Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Современное состояние исследований биологически активных соединений амброзии полыннолистной (ambrosia artemisiifolia) к)
1.1.Ботаническая характеристика амброзии полыннолистной. морфофизиологические особенности роста и развития 10
1.2. Химическое исследование рода ambrosia 11
1.2.1. Терпеноиды рода Ambrosia 11
1.2.2. Компоненты эфирного масла 15
1.2.3. Флавоноиды рода Ambrosia 17
1.2.4. Кумарины рода Ambrosia 18
1.2.5. Полиины рода Ambrosia 18
1.2.6. Другие группы природных соединений 19
1.3. Компоненты пыльцы рода ambrosia 20
1.4. Применение растений рода ambrosia в народной и научной медицине 23
Выводы по обзору литературы 27
ГЛАВА 2. Обоснование технологии получения фармакологически активных соединений из амброзии полыннолистной 28
2.1. Обсуждение результатов 1 28
2.1.1. Выбор оптимальных условии сбора сырья и экстракции биологически активных соединений из амброзии иолыинолистной 28
2.1.1.2. Сесквитерисновые лактоны 31
2.1.1.3. Флавоноиды 32
2.1.1.4. Кумарины 33
2.1.1.5. Фенолкарбоновые кислоты 34
2.1.1.6. Фитостерины 35
2.1.1.7. Сапонины 35
2.1.1.8. Качественный состав суммарных извлечений из амброзии полыннолистной по фазам роста 36
2.1.2. Изучение динамики накопления основных биологически активных соединений в амброзии полыннолистной по фазам вегетации 39
2.1.2.1. Количественное содержание сесквитерпеновых лактонов в амброзии полыннолистной по фазам вегетации 39
2.1.2.2. Количественное определение флавоноидов в амброзии полыннолистной по фазам вегетации 41
2.1.2.3. Количественное определение кумаринов в амброзии полыннолистной по фазам вегетации 44
2.2. Экспериментальная часть 47
2.2.1. Методики получение суммарных фармакологически активных субстанций 47
2.2.2. Количественное определение сесквитерпеновых лактонов 49
2.2.3. Количественное определение флавоноидов 50
2.2.4. Количественное определение кумаринов 51
ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ 2 53
ГЛАВА 3. Выделение и идентификация индивидуальных соединений из фармакологически активных фракций амброзии полыннолитстной 54
3.1. Обсуждение результатов 54
3.1.1. Сссквитерненовые лактоны 54
3.1.1.1. Соединения, сопутствующие сесквитерпеновым лактонам 56
3.1.2. Полифснольные соединения 57
3.1.2.1. Фенолкарбоновые кислоты 58
3.1.2.1.1. Выделение индивидуальных фенолокислот 60
3.1.2.2. Кумарины 61
3.1.2.2.1. Выделение индивидуальных кумаринов 63
3.1.2.3. Флавоноиды 67
3.1.2.3.1. Выделение индивидуальных флавопоидов 73
3.1.2.4 Изучение макро- и микроэлементного состава 80
3.1.2.5 Количественное определение флавоноидов в суммарных полифенольных фракциях 81
3.1.2.6 Количественное определение сесквитериеновых лактонов в суммарных фракциях 82
3.1.2.7 Количественное определение кумаринов в суммарных пол ифенольных фракциях из амброзии полыннолистной 83
3.2. Экспериментальная часть 85
3.2.1. Количественное определение флавоноидов в суммарных пол ифенольных фракциях из амброзии полыннолистной 86
3.2.2. Количественное определение сесквитериеновых лактонов в суммарных фракциях из амброзии полыннолистной 86
3.2.3. Количественное определение кумаринов в суммарных полифенольных фракциях из амброзии полыннолистной 86
Выводы по главе 3 87
ГЛАВА 4. Предварительные фармакологические и биохимические исследования фракций из надземной части амброзии полыннолистной 88
4.1.Обсуждение результатов 88
4ЛЛ. Фармаколоі ическое изучение суммарных фракций на основные показатели сердечно-сосудистой системы 88
4.1.1.1. Определение острой токсичности и
раздражающей активности 88
4.1.1.2 Обсуждение результатов 89
41.2. Исследование биологической активности суммарных полифенольных комплексов из амброзии полыннолистной 93
4.1.2.1. Защитное действие суммы полифенольных соединений из амброзии полыннолистной, при остром токсическом поражении печени СС14 94
4.1.2.2. Гиполипидемическое влияние суммы полифенольных соединений из амброзии полыннолистной, на модели гиперлипидемии 98
4.2. Экспериментальная часть 101
4.2.1. Объекты и методы фармакологического изучения суммарных фракций на основные показатели сердечно-сосудистой системы 101
