсации красного или красно-коричневого цвета [31].
Идентификация кислоты салициловой и ее производных. Химические методы идентификации кислоты салициловой основаны на наличии в ее структуре фенольного гидроксила, карбоксильной группы и фенильного радикала.
ФС 42-1768-96 на субстанцию кислоты салициловой рекомендует для подтверждения подлинности использовать общую реакцию на фенолы с железа (III) хлоридом, в результате которой образуются комплексные соединения сине-фиолетового цвета. Окрашивание исчезает от прибавления нескольких капель кислоты хлороводородной разведенной и не изменяется от прибавления нескольких капель кислоты уксусной разведенной [41].
Для качественного анализа также рекомендуется использовать реакции декарбоксилирования. При нагревании кислоты салициловой с цитратом натрия выделяется фенол, который определяют по характерному запаху. При нагревании с кислотой серной концентрированной образуется диоксид углерода, который пропускают через раствор кальция гидроксида. Аналитическим эффектом реакции служит появление белой опалесценции [42, 45].
Возможно обнаружение кислоты салициловой по реакции с азотистой кислотой (реакция Либермана). При действии азотистой кислоты на кислоту салициловую образуется п-нитропроизводное, которое затем изомеризуется в п-хиноидоксим. Последний в присутствии кислоты серной концентрированной конденсируется с оставшейся неизмененной кислотой салициловой с образованием индофенола слабо-желтого цвета. После прибавления небольшого количества воды раствор приобретает ярко-желтую окраску, а при последующем подщелачивании раствором натрия гидроксида реакционная смесь вновь становится бледно-желтого цвета.
Для подтверждения подлинности кислоты салициловой описана реакция с реактивом Марки (раствор формальдегида в концентрированной серной кислоте). В результате реакции образуется ауриновый краситель ярко-красного цвета. Кислота салициловая также способна образовывать ауриновый краситель желтого цвета при взаимодействии с хлороформом в присутствии раствора натрия гидроксида [49].
Кислота салициловая и некоторые ее производные образуют окрашенные соединения с 4-аминоантипирином в присутствии окислителя — калия гексацианоферрата (III) [96].
С.Г. Тираспольской предложена комплексная схема идентификации кислоты салициловой и ее производных (натрия салицилат, кислота ацетилсалициловая, фенилсалицилат, оксафенамид, салициламид, фенасал) с помощью 3% раствора железа (III) хлорида, 2% раствора 4-аминоантипирина в сочетании с 2% раствором калия гексацианоферрата (III), 5% раствора титана сульфата, 0,5% раствора кислоты фосфорномолибденовой и концентрированного раствора аммиака, 0,4% раствора натрия гидроксида. Схема позволяет отличить друг от друга лекарственные препараты, производные кислоты салициловой [77].
Количественное определение фенибута. По действующим ФСП количественное определение фенибута проводят методом титрования в среде неводного растворителя. В качестве неводной протогенной среды используют смесь кислоты уксусной безводной и раствора ртути (И) ацетата, титрование ведут 0,1 моль/л раствором кислоты хлорной. Точку конца титрования определяют визуально, по переходу окраски индикатора кристаллического фиолетового из сине-зеленой в зеленую, или потенциометрически [82, 83].
А.Я. Веверис и А.И. Лусе рекомендуют использовать для количественного определения фенибута и промежуточных продуктов его синтеза дифференциальное потенциометрическое титрование. В качестве титранта предложено использование 0,1 моль/л раствора калия гидроксида в изопропаноле [17].
Количественное определение кислоты салициловой. Химические методы количественного определения кислоты салициловой основаны на наличии в ее структуре карбоксильной группы и фенольного гидроксила. Наличие карбоксильной группы обусловливает принципиальную возможность использования алкалиметрического титрования. По ФС 42-1768-96 навеску кислоты салициловой растворяют в спирте этиловом 90% и ведут титрование 0,1 моль/л раствором натрия гидроксида, индикатор фенолфталеин [42]. Британская фармакопея 2005 г. издания рекомендует использовать для растворения навески кислоты салициловой смесь спирта 96% и воды (3:2), а в качестве индикатора феноловый красный [102].
