![Получение и изучение комплексных соединений ванадила с аминокислотами: глицин, [А]-аланин, [В]-аланин](/i/b/2614/367152.png "Получение и изучение комплексных соединений ванадила с аминокислотами: глицин, [А]-аланин, [В]-аланин")
Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Общая характеристика соединений ванадия и их биологическая активность
1.1 Общая характеристика соединений ванадия 9
1.1.1 Соединения ванадия(У) 10
1.1.2 Соединения ванадия(ІУ) 12
1.2 Свойства комплексных соединений ванадила, методы их получения и исследования
1.3 Биологическая активность соединений ванадия - 17
1.4 Сахарный диабет и проблемы его лечения ' 21
1.5 Общие представления о противодиабетических средствах 23
1.6 Соединения ванадия, как перспективный класс противодиабетических средств
1.7 Методы изучения влияния биологически активных веществ на углеводный обмен и способы создания экспериментального сахарного диабета
Выводы по 1 главе 35
Глава 2 Объекты и методы исследования - 36
Глава 3 Изучение равновесий в растворах ванадила сульфата с аминокислотами: глицин, а-аланин .
3.1 Изучение равновесия в системе ванадил-глицин 41
3.2 Изучение равновесия в системе ванадил-а-аланин 57
3.3 Изучение равновесия в системе ванадил-Р-аланин 71
Выводы по 3 главе 79
Глава 4 Получение и изучение комплексных соединений ванадила с аминокислотами: глицин, а-аланин, Р-аланин
4.1 Получение комплексных соединений ванадила с аминокислотами 81
4.2 Методики анализа комплексных соединений ванадила с аминокислотами глицин, а-аланин, Р-аланин
4.2.1 Определение состава комплексного соединения ванадила с глицином 93
4.2.2 Определение состава комплексного соединения ванадила с а-аланином 96
4.2.3 Определение состава комплексного соединения ванадила с р-аланином 97
4.3 Исследование комплексных соединений ванадила с аминокислотами методом инфракрасной спектрофотомерии
4.3.1 ИК-спектроскопия комплексного соединения ванадила с глицином 99
4.3.2 ИК-спектроскопия комплексного соединения ванадила с а-аланином 102
4.3.3 ИК-спектроскопия комплексного соединения ванадила с р-аланином 105
Выводы по 4 главе 107
Глава 5 Фармакологическое исследование полученных комплексных соединений ванадила с аминокислотами: глицин, а-аланин, Р-аланин
5.1 Изучение острой токсичности соединений ванадия(ІУ) 109
5.2 Моделирование глюкозной нагрузки пероральным и парентеральным способом введения глюкозы
5.3 Изучение влияния комплексного соединения ванадила с глицином на концентрацию глюкозы в крови у интактных животных и животных с глюкозной нагрузкой
5.4 Изучение влияния соединений ванадия на уровень глюкозы в крови у крыс при аллоксановом диабете
Выводы по 5 главе 124
Общие выводы 125
Список литературы 126
- Свойства комплексных соединений ванадила, методы их получения и исследования
- Изучение равновесия в системе ванадил-а-аланин
- Методики анализа комплексных соединений ванадила с аминокислотами глицин, а-аланин, Р-аланин
- Моделирование глюкозной нагрузки пероральным и парентеральным способом введения глюкозы
Введение к работе
Актуальность темы. Поиск лекарственных средств для лечения больных диабетом является актуальной задачей для фармацевтической химии. По данным Всемирной организации здравоохранения около 170 млн. человек в мире больны сахарным диабетом и с каждым годом их число растёт. Благодаря успехам органического синтеза в настоящее время в медицинскую практику внедрен ряд лекарственных средств для лечения инсулиннезависимого диабета. Что касается инсулинозави-симого диабета, то единственным средством до настоящего времени остаётся инсулин. Однако в последние годы во многих странах учёные обратили внимание на соединения редких и рассеянных элементов [122, 34, 21, 50], так как многие из них оказывают значительный биологический эффект на различные системы организма [49, 51]. Так показано, что хром способствует оптимизации толерантности к глюкозе; селен оказывает антиоксидантное действие; молибден обеспечивает метаболизм пуринов и серы; а кобальт является одной из важнейших частей витамина В12 и т.д. [29,13].