4.2.2. Объекты и методы исследования биологической активности суммарных полифенольных комплексов из амброзии полыннолистной. 102
4.2.2.1. Изучение гепатозащитной активности суммы полифенольных соединений полученных из амброзии полыннолистной 102
4.2.2.2. Изучение гиполипидемического действия суммы полифенольных соединений полученных из амброзии полыннолистной 104
Выводы по главе 4 106
Общие выводы 108
Литература
- Химическое исследование рода ambrosia
- Выбор оптимальных условии сбора сырья и экстракции биологически активных соединений из амброзии иолыинолистной
- Соединения, сопутствующие сесквитерпеновым лактонам
- Фармаколоі ическое изучение суммарных фракций на основные показатели сердечно-сосудистой системы
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время на международном фармацевтическом рынке наблюдается явная тенденция к росту номенклатуры лекарственных препаратов, имеющих растительное происхождение. Ресурсы лекарственных растений не безграничны и поэтому очень важное значение имеет не только их рациональное использование, но и поиск новых источников биологически активных соединений. В связи с этим актуальной становится изучение такой категории растений, которые характеризуются широким набором биологически активных веществ, но не используются в практических целях по разным причинам. Одним из интересных и перспективных сырьевых источников является амброзия нолыннолистная - Ambrosia artemisiifolia.
Использование данного растения в качестве источника биологически активных соединений позволяет одновременно решить важнейшую социальную и экологическую задачу по целенаправленному уничтожению карантинного растения до фазы цветения, что также является актуальной проблемой.
Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является разработка оптимальных способов получения суммарных фракций и индивидуальных соединений из Ambrosia artemisiifolia и изучение их биологических свойств.
Для реализации поставленной цели мы сочли целесообразным решение следующих задач:
изучить химический состав растения по фазам вегетации с целью выявления оптимальных сроков заготовки сырья;
разработать технологию получения суммарных фракций из Ambrosia artemisiifolia;
изучить химический состав суммарных фракций с целью обоснования их биологической активности;
получить индивидуальные соединения из Ambrosia artemisiifolia;
провести фармакологический скрининг полученных фракций с целью дальнейших рекомендаций по использованию Ambrosia artemisiifolia;
изучить гепатопротекторную и гиполипидемическую активность суммы полифенольных соединений из Ambrosia artemisiifolia.
Научная новизна.
на основании химических исследований обоснован выбор условий сбора амброзии полыннолистной и препаративного получения биологически активных фракций, содержащих сесквитерпеновые лактоны, флавоноиды, кумарины и оксикоричные кислоты;
изучен химический состав фракций, полученных путем избирательной экстракции исходного сырья;
впервые охарактеризованы оксикоричные кислоты - феруловая, изоферуловая кислота; кумарины - скополетин, скополин, эскулетин, эскулин, умбеллиферон, скиммин; флавоноиды - яцеидин, изорамнетина-3-рутинозид, кверцимеритрин, ксантомикрол, 4',5-дигидрокси-3,6,7,8-тетраметоксифлавон и их гликозиды;
определено содержание сесквитерпеновых лактонов, кумаринов, флавоноидов в полученных фракциях;
проведен фармакологический скрининг всех суммарных фракций, полученных из растения на разных стадиях вегетации;
выявлено гепатозащитное действие фенольных соединений, сопоставимое с активностью карсила;
показано, что по гиполипидемической активности сумма флавоноидов, кумаринов, фенолкарбоновых кислот не уступает по эффективности действия референтному препарату липанору;
в качестве источника биологически активных соединений целесообразно использовать сырьё, собранное до фазы цветения, что позволяет одновременно решить важнейшую социальную и
8 экологическую задачу по целенаправленному уничтожению карантинного растения.
Практическая значимость работы и внедрение результатов в практику.