Наличие в молекуле кислоты салициловой фенольного гидроксила обусловливает возможность проведения броматометрического определения. В прямом варианте титрование подкисленного раствора кислоты салициловой ведут раствором калия бромата [109] или N-бромсукцинимида [101], индикатор метиловый оранжевый. Реакция протекает без декарбоксилирования, в результате образуется дибромпроизводное кислоты салициловой [109]. В обратном варианте броматометрии к раствору кислоты салициловой прибавляют титрованный раствор калия бромата, калия бромид и кислоту хлороводородную. В результате происходит реакция электрофильного замещения, сопровождаемого декарбоксилированием, и образуется 2,4,6-тринитробромфенол. Затем к реакционной смеси добавляют раствор калия йодида, который в кислой среде реагирует с избытком брома, и выделившийся йод титруют раствором натрия тиосульфата (индикатор — крахмал) [58, 129]. В качестве источника брома возможно также использование броммонохлорида [130]. S.L. Lin предложена методика титрования в среде неводного растворителя, позволяющая проводить количественное определение кислоты салициловой в присутствии кислоты ацетилсалициловой [114].
Изучение взаимодействия фенибута и кислоты салициловой в салифене спектральными методами
Полученные данные свидетельствуют о том, что на кривых ДТА и ДТГ видны четкие эффекты поглощения тепла, связанные с плавлением. При этом значения температур плавления фенибута и кислоты салициловой совпадают с нормативами, приведенными в ФСП на данные лекарственные вещества [41, 82, 83]. Сравнительный анализ показывает, что тепловые эффекты салифена резко отличаются от таковых физической смеси и индивидуальных веществ. Известно, что на практике компоненты смеси могут вызывать изменение температур начала или максимума пика плавления вещества из-за эффекта, аналогичного криоскопическому [90, 94, 95]. Как правило, это является следствием слабых взаимодействий между компонентами смеси. В данном же случае разности температур плавления салифена и фенибута, кислоты салициловой, а также физической смеси фенибута и кислоты салициловой (2:1) составляют 74С, 32С и 78С соответственно. Однако конкретно определить природу взаимодействия не представляется возможным, так как подобные изменения тепловых эффектов могут быть обусловлены разными по природе процессами, такими как образование эвтектической смеси, растворение вещества в расплаве более легкоплавкого компонента смеси, сорбция одного вещества на поверхности другого, образование молекулярных комплексов и т.п.
Таким образом, с помощью термических методов изучены тепловые эффекты, возникающие при нагревании салифена, а также фенибута, кислоты салициловой и физической смеси фенибута с кислотой салициловой в молярном соотношении 2:1. В результате сравнительного анализа полученных кривых ДТА и ДТГ установлено различие более чем на 30С температур плавления салифена, фенибута, кислоты салициловой и физической смеси, что может указывать на наличие взаимодействия между АФМК и кислотой салициловой в салифене. В дальнейшем, для более подробного изучения его природы использовали спектральные методы.
В настоящее время спектральные методы находят широкое применение для решения разнообразных задач аналитической химии. При этом в отношении изучения механизмов химических реакций и установления химической структуры наиболее эффективными и информативными являются инфракрасная (ИК) спектроскопия и спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) [14, 27]. Кроме того, перечисленные методы с успехом используются для исследования межмолекулярных взаимодействий - водородных связей, комплексообразования. Среди различных разновидностей ЯМР в органической химии наиболее широко применяется протонный магнитный резонанс (ПМР).
Для изучения характера взаимодействия АФМК с кислотой салициловой в салифене измеряли ИК и ПМР спектры салифена, АФМК, кислоты салициловой, а также физической смеси фенибута с кислотой салициловой в молярном соотношении 2:1 и затем проводили их сравнительный анализ. Следует подчеркнуть, что в физическую смесь вводили именно фенибута гидрохлорид, так как в этом случае можно с большей долей достоверности судить о поведении карбоксильных групп АФМК и кислоты салициловой, а также первичной алифатической аминогруппы АФМК.
Изучение взаимодействия АФМК с кислотой салициловой в салифене с помощью спектроскопии ПМР. Методика выполнения эксперимента заключалась в следующем: навески салифена, АФМК, кислоты салициловой и физической смеси фенибута гидрохлорида с кислотой салициловой (2:1), массой около 70 мг растворяли в 0,7 мл дейтерированного диметилсульфоксида (ДМСО-D) и запаивали в цилиндрическую стеклянную ампулу длиной 5 мм. Регистрацию спектров ПМР проводили на приборе Bruker Aspect 3000 при рабочей частоте 100 МГц в диапазоне от 8 = 0,0 до 8 = 14,0 В качестве внутреннего эталона использовали тетраметилсилан (5 = 0,00 м.д.).
Спектр ПМР салифена Важнейшей характеристикой спектра ПМР является химический сдвиг (5), который зависит от структуры молекулы. Электронная плотность протонов в молекулах определяется характером химической связи и индукционными эффектами окружающих групп, вследствие чего экранирование протонов становится различным и их сигналы проявляются в разных областях спектра. При интерпретации полученных спектров были использованы данные литературы [10, 36, 38]. Результаты отнесения полос спектра к водородсодержащим функциональным группам молекул исследуемых веществ, представлены в таблице 2.