Особый интерес вызывают соединения ванадия, который участвует в процессах формирования костей и зубов, метаболизма жиров, влияет на рост и репродукцию клеток, оказывает противоопухолевое действие [69, 136, 106]. В 80-е годы прошлого столетия было описано инсулиноподобное действие ванадия [73, 112]. В настоящее время установлено, что все соединения ванадия независимо от его степени окисления проявляют указанный эффект [54]. Гипогликемическое действие ванадия объясняется различными механизмами, наиболее важными из которых является ин-гибирование фосфотирозинпротеинфосфатаз, стимулирование активности ферментов гликолиза, ингибирование Na+/K+-ATOa3bi и др. [17], хотя точный механизм ин-сулиноподобного действия ванадия остаётся неизвестным. Для исследования биологической активности ванадия необходима разработка доступных методов получения соединений ванадия, приемлемых для применения. На наш взгляд, наиболее целесообразным является получение его комплексных соединений [99, 20, 27] с такими биолигандами, как аминокислоты [31, 32, 33]. Это связано также и с тем, что ком плексные соединения тяжёлых и редкоземельных металлов с аминокислотами обладают большей проницаемостью через мембраны клеток по сравнению с неорганическими солями этих элементов, но при этом токсичность их снижается. Из соединений ванадия наибольший интерес приставляют соединения ванадия(ІУ), так как по данным литературы они обладают большей активностью. До настоящего времени методики получения реальных комплексных соединений ванадия(ІУ) с аминокислотами не разработаны, поэтому получение и изучение комплексных соединений ва-надия(ІУ) с аминокислотами является актуальной проблемой для фармацевтической науки и практики.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является получение и исследование комплексных соединений ванадия(ІУ) с аминокислотами.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
1. Изучить состав и устойчивость комплексных соединений ванадия с аминокислотами: глицин, а-аланин, Р-аланин в растворах при разных значениях рН среды.
2. Разработать методику препаративного получения комплексных соединений ванадила с аминокислотами: глицин, а-аланин, Р-аланин.
3. Предложить методики определения всех компонентов в комплексных соединениях ванадила с аминокислотами.
4. Установить соотношение компонентов и характер связей в полученных комплексных соединениях ванадила с аминокислотами.
5. Изучить острую токсичность ванадийсодержащих соединений.
6. Изучить гипогликемическую активность ванадийсодержащих соединений.
Научная новизна. Изучены условия комплексообразования ванадила сульфа та с глицином, а-аланином и Р-аланином в растворах. Показано, что комплексообра зование проходит в узких интервалах значений рН среды. Рассчитаны равновесные константы комплексообразования ванадила сульфата с аминокислотами в растворе.
Разработана методика синтеза комплексных соединений ванадия(ІУ) с аминокислотами и впервые препаративно получены комплексные соединения ванадия(ІУ) с аминокислотами: глицин, а-аланин и Р-аланин. Методом ИК-спектрофотометрии показано, что в комплексообразовании участвуют амино- и карбоксильная группы аминокислот.
Изучена острая токсичность и противодиабетическое действие полученных комплексов ванадия(ІУ) с аминокислотами. Показано, что острая токсичность комплексных соединений ванадия(ІУ) с аминокислотами достоверно ниже, чем токсичность ванадила сульфата, причём токсичность комплексных соединений ванадила с глицином или а-аланином в 2-2,5 раза ниже острой токсичности ванадила сульфата в пересчёте на ванадий.
Гипогликемическое действие комплексных соединений ванадила было изучено на модели аллоксанового диабета. Установлено, что гипогликемическое действие соединений ванадия сильнее в случае применения его у животных с аллоксан-индуцированным диабетом, чем в случае применения его у здоровых животных. Уровень глюкозы у животных с аллоксан-индуцированным диабетом после однократного перорального применения соединений ванадия(ІУ) в дозе 0,25ммоль/кг снизился в 3-3,5 раза (нормализованные данные).
Научная новизна исследований защищена патентом РФ «Оксованадиевый комплекс с глицином, проявляющий гипогликемическую активность» (решение о выдаче патента на изобретение от 06 июня 2008 года).