Изучение биологической и фармакологической активности суммарных фракций, полученных из амброзии полыннолистной в фазу роста и бутонизации, позволило рекомендовать наиболее активные фракции для углубленных исследований:
суммарные фракции, содержащие сесквитерпеновые лактоны, переданы на кафедру фармакологии ПятГФА для углубленного экспериментального исследования на системную и регионарную гемодинамику как с использованием фармакологических анализаторов (ГАМК, ацетилхолин, дофамин и др.), так и при патологии сердечнососудистой системы у крыс (модель инсульта и модель инфаркта миокарда);
на кафедре биохимии с курсом микробиологии ПятГФА продолжаются исследования гепатозащитного действия суммы полифенольных соединений, по биохимическим показателям превосходящей известный гепатопротектор «Карсил»;
на этой же кафедре продолжается изучение гиполипидемической активности суммы полифенольных соединений, не уступающей по своей эффективности действию эталонного препарата «Липанор».
Материалы исследований нашли отражение в публикациях и включены в лекционный курс кафедры фармакогнозии ПятГФА. Положения, выдвигаемые на защиту;
- обоснование использования амброзии полыннолистной в фазу роста и
бутонизации в качестве источника для получения фармакологически
активных соединений;
9 - результаты предварительного фармакологического и биохимического изучения влияния полученных субстанций на основные показатели сердечно-сосудистой и гепато-билиарной систем.
Связь задач исследования с проблемами фармацевтических наук
Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР ПятГФА, № гос. регистрации (01.20.0013409) и соответствует проблеме «Фармация» Ученого совета Минздрава РФ, секция № 38.
Апробация работы и публикации. Основные фрагменты диссертационной работы изложены на 58-й и 59-й региональных конференциях по фармации, фармакологии и подготовке кадров (Пятигорск 2003, 2004).
По теме диссертации опубликовано 4 научных работы (из них 1 статья в центральной печати).
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 130 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы и 3 глав собственных исследований, общих выводов, списка литературы, включающего 184 источника, в том числе 126 иностранных; содержит 20 таблиц, 17 рисунков и приложение.
Химическое исследование рода ambrosia
Надземные органы амброзии полыннолистной содержат 14 свободных и 21 связанные аминокислоты, включая 7 незаменимых. Фенилаланин, метионин и пролин доминируют в обеих фракциях [12].
Установлено, что в амброзии полыннолистной и голометельчатой (Ambrosia psilostachya DC.) содержатся хлорогеновая, изохлорогеновая кислоты, а также глюкозид кофейной кислоты [37].
В семенах амброзии полыннолистной содержится 18,3% жирного масла, пригодного для пищевых целей [48], а также алкалоид агматин [73]. Из листьев части A. confertiflora выделены циклический спирт криптомеридиол и фитостерины - стигмастерол и (3-ситостерол [86].
Листья A. maritima содержат высшие парафины, а и (З-амирины, стигмастерол и (5-ситостерол. Омыляемая часть представлена смесью высших жирных кислот. Из моносахаридов описаны фруктоза и галактоза [66]. В А. cumanensis обнаружены также кониферальдегид и сирингальдегид [150].
Амброзия полыннолистная как и другие виды данного рода в период цветения способствуют обострению так называемой "осенней сенной лихорадки" [33]. Причиной тому является пыльца, характеризующаяся сильными аллергеными свойствами.
Впервые о химическом составе пыльцы амброзии опубликовано в 1917 г. [1].Откуда следует, что свежая пыльца содержит 5,3% воды и 94,7% сухого остатка, в котором белков 24,4%, целлюлозы 12,2%, пентозанов 7,3%, декстринов 2,1%, золы 5,4%, фосфора 0,37% и веществ, растворимых в спирте -42,9%.
Позже было показано, что пыльца амброзии полыннолистной содержит а и Р-амирины, сс-амирина ацетат, -ситостерол и кампестерол. Водорастворимая фракция содержит амброзиевую и лимонную кислоты, фруктозу и аминокислоты [134]. Общее содержание аминокислот в пыльце составляет 5671 мг%, из которых на долю гистидина приходится примерно половина [144]. Из пыльцы выделены новые стеролы 4а, 14-диметил-9,19-циклохолестан-3{\, 24 -диол и 4а, 14-диметил-9,19-циклохолестан-3[5, 24?=, 25-триол наряду с лофеноном, лофенолом и холест-7ен-3(}-олом [135].
Пыльца другого карантинного вида амброзии трёхраздельной, произрастающей в нашей стране, содержит терпены, алканы, алкены, различные спирты и кислоты, ароматические углеводороды и другие классы соединений [64].