На спектре ПМР АФМК имеется полоса протона ионизированной аминогруппы NH , сигнал протона карбоксильной группы не регистрируется. Данный факт можно объяснить тем, что АФМК находится в виде цвиттер-иона. Спектр ПМР кислоты салициловой имеет четкие полосы атомов водорода ароматического кольца и карбоксильной группы. При рассмотрении спектра физической смеси фенибута (АФМК гидрохлорида) и кислоты салициловой 2:1 важным является наличие полос протонов с 8 = 12,2, (неионизированная карбоксильная группа) и с 8 = 7,8-7,9 (ионизированная аминогруппа). Это свидетельствует о том, что в протонировании ЫНг-группы АФМК принимает участие хлороводородная кислота, а не карбоксил кислоты салициловой. Спектр ПМР салифена представляет собой сложную комбинацию полос протонов углеводородного скелета АФМК, ароматического кольца и JV#3+ -группы. Сигнал протона карбоксильной группы кислоты салициловой в отличие от спектров физической смеси и кислоты салициловой не регистрируется, что может свидетельствовать о том, что данная группа находится в ионизированном состоянии и именно она участвует в протонировании аминогруппы АФМК. Для проверки этого предположения исследовали спектры поглощения исследуемых веществ и модельной смеси в ИК-области.
Изучение взаимодействия ЛФМК с кислотой салициловой в салифене с помощью ИК-спектроскопии. Согласно ГФ XI [26], измерение ИК спектров поглощения твердых веществ проводят в пастах с иммерсионной жидкостью (вазелиновое масло, полифторуглеводород, гексахлобутадиен и др.) или в дисках с калия бромидом. Мы остановили выбор на дисках с калия бромидом, так как в противном случае возможно мешающее влияние полос поглощения иммерсионной жидкости. Методика исследования заключалась в следующем: 1 мг вещества тщательно смешивали в агатовой ступке с 0,2 г спектроскопически чистого калия бромида и прессовали полученную смесь под давлением 9,0 т/см в течение 5 минут. Спектры измеряли на спектрометре ИКС-40 (ЛОМО, Россия) в режиме пошагового сканирования в диапазоне 4000 - 400 см 1 относительно диска из чистого калия бромида.
РІК спектры фенибута, кислоты салициловой, физической смеси фенибута с кислотой салициловой (2:1) и салифена, измеренные в описанных условиях, представлены на рисунках 9-12. Как и в предыдущем эксперименте ПМР, в физическую смесь вводили фенибута гидрохлорид.
Выбор оптимального проявителя и установление пределов обнаружения
При разработке и выборе методик качественного и количественного определения АФМК кислоты и кислоты салициловой в субстанции салифена были поставлены задачи: - изучить возможность использования химических и физико-химических методов и предложить методики идентификации салифена; - разработать методики количественного определения АФМК и кислоты салициловой в субстанции салифена химическими и физико-химическими методами с учетом их возможного взаимного влияния на результаты определения; - разработать методику количественного определения, позволяющую проводить определение АФМК и кислоты салициловой в субстанции салифена в одной навеске; - осуществить валидационную оценку предлагаемых методик по показателям: линейность, прецизионность (на уровне внутрилабораторной сходимости результатов), аналитическая область методики, правильность; - провести сравнительную оценку количественного определения АФМК и кислоты салициловой в субстанции салифена и выбрать оптимальную для включения в проект ФСП.
Разработка методик качественного анализа салифена Согласно ОСТ 91500.05.001-00 [57] и [4] в ФС на лекарственные вещества (субстанции) включаются методики установления подлинности с помощью УФ- и ИК-спектроскопии, а также с помощью химических реакций.
Ранее (гл. 2.2.; 3.2.) были показаны возможности использования ИК-спектроскопии и ВЭЖХ для идентификации салифена. Поэтому на первом этапе была изучена возможность применения метода УФ-спектрофотометрии для подтверждения подлинности салифена. С этой целью проводили изучение спектров поглощения и определение основных спектральных характеристик салифена, АФМК и кислоты салициловой. В качестве растворителей использовали воду, спирт этиловый 95%, а также растворы кислоты хлороводородной и натрия гидроксида (0,1 и 0,01 моль/л).