Практическая значимость исследования. Разработаны методики получения комплексных соединений ванадия(ІУ) с аминокислотами. Полученные комплексные соединения ванадия(ІУ) проявляют гипогликемическое действие как у интактных животных, так и на модели аллоксанового диабета. Комплексообразование ванадия(ІУ) приводит к снижению его токсичности. Предложены методики качественного и количественного анализа полученных комплексных соединений ванадила с аминокислотами: глицин, а- и р-аланин.
Внедрение результатов исследования в практику. На основании результатов исследования составлено информационное письмо «Исследование противодиа-бетических свойств комплексных соединений ванадия(ІУ)» и получено заключение проблемной комиссии ГОУ ВПО «Пермская ГФА Росздрава» о принятии получен ных комплексных соединений ванадия(ІУ) с аминокислотами: глицин, а- и р-аланин, - на расширенные фармакологические испытания.
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ПятГФА (номер государственной регистрации 01.2.00101060).
Апробация и публикация результатов исследования. Фрагменты диссертационной работы докладывались и обсуждались на 62-ой и 63-ей научных конференциях «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (г.Пятигорск, ПятГФА, 2007, 2008), на межрегиональной научной конференции «Актуальные проблемы фармации» (г. Владикавказ, СГУ им.- Хетагурова, 2007), на 66-ой открытой научно-практической конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (г. Волгоград, ВолГМУ, 2008).
По теме диссертации опубликовано 7 работ.
Положения выносимые на защиту:
1. Результаты исследования комплексообразования ванадила с аминокислотами: глицин, а-аланин, Р-аланин в растворах.
2. Результаты определения констант устойчивости комплексных соединений ванадила с аминокислотами: глицин, а-аланин, Р-аланин. 3. Способ препаративного получения комплексных соединений ванадила с аминокислотами: глицин, а-аланин, Р-аланин.
4. Методики анализа комплексных соединений ванадила с аминокислотами и результаты определения состава полученных комплексных соединений ванадила с аминокислотами: глицин, а-аланин, р-аланин.
5. Результаты предварительного фармакологического исследования полученных комплексных соединений ванадила с аминокислотами: глицин, а-аланин, р-аланин.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 139 страницах машинописного текста, содержит 11 таблиц, 42 рисунка, состоит из «Введения», «Обзора литературы», «Объектов и методов исследования», 3-х глав собственных исследований, общих выводов, списка литературы, включающего 137 источников, в том числе 78 иностранных.
В первой главе диссертации дана общая характеристика ванадия, его биологическая роль и перспективность применения в качестве противодиабетического средства. Приведены литературные сведения по материалам, методам изучения влияния биологически активных веществ на углеводный обмен и моделирование сахарного диабета у животных.
Вторая глава посвящена описанию объектов и методов исследования, используемых в работе.
Третья глава включает результаты изучения комплексообразования ванадия(ІУ) с аминокислотами: глицин, а- и р-аланин в растворах. Исследования были проведены при различньк рН среды. Показано, что в зависимости от рН среды ванадила сульфат может образовывать комплексные соединения различного состава. Определены константы образования комплексных соединений.
В четвертой главе рассмотрено получение и изучение комплексных соединений ванадила с аминокислотами. Предложены методики качественного и количественного определения компонентов комплексных соединений. Проведена валидаци-онная оценка количественного определения ванадил-ионов и содержания аминокислоты в составе комплексных соединений ванадила с аминокислотами. Проведено количественное определение компонентов в полученных комплексных соединениях и изучение взаимодействия ванадия(ІУ) с аминокислотами методом инфракрасной спектрофотометрии.
В пятой главе описаны результаты предварительных фармакологических исследований полученных комплексных соединений ванадия(ІУ) с аминокислотами: глицин, а- и р-аланин. Приведены сравнительные данные по токсичности ванадила сульфата и комплексных соединений ванадила с аминокислотами. Гипогликемиче-ская активность комплексных соединений ванадия(ІУ) проявляется как у интактных животных, так и животных с аллоксановым диабетом.