Поллиноз относится к классическому аллергическому заболеванию, протекающему по первому типу аллергической реакции и характеризуется повышенной продукцией ішмуноглобулинов класса "Е" - атония. Попадание аллергенной пыльцы в организм больного поллинозом способствует выработке иммуноглобулинов класса "Е". Последние, соединяясь с аллергеном, активируют ферменты мастоцита и базофила, что приводит к избыточной выработке эндогенных веществ - гистамина, простагландинов, лейкотриенов, фактора активации тромбоцитов, брадикинина и др. Наиболее важная роль отводится гистамину. В формировании воспаления принимают участие: Т — лимфоциты, эозинофилы, базофилы, тучные клетки и другие клетки крови. Аллергическое воспаление в свою очередь вызывает ряд патофизиологических нарушений в организме: расширение капилляров, замедление кровотока, повышение проницаемости эндотелия стенок сосудов, транссудацию плазмы крови. Повышается секреция слизи, угнетается функция мерцательного эпителия, отмечается снижение артериального давления. Иногда повышается давление в спинномозговой жидкости, на коже появляется крапивница, возникает спазм гладкой мускулатуры бронхов и др.
Наиболее выраженной аллергенной активностью среди сложноцветных обладает пыльца полыни и амброзии. Аллерген пыльцы полыни имеет сходные антигены с пыльцой амброзии и способен вызывать перекрестные реакции. Из 23 компонентов пыльцевого экстракта полыни, выделенных с помощью SDS-PAGE, 15 фракций участвуют в связывании с lgE-антителами сывороток больных с ги перчу вствителыюстью к пыльце этого растения. Молекулярные массы lgE-связывающих фракций составляют 12-80 кД, однако лишь фракция с молекулярной массой 22 кД обладает наибольшей способностью специфического связывания lgE-антител.
Для специфической диагностики аллергических заболеваний и лечения больных производится значительное количество аллергенных препаратов.
Заметим, что аллергенные экстракты одних и тех же веществ, приготовленных на разных предприятиях, обладают различной активностью. Это происходит из-за несоблюдения условий технологии производства и качества исходных продуктов. Для облегчения стандартизации из аллергенных экстрактов выделяются и очищаются отдельные компоненты. Для амброзии — это прежде всего: Amb I (Е), Arnb II (К), Amb a I, Amb а II, РаЗ, Ра4, Ра5, АаВА, Amb Vn др. [1].
Антигены Amb I и Amb II представляют собой белки с относительной молекулярной массой 38 кД и составляют соответственно 6 и 3% от общего количества белка пыльцы амброзии. В составе этих фракций 17,1% (Amb I) и 16,6% (Amb II) азота и по 0,5% углеводов. Изоэлектрическая точка антигена Amb I рН 5,0 и антигена Amb II рН 5,9.
Выделение очищенных аллергенов проводится в настоящее время с применением разнообразных методов. Для анализа и стандартизации чистых аллергенов используют радиоаллергосорбентный тест, иммуноэлектрофорез, перекрестный иммуноэлектрофорез, метод высвобождения гистамина из лейкоцитов сенсибилизированных больных.
Выбор оптимальных условии сбора сырья и экстракции биологически активных соединений из амброзии иолыинолистной
Одним из методов обнаружения сесквитерпеновых лактонов в извлечениях является гидроксамовая проба. Она основана на том, что соединения, содержащие лактонное кольцо или сложноэфирную группировку, реагируют с гидроксиламином в щелочной среде и превращаются в гидроксамовые кислоты, которые с солями железа (III) образуют окрашенные в фиолетовый цвет комплексы [20,54].
Хроматографический анализ полученных фракций проводили методом ТСХ в системах растворителей: 1) бензол-этанол 9:1; 2) бензол-бутанол 9:1; 3) петролейный эфир-хлороформ-этилацетат 2:2:1; 4) гексан-этилацетат 85:5; 5) хлороформ-этанол 7:3. Хроматограммы после высушивания, опрыскивали 1% КМп04 в 1% растворе серной кислоты, а так же концентрированной кислотой серной при нагревании.