В результате изучения данных литературы и собственных исследований было установлено, что АФМК в перечисленных растворителях обладает светопоглощением в диапазоне от 220 до 280 нм, что, по-видимому, обусловлено тс - тг переходами бензольного хромофора [56, 97]. В спектрах поглощения (рис. 1) наблюдаются полосы средней интенсивности при 251±2, 257±2 и 262±2 нм. Положения максимумов и интенсивность светопоглощения практически мало зависят от рН среды. Кислота салициловая способна абсорбировать электромагнитное излучение в диапазоне от 220 до 350 нм. Ее спектры поглощения состоят из полос двух типов электронных переходов: % - 7С в бензольном кольце (длинноволновая полоса) и тик - тс со переходов электронов с бензольного кольца на разрыхляющую ж орбиталь карбонильной группы (коротковолновая полоса). Литературные данные свидетельствуют, что полоса поглощения, расположенная в области 230 нм, обусловлена сопряжением карбоксильной и фенольной групп, а в области 300 нм — относится к бензольному кольцу [77]. Смена растворителя существенного влияния на характер светопоглощения кислоты салициловой не оказывает. При переходе от 0,1 и 0,01 моль/л растворов натрия гидроксида к растворам кислоты хлороводородной аналогичной концентрации, наблюдаются батохромные сдвиги максимумов светопоглощения от 231 к 236 нм, а также от 296 к 303 нм, которые также сопровождаются гиперхромным эффектом.
Далее в тех же растворителях измеряли спектры поглощения салифена. Они оказались по характеру и положению максимумов идентичными спектрам поглощения кислоты салициловой (рисунки 20, 21).
УФ спектр поглощения 0,05% раствора салифена в воде Этот факт можно объяснить значительным различием в способностях кислоты салициловой и АФМК абсорбировать электромагнитное излучение в УФ-области. В наиболее выраженном максимуме светопоглощения АФМК при 257 нм оказался
равен 12, в то же время известно, что этот показатель для кислоты салициловой при 231 нм составляет 480 [77]. Вследствие этого, оказалось невозможным подобрать такую концентрацию раствора салифена, которая позволила бы. провести определение с помощью производной спектрофотометрии. Также не привели к удовлетворительным результатам попытки разрушить соединение и отделить АФМК и кислоту салициловую для последующего определения спектральных характеристик. Таким образом, в результате проведенных исследований установлена неприменимость УФ спектрофотометрии для подтверждения подлинности салифена ввиду отсутствия специфичности.
Следующим этапом исследований явилась разработка методик количественного определения салифена с помощью химических реакций. Для обнаружения АФМК использовали общегрупповую реакцию на аминокислоты с нингидрином. Кислоту салициловую идентифицировали по реакции с железа (III) хлоридом. Предварительными испытаниями было установлено, что при использовании указанных реакций АФМК и кислота салициловая не мешают качественному определению друг друга. Это позволило предложить следующие методики:
Методика идентификация АФМК в субстанции салифена. К 0,05 г салифена прибавляют 10 мл воды, нагретой до кипения, и перемешивают до полного растворения. После охлаждения прибавляют 5 мл фосфатного буферного раствора с рН 6,8, 2 мл 1% спиртового раствора нингидрина и нагревают. Раствор окрашивается в сине-фиолетовый цвет.
Методика идентификации кислоты салициловой в субстанции салифена. К 0,05 г салифена прибавляют 5 мл воды, нагретой до кипения, и перемешивают до полного растворения. После охлаждения к 2 мл раствора прибавляют 2 капли раствора железа (III) хлорида. Появляется сине-фиолетовое окрашивание, которое сохраняется при прибавлении небольшого количества разведенной кислоты уксусной, но исчезает при прибавлении разведенной кислоты хлороводородной. Таким образом, в результате проведенных исследований предложены качественные реакции, позволяющие провести достоверную идентификацию салифена.
Разработка методик количественного определения кислоты салициловой в субстанции салифена
Для определения возможных продуктов деструкции предложено использовать хроматографию в тонком слое сорбента. В качестве подвижной фазы используют смесь спирта этилового 95% и раствора аммиака 25% (9:0,5). Методика проведения испытания на посторонние примеси приведена в п. 3.1.3.
На хроматограмме А испытуемого образца наблюдаются два основных пятна сине-фиолетового цвета, по совокупности величины и интенсивности окраски не превышающие пятна веществ-свидетелей на хроматограммах Б (Rf 0,17-0,27) и В (Rf 0,50-0,60). Допускается наличие одного дополнительного пятна (Rr 0,62-0,68), которое не должно превышать по размеру и интенсивности окраски пятна на хроматограмме Г, что соответствует содержанию примеси - не более 0,35%.
Проверка пригодности хроматографической системы. Хроматографическая система считается пригодной, если выполняются следующее условие: на хроматограмме Д 0,1% раствора СО АФМК кислоты наблюдается пятно на уровне основного пятна на хроматограмме А (предел обнаружения не менее 0,1%).