Свойства комплексных соединений ванадила, методы их получения и исследования
Комплексные соединения ванадия с органическими лигандами вызывают большой интерес у химиков и фармакологов [132, 108, 61]. С точки зрения химии эти соединения имеют свою специфику, так как состояние ванадия в значительной степени зависит от условий среды и поэтому при получении комплексных соедине-ний эти условия сказываются на составе таких соединений и их структуре [60, 96]. Интерес со стороны фармакологов комплексные соединения ванадия вызывают благодаря тому, что они проявляют высокую специфическую активность.
Наиболее интересны, с нашей точки зрения, соединения ванадия(ІУ), сведения о которых мы представляем в данном разделе. Химию водных растворов V(IV) условно подразделяют на химию кислых растворов (рН 6), нейтральных (рН 6-8) и щелочных растворов (рН 8). Наиболее хорошо изучена химия водных растворов V(IV) в кислой среде, в которых V(IV) существует в виде: \VO(H20)5]2+ и \УО(ОН)(Н2о)4]+. При растворении ванадила сульфата в кислых водных растворах образуется гидратированный катион ванадила: [го(Я20)5]2+, который подвергается депротонизации: [VO(H20\]2+ - -»[V0(0H)(H20\\\pKa = 5,9 После депротонизации ионы ванадила могут димеризоваться, образуя растворимые и нерастворимые полимеры, и окисляться. В щелочных растворах образуются ЭПР-неактивный димер состава [(УО)2(ОН)5] И другие олигомеры и полимеры, а также ЭПР-активный ион состава \VO(OH)3] . Последний образуется при рН 9-10 и быстро переходит в форму димера. Также образуется осадок ванадила гидроксида (ЯРга(ш) = 6,6 -Ю-23). При нейтральной среде концентрация гидратированного VO+2 в виде [ко(я20)5]2+ и \УО(он)(н20\]+ находится в диапазоне 10"6- 10"9 и не зависит от концентрации ванадила сульфата в растворе [93].
Комплексо образование V(IV) с большинством кислород-, азот- и серу-содержащих лигандов приводит к предотвращению образования полимерных преципитатов [74, 77, 128]. Присутствие гидроксильных групп в комплексообразующем веществе оказывает большое влияние на образование комплексов, причем для ванадия характерна преимущественная координация кислородсодержащих веществ [92]. Тартрат-ионы, содержащие две смежные гидроксильные группы, образуют более устойчивые комплексы, чем цитрат-ионы, молекула которых содержит только одну гидроксильную группу. В щелочном растворе атомы водорода гидроксилов замещаются эквивалентными количествами координирующего иона металла. Измерения потенциалов полуволны показывают, что оксалат-ион, не содержащий гидроксильных групп, образует наименее устойчивые комплексы этого типа [133].
В настоящее время получены некоторые комплексные соединения вана-дия(ІУ), обладающие противодиабетическим действием. В качестве лигандов в этих комплексных соединениях выступали производные пиронатов и пиридинонатов [66, 65], пиколинатов, ацетилацетонатов [89], производные дикарбоновых кислот, N,N -этилен-бис-а-амино кислот [118, 121, 124], салицелиденимина и Шиффовых оснований салицилового альдегида [102, 123], серосодержащие лиганды, а также производные бигуанидов.
Как правило получение комплексных соединений ванадия(ІУ) проводят прямым взаимодействием неорганической соли ванадия (ванадила сульфата) с лиган-дом в водной, спиртовой или водно-спиртовой среде [126]. Так в водной среде получено комплексное соединение ванадия(ІУ) с мальтолом. С производными пиколи-новой кислоты реакцию комплексообразования проводят в водной среде под инертным газом, так как образующиеся комплексные соединения легко окисляются. Комплексное соединение ванадия(ІУ) с этиловым эфиром цистеина было получено в среде 0,2 М боратного буфера. С такими серосодержащими лигандами, как пирро-лидин-1Ч-карбодитионатом и N-октилцистеинамидом получено в спиртовой среде. Комплексное соединение ванадия(ГУ) с метформином получено при взаимодействии водного раствора ванадила сульфата и спиртового раствора метформина [126, 125].