Общеизвестно, что при анализе суммарных фракций, содержащих сесквитерпеновые лактоны, ИК - спектр дает характерное поглощение для у-лактонов, обусловленное карбонильной группой пятичленного лактонного кольца в области 1740 - 1800 см"1. Известно, что в области 1740 - 1750 см"1 проявляется полоса поглощения карбонила 6-лактона кумаринов, сложных эфиров и др. 11о для них характерно еще наличие двух полос в анализируемой области: 1680 - 1750 (карбонил) и 1600 - 1620 см"1 (ароматическая С=С связь). Отсутствие второй полосы в области 1600 - 1620 см"1 исключает наличие ароматического фрагмента в структуре и может указывать на возможное присутствие у-лактонов. Полоса поглощения в области 1760 - 1800 см"1 при одновременном присутствии второй полосы в области 1610 - 1620 см"1 свидетельствует о наличии у-лактонов в которых имеются сопряженные двойные связи (а-метилен-у-лактонный цикл) [50,151].
Данные о содержании сесквитерпеновых лактонов в суммарных фракциях из амброзии полыннолистной но фазам вегетации представлены в таблице 4. О наличии флавоноидов в полученных фракциях можно судить по результатам следующих качественных реакций: - цианидиновая проба (проба Chinoda) - флавонолы, флаваноны и флавоны дают красное или оранжево-красное окрашивание [20,54]; - с 10%-ным раствором натрия гидроксида возникает желтое окрашивание [20,54]; - с 2%-ным раствором алюминия хлорида наблюдается ярко желтое окрашивание [20,54]; - с 1 % водным раствором железа (III) хлорида в присутствии флавоноидов развивается буро-зеленое окрашивание [20,54];
Из числа анализируемых образцов положительные результаты наблюдаются для фракций 5Ц, 5Б, 5Р, 1 Щ, 11Б, 1 IP и слабо выражены для 6Ц, 6Б, 6Р, 10Ц, 10Б, ЮР.
Хроматографическое исследование полученных извлечений проводили в тонком слое сорбента (ТСХ) и на бумаге (БХ) с применением следующих систем растворителей: водные растворы кислоты уксусной с концентрацией 5%, 15%, 30%, 60%; н-бутанол-кислота уксусная-вода БУВ (4:1:1), БУВ (4:1:5); кислота уксусная-конц. кислота хлористоводородная-вода (30:3:10), и (5:1:5) (система Форесталя); бензол-пиридин-вода (100:1:100); хлороформ-этанол-вода (8:2:1); хлороформ-этанол-кислота муравьиная (31:2:0,15); бензол-ацетон (4:1); бензол-этилацетат (2:1); этанол-кислота уксусная-вода (18:1:1); бутанол-2-этилацетат-диметилформамид-вода (10:6:3:2).
При анализе агликонов бумагу дополнительно импрегнировали 20% раствором формамида в этаноле. Использовали одномерную (восходящий и нисходящий методы) и двумерную бумажную хроматографию (н-бутанол-кислота уксусная-вода БУВ (4:1:5) 1-ое направление и 30 % кислоту уксусную П-ое направление).
Хроматограммы просматривали в видимом и УФ-свете с последующей обработкой парами аммиака (25 % водный раствор), 10 % спиртовым раствором калия гидроксида, 2 % раствором натрия боргидрида с концентрированной кислотой хлороводородной, 5 % спиртовым раствором алюминия хлорида [30].
Содержание флавоноидов в суммарных фракциях по фазам роста из амброзии полыннолистной представлено в таблице 4.
Для обнаружения кумаринов используют их свойство подвергаться гидролизу в щелочной среде с разрывом лактонного кольца и образованием окрашенного в желтый цвет раствора. Раскрытие лактонного кольца позволяет далее продукт реакции вводить в азосочетание с солями диазония. Здесь не обязательно, чтобы исходные кумарины содержали фенольные гидроксигрупиы [20,47].
Реакция азосочетания имеет важное значение, поскольку позволяет достоверно отличить кумарины от хромонов: при наличии кумаринов образуется азокраситель, окрашенный от оранжевого до красного цвета, а азосоединения с хромонами имеют светло желтую окраску или вовсе не обнаруживаются [20,47].
Хроматографический анализ проводили в тонком слое в системах растворителей: 1) бензол-этанол (8:2); 2) петролейный эфир-хлороформ-этилацетат (2:2:1); 3) хлороформ-этанол-кислота муравьиная (31:2:0,15); 4) бензол-этилацетат (2:1); 5) толуол-этилацетат-кислота уксусная (5:4:1). Хроматограммы после высушивания рассматривали в УФ-свете до и после обработки парами аммиака (25 % водный раствор) и 10 % спиртовым раствором калия гидроксида. При наличии кумаринов - наблюдается углубление или изменение цвета флюоресценции. При последующем опрыскивании хроматограмм свежеприготовленным диазореактивом, наблюдаются яркие пятна от кирпично-красного до желто-оранжевого цвета [20,54].