На хроматограмме лекарственного вещества должно наблюдаться два пятна, находящихся на одном уровне с пятнами СО АФМК (Rf от 0,17 до 0,27) и кислоты салициловой (Rf от 0,50 до 0,60). Допускается также наличие одного дополнительного пятна с Rf от 0,62 до 0,68, которое по размеру и интенсивности окраски не должно превышать пятно СО АФМК (не более 0,35% в салифене). Результаты анализа считаются достоверными, если проявляется зона, соответствующая 0,1% раствору СО АФМК (предел обнаружения не менее 0,1%).
Определение потери в массе при высушивании проводили в соответствии с требованиями ГФ XI, вып. 1, с. 176. Для этого точную навеску салифена (около 0,5 г) помещали в эксикатор над слоем силикагеля и проводили высушивание при комнатной температуре до постоянной массы. Выбор такого температурного режима обусловлен тем, что в процессе сушки при 95 - 100С салифен может частично плавиться, что приводит к искажению результатов определения. Кроме того, для определения влаги в салифене затруднительно использовать также метод титрования реактивом К. Фишера, поскольку кислота салициловая вступает в химическое взаимодействие с компонентом реактива — йодом. Результаты определения потери в массе при высушивании в образцах салифена 6 серий представлены в таблице 33.
Определение сульфатной золы выполняли в соответствии с требованиями ГФ XI, вып. 2, с. 25. Для анализа брали точную навеску салифена около 0,5 г. Для испытания на примесь тяжелых металлов брали зольный остаток и далее проводили определение в соответствии с ГФ XI, вып. 1, с. 165. Результаты приведены в таблице 34.
Представленные результаты свидетельствуют о том, что содержание сульфатной золы в испытуемых образцах субстанции 6 серий не превышает 0,1%, а содержание тяжелых металлов находится на уровне, меньшем 0,001%.
Субстанция салифена выдерживает требования, указанные в общей статье ГФ XI «Методы микробиологического контроля лекарственных средств» и изменении №3 (категория 1.2.Б). Согласно нормативам, в 1 г субстанции салифена допускается наличие не более 10 общего числа аэробных бактерий, 10" дрожжевых и плесневых грибов. Не допускается наличие бактерий Escherichia coli. Результаты представлены в таблице 35.
Вид испытания Требования Результаты анализов серий салифена 02 03 04 05 06 Количество аэробных бактерий, КОЕ/г Не более 1000 130 210 90 170 340 150 Количество дрожжевых и плесневых грибов (суммарно), КОЕ/г Не более 100 0 менее 10 0 0 менее 10 0 Escherichia coli Должны отсутствовать ОтсутсТВ. ОтсутсТВ. ОтсутсТВ. ОтсутсТВ. ОтсутсТВ. ОтсутсТВ. 5.8. Количественное определение субстанции салифен Количественное определение салифена проводили методом потенциометрического алкалиметрического титрования в среде вода - ДМСО (1:1) Результаты определения представлены в таблице 36.
Как следует из приведенных данных, содержание АФМК в образцах субстанции салифена варьирует в пределах от 71,23 до 72,74%, а кислоты салициловой - от 27,18 до 28,69%. На основании полученных результатов были установлены следующие критерии качества субстанции салифена по показателю «количественное определение»: содержание АФМК должно составлять от 71,0 до 73,0%, кислоты салициловой - от 27,0 до 29,0%.
Определение сроков годности субстанции салифена проводили в соответствии с требованиями «Временной инструкции по проведению работ с целью определения сроков годности лекарственных средств на основе метода "ускоренного старения" при повышенной температуре И 42-2-82» [23, 50, 85]. Так как первоначально деструкции подвергается АФМК, то посчитали возможным изучить кинетику разложения только АФМК и влияние кислоты салициловой на эти процессы деструкции. Для этого по три серии субстанции салифена, а таюке субстанции АФМК помещали в стеклянные флаконы, плотно укупоривали резиновыми пробками и помещали в термостат при 40 и 60С. Контроль количественного содержания АФМК проводили с помощью ранее разработанной методики алкалиметрического титрования в среде вода-ДМСО (1:1) через равные промежутки времени, эквивалентные 6 месяцам хранения в естественных условиях
![Получение и изучение комплексных соединений ванадила с аминокислотами: глицин, [А]-аланин, [В]-аланин](/i/i/4306/367152.png "Получение и изучение комплексных соединений ванадила с аминокислотами: глицин, [А]-аланин, [В]-аланин Лапочкин Олег Владимирович")