В России получены и запатентованы комплексные соединения ванадила с изо-ниазидом и L-яблочной кислотой [35, 36, 37, 38, 39]. Получение этих комплексных соединений проводили в два этапа. Вначале получали ванадила гидроксид, и затем проводили взаимодействие лиганда с ванадила гидроксидом в водной среде.
Комплекс ванадия(ІУ) с изониазидом (Патент РФ 2190618) получают путём взаимодействия калия гидроксида и ванадила сульфата с гидразидом изоникотино-вой кислоты в водной среде в атмосфере аргона. Строение и состав комплексного соединения подтверждены современными химическими и физико-химическими методами. Проверена его гипогликемическая активность, установлено, что данное вещество относится к умеренно токсичным соединениям.
Методика получения комплексного соединения ванадила с яблочной кислотой (Патент РФ 2101287) сводится к взаимодействию гидроксида ванадила, полученного непосредственно перед добавлением его в реакционную смесь, и яблочной кислоты или её натриевой соли. Реакцию ведут в водной- среде; соединение в кристаллическом виде получают после упаривания реакционной смеси. Состав и строение комплекса установлены физическими и физико-химическими методами. Исследование гипогликемической активности полученного комплексного соединения ванадила с яблочной кислотой показывает понижение концентрации глюкозы в крови в 2 раза по сравнению с нелеченными диабетическими крысами. Токсичность комплексного соединения оксованадия(ІУ) с L-яблочной кислотой значительно ниже, чем ванадат-иона. На основе комплексного соединения ванадила с L-яблочной кислотой разработан БАД (Патент РФ 2191018) и фармацевтическая композиция (Патент РФ 2203656).
Приведённые краткие литературные сведения показывают перспективность дальнейших исследований по получению и изучению соединений ванадия. Ванадий концентрируется многими живыми организмами. Он накапливается красным мухомором (Amanita muscaria), из которого выделен ванадиевый комплекс амаванадин. Ванадий необходим для роста и развития черной плесени (Aspergillus niger), зеленой водоросли (Scenedesmus obliqus)."OH присутствует в повышенных количествах в нефти, битуме, асфальте и горючих сланцах, зола которых обогащена ванадием. В нефти и асфальте ванадий встречается в составе порфиринового макроцикла [29,136].
Особенно высокие концентрации ванадия обнаружены в некоторых морских организмах. Среди них выделяются представители оболочечников - асцидии (порядки Phlebobranchia и Aplousbranchia), у которых этот микроэлемент входит в состав зеленых кровяных телец - ванадоцитов, содержащих до 4% ванадия и специфический восстанавливающий агент - тунихром. Ранее полагали, что внутри этих клеток ванадий присутствует в составе белкового комплекса гемованадина (ванадохрома), однако при исследовании методами ЭПР-спектроскопии обнаружены связи ванадия с белком или другими макромолекулами. Ванадий найден в ванадоцитах в составе низкомолекулярного комплекса. Не подтвердилось также предположение о роли гемованадина в транспорте кислорода, а сам гемованадин оказался, по-видимому, артефактом. В ванадоцитах одного вида асцидий (Ascidia aspersa) наблюдается динамическое равновесие между V3+ и V5+, что указывает на возможное участие этого микроэлемента в окислительно-восстановительных процессах [71]. Ванадоциты оболочечников способны в 106-10; раз концентрировать ванадий по сравнению с его содержанием в морской воде с помощью механизмов облегченной диффузии ванадия через плазматическую мембрану и восстановления ванадия внутри клетки до малоподвижной катионной формы [80].
Изучение равновесия в системе ванадил-а-аланин
Равновесие в растворе ванадила сульфата и а-аланина изучали спектрофото-метрическим методом. На первом этапе определили оптимальное значение рН среды. Для этой цели изучали зависимость величины светопоглощения от рН раствора. На рисунке 3.2.1 приведены спектры эквимолярных растворов ванадила и а-аланина при разных значениях рН. Спектры поглощения раствора ванадила(1. рН 3,15) и водных растворов смеси ванадила с а-аланином 1:1 при различных рН(2-8): 2. рН=2,27; 3. рН=2,69; 4. рН=3,52; 5. рН=3,86; 6. рН=3,96; 7. рН=3,98; 8. рН=4,03. Концентрации ванадила сульфата и а-аланина во всех случаях были равны 0,03 М Из рисунка видно, что в области рН от 2 до 4 наблюдается увеличение свето-поглощения по всему участку спектра в области 500-800 нм.. Это может указывать на образование комплексного соединения. Это предположение нами было подтверждено дальнейшим изучением равновесий в растворе одним из физико-химических методов. Наиболее часто используют доступные физико-химические методы, к которым относятся фотометрический, потенциометрический, криоскопический и др.