ИК - спектр полученных фракций при наличии кумаринов дает характерное поглощение в области 1750 - 1700 см"1, обусловленное карбонильной группой и сильные полосы поглощения в области 1620 - 1470 см"1, обусловленные колебаниями ароматических связей [20,35,54].
Содержание кумаринов в суммарных фракциях из амброзии полыннолистной по фазам роста приведено в таблице 4. При изучении полученных фракций на наличие фенолкарбоновых кислот методами тонкослойной (ТСХ) и бумажной (БХ) хроматографии применяли следующие системы растворителей: 2,5%, 15% кислота уксусная; н-бутанол-кислота уксусная-вода БУВ (4:1:1), БУВ (4:1:5); хлороформ-этанол-вода (8:2:0,1); хлороформ-этанол-кислота муравьиная (30:2:0,15); бензол-этанол (8:2); этилацетат-иетролейный эфир (3:1). Для двумерной хроматографии использовали системы растворителей бензол-кислота уксусная-вода (6:7:3) (1-ое направление) и натрия формиат-кислота муравьиная-вода (П-ое направление).
Хроматограммы рассматривали в видимом и УФ-свете с последующей обработкой хромогенными реактивами: свежеприготовленными диазосоединениями в растворе натрия карбоната; реактивом Геифнера; реактивом Миллона; 2 % спиртовым раствором железа (III) хлорида; 0,5 н. спиртовым раствором калия гидроксида [7,20].
Соединения, сопутствующие сесквитерпеновым лактонам
В обзоре литературы (раздел 1.2.1., таблица 1) показано, что из надземной части амброзии полыннолистной выделено более 20 сесквитерпеновых лактонов. В связи с тем, что при фармакологическом скрининге нами получены данные по активности отдельных фракций, мы поставили перед собой задачу исследования лактонов, содержащихся в гексановом и хлороформном извлечениях, полученных согласно схеме на рисунке 5.
С этой целью сырье, собранное в период бутонизации обрабатывали трижды горячей водой в соотношении 1:5. Из водного извлечения лактоны последовательно экстрагировали вначале гексаном, затем хлороформом. Гексан и хлороформ удаляли полностью под вакуумом, и получали остатки в виде густых смолок, которые далее переносили на колонку с сорбентом: - с силикагелем марки Л 100/250 мк. Колонку последовательно промывали хлороформом, хлороформом с этилацетатом (9:1, 7:3, 1:1, 3:7, 1:9) — соединение Л2 (Rf I. 0,23; II. 0,18; III. 0,31; V. 0,76), этилацетатом, смесью этилацетат-этанол (9:1, 7:3, 1:1, 3:7, 1:9) - соединение Л1 (Rf I. 0,18; II. 0,14; III. 0,21; V. 0,89), этанолом. - с алюминия оксидом IV степени активности. Колонку элюировали петролейным эфиром, петролейным эфиром с бензолом (9:1, 7:3, 1:1, 3:7, 1:9) соединение СТ1, бензолом, бензолом с хлороформом (9:1, 7:3, 1:1, 3:7, 1:9) соединение Л2, хлороформом, хлороформом с этанолом (9:1, 7:3, 1:1, 3:7, 1:9) соединение Л1, этанолом - соединения Kl, К2.
Для контроля использовали хроматографию в тонком слое сорбента в различных системах растворителей: I) бензол-этанол 9:1; II) бензол-бутанол 9:1; III) петролейный эфир-хлороформ-этилацетат 2:2:1; IV) гексан-этилацетат 85:5; V) хлороформ-этанол 7:3. Хроматограммы после высушивания опрыскивали 1% КМпОд в 1% растворе кислоты серной, а также концентрированной кислотой серной при нагревании.
Таким путем нами получены следующие индивидуальные соединения. Соединение Л1. - состава С15Н22О4, представляет собой белые кристаллы с т. пл. 115-117С (из этилацетата), нерастворимые в воде, растворимые в хлороформе и этаноле. Хроматографически в системах I, II, III, V вещество по значению