Нами был использован фотометрический метод. В литературе достаточно много вариантов фотометрического изучения комплексных соединений (метод изо-молярных серий, метод молярных отношений, метод Асмуса, метод Яцимирского, метод Бьеррума и др. [15, 114, 81]). Несмотря на различие в подходах, во всех случаях используется зависимость основной оптической характеристики — величины светопоглощения от состава или от концентрации комплексного соединения: A=f(C) А - величина светопоглощения, С - концентрация комплексного соединения.
Предпосылкой для выбора фотометрического метода изучения явилось то, что при смешивании растворов ванадила сульфата и а-аланина наблюдается усиление интенсивности светопоглощения ванадила при длинах волн 770 и 562 нм. Для изучения состава комплексного соединения мы использовали различные варианты фотометрического метода.
Для определения соотношения металл-лиганд мы использовали наиболее простой фотометрический метод Асмуса [18]. Практически метод Асмуса сводится к измерению оптической плотности растворов с постоянной концентрацией комплек-сообразователя и переменным объёмом раствора лиганда. Методика определения заключалась в следующем. В мерные колбы вносили одинаковые количества ванадила сульфата и различные количества а-аланина.
Для более чёткого выделения полос поглощения нами проведена регистрация дифференциальных спектров поглощения. В качестве раствора сравнения нами был использован раствор ванадила сульфата равной концентрации. Из рисунка видно, что увеличение концентрации а-аланина приводит к сдвигу равновесия в сторону образования комплексного соединения. При этом появляется явно выраженная полоса поглощения с максимумом при 562 нм и наблюдается усиление полосы поглощения с максимумом при 770 нм.
Для данных условий определение состава и константы устойчивости образования нами был использован также метод Бьеррума [18]. Для этого был построен ряд графиков зависимости молярного показателя поглощения от концентрации ли-ганда. При разных концентрациях комплексообразователя эта зависимость показана на рисунке 3.2.5. Рисунок 3.2.5 - Зависимость є при 562 нм от концентрации а-аланина для различных концентраций ванадила
Для полной характеристики этого соединения ванадила был рассчитан молярный показатель поглощения. Способ расчёта был таким же, как и при расчёте молярного показателя поглощения комплексного соединения ванадила с глицином, образующийся в кислой среде. Для этого строили график обратной зависимости молярного коэффициента поглощения при длине волны 770 нм от концентрации а-аланина.
Для изучения комплексообразования ванадила с а-аланином в диапазоне рН от 4 до 8 готовили растворы с высоким соотношением ванадила и глицина 1:30-1:100. При таких условиях гидролиз ванадила не происходит при высоких значениях рН. На рисунке 3.2.9 приведены спектры поглощения растворов ванадила сульфата и а-аланина при разных значениях рН среды.
Из рисунка видно, что с повышением значения рН происходит увеличение интенсивности светопоглощения и сдвиг полосы поглощения в коротковолновую область спектра. Спектр поглощения растворов ванадила с а-аланином при рН выше 4,0 значительно отличается от спектров таких же смесей при рН 2-4. Из этого возможно сделать вывод об образовании комплексного соединения другого состава. По данным литературы [100] такое изменение в спектре характерно при образовании комплексного соединения в отношении 1:2. Подтверждением этому может служить также постоянство значений констант образования. Изучение зависимости величины светопоглощения от рН среды приведённая на рисунке 3.2.10 показывают, что в пределах рН 6,5-8,5 величина светопоглощения не практически изменяется.
Методики анализа комплексных соединений ванадила с аминокислотами глицин, а-аланин, Р-аланин
Особый интерес вызывают соединения ванадия, который участвует в процессах формирования костей и зубов, метаболизма жиров, влияет на рост и репродукцию клеток, оказывает противоопухолевое действие [69, 136, 106]. В 80-е годы прошлого столетия было описано инсулиноподобное действие ванадия [73, 112]. В настоящее время установлено, что все соединения ванадия независимо от его степени окисления проявляют указанный эффект [54]. Гипогликемическое действие ванадия объясняется различными механизмами, наиболее важными из которых является ин-гибирование фосфотирозинпротеинфосфатаз, стимулирование активности ферментов гликолиза, ингибирование Na+/K+-ATOa3bi и др. [17], хотя точный механизм ин-сулиноподобного действия ванадия остаётся неизвестным. Для исследования биологической активности ванадия необходима разработка доступных методов получения соединений ванадия, приемлемых для применения. На наш взгляд, наиболее целесообразным является получение его комплексных соединений [99, 20, 27] с такими биолигандами, как аминокислоты [31, 32, 33]. Это связано также и с тем, что комплексные соединения тяжёлых и редкоземельных металлов с аминокислотами обладают большей проницаемостью через мембраны клеток по сравнению с неорганическими солями этих элементов, но при этом токсичность их снижается. Из соединений ванадия наибольший интерес приставляют соединения ванадия(ІУ), так как по данным литературы они обладают большей активностью. До настоящего времени методики получения реальных комплексных соединений ванадия(ІУ) с аминокислотами не разработаны, поэтому получение и изучение комплексных соединений ва-надия(ІУ) с аминокислотами является актуальной проблемой для фармацевтической науки и практики.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является получение и исследование комплексных соединений ванадия(ІУ) с аминокислотами. Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи: 1. Изучить состав и устойчивость комплексных соединений ванадия с аминокислотами: глицин, а-аланин, Р-аланин в растворах при разных значениях рН среды. 2. Разработать методику препаративного получения комплексных соединений ванадила с аминокислотами: глицин, а-аланин, Р-аланин. 3. Предложить методики определения всех компонентов в комплексных соединениях ванадила с аминокислотами. 4. Установить соотношение компонентов и характер связей в полученных комплексных соединениях ванадила с аминокислотами. 5. Изучить острую токсичность ванадийсодержащих соединений. 6. Изучить гипогликемическую активность ванадийсодержащих соединений. Научная новизна. Изучены условия комплексообразования ванадила сульфа та с глицином, а-аланином и Р-аланином в растворах. Показано, что комплексообра зование проходит в узких интервалах значений рН среды. Рассчитаны равновесные константы комплексообразования ванадила сульфата с аминокислотами в растворе. Разработана методика синтеза комплексных соединений ванадия(ІУ) с аминокисло тами и впервые препаративно получены комплексные соединения ванадия(ІУ) с аминокислотами: глицин, а-аланин и Р-аланин. Методом ИК-спектрофотометрии показано, что в комплексообразовании участвуют амино- и карбоксильная группы аминокислот.
Изучена острая токсичность и противодиабетическое действие полученных комплексов ванадия(ІУ) с аминокислотами. Показано, что острая токсичность комплексных соединений ванадия(ІУ) с аминокислотами достоверно ниже, чем токсичность ванадила сульфата, причём токсичность комплексных соединений ванадила с глицином или а-аланином в 2-2,5 раза ниже острой токсичности ванадила сульфата в пересчёте на ванадий.
Гипогликемическое действие комплексных соединений ванадила было изучено на модели аллоксанового диабета. Установлено, что гипогликемическое действие соединений ванадия сильнее в случае применения его у животных с аллоксан-индуцированным диабетом, чем в случае применения его у здоровых животных. Уровень глюкозы у животных с аллоксан-индуцированным диабетом после однократного перорального применения соединений ванадия(ІУ) в дозе 0,25ммоль/кг снизился в 3-3,5 раза (нормализованные данные).
Научная новизна исследований защищена патентом РФ «Оксованадиевый комплекс с глицином, проявляющий гипогликемическую активность» (решение о выдаче патента на изобретение от 06 июня 2008 года).
Практическая значимость исследования. Разработаны методики получения комплексных соединений ванадия(ІУ) с аминокислотами. Полученные комплексные соединения ванадия(ІУ) проявляют гипогликемическое действие как у интактных животных, так и на модели аллоксанового диабета. Комплексообразование ванадия(ІУ) приводит к снижению его токсичности. Предложены методики качественного и количественного анализа полученных комплексных соединений ванадила с аминокислотами: глицин, а- и р-аланин.
Моделирование глюкозной нагрузки пероральным и парентеральным способом введения глюкозы
Внедрение результатов исследования в практику. На основании результатов исследования составлено информационное письмо «Исследование противодиа-бетических свойств комплексных соединений ванадия(ІУ)» и получено заключение проблемной комиссии ГОУ ВПО «Пермская ГФА Росздрава» о принятии получен ных комплексных соединений ванадия(ІУ) с аминокислотами: глицин, а- и р-аланин, - на расширенные фармакологические испытания.
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ПятГФА (номер государственной регистрации 01.2.00101060).
Апробация и публикация результатов исследования. Фрагменты диссертационной работы докладывались и обсуждались на 62-ой и 63-ей научных конференциях «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (г.Пятигорск, ПятГФА, 2007, 2008), на межрегиональной научной конференции «Актуальные проблемы фармации» (г. Владикавказ, СГУ им.- Хетагурова, 2007), на 66-ой открытой научно-практической конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (г. Волгоград, ВолГМУ, 2008). По теме диссертации опубликовано 7 работ. Положения выносимые на защиту: 1. Результаты исследования комплексообразования ванадила с аминокислотами: глицин, а-аланин, Р-аланин в растворах. 2. Результаты определения констант устойчивости комплексных соединений ванадила с аминокислотами: глицин, а-аланин, Р-аланин. 3. Способ препаративного получения комплексных соединений ванадила с аминокислотами: глицин, а-аланин, Р-аланин. 4. Методики анализа комплексных соединений ванадила с аминокислотами и результаты определения состава полученных комплексных соединений ванадила с аминокислотами: глицин, а-аланин, р-аланин. 5. Результаты предварительного фармакологического исследования полученных комплексных соединений ванадила с аминокислотами: глицин, а-аланин, р-аланин. Объем и структура диссертации. Работа изложена на 139 страницах машинописного текста, содержит 11 таблиц, 42 рисунка, состоит из «Введения», «Обзора литературы», «Объектов и методов исследования», 3-х глав собственных исследований, общих выводов, списка литературы, включающего 137 источников, в том числе 78 иностранных. В первой главе диссертации дана общая характеристика ванадия, его биологическая роль и перспективность применения в качестве противодиабетического средства. Приведены литературные сведения по материалам, методам изучения влияния биологически активных веществ на углеводный обмен и моделирование сахарного диабета у животных. Вторая глава посвящена описанию объектов и методов исследования, используемых в работе. Третья глава включает результаты изучения комплексообразования ванадия(ІУ) с аминокислотами: глицин, а- и р-аланин в растворах. Исследования были проведены при различньк рН среды. Показано, что в зависимости от рН среды ванадила сульфат может образовывать комплексные соединения различного состава. Определены константы образования комплексных соединений.
В четвертой главе рассмотрено получение и изучение комплексных соединений ванадила с аминокислотами. Предложены методики качественного и количественного определения компонентов комплексных соединений. Проведена валидаци-онная оценка количественного определения ванадил-ионов и содержания аминокислоты в составе комплексных соединений ванадила с аминокислотами. Проведено количественное определение компонентов в полученных комплексных соединениях и изучение взаимодействия ванадия(ІУ) с аминокислотами методом инфракрасной спектрофотометрии.
В пятой главе описаны результаты предварительных фармакологических исследований полученных комплексных соединений ванадия(ІУ) с аминокислотами: глицин, а- и р-аланин. Приведены сравнительные данные по токсичности ванадила сульфата и комплексных соединений ванадила с аминокислотами. Гипогликемиче-ская активность комплексных соединений ванадия(ІУ) проявляется как у интактных животных, так и животных с аллоксановым диабетом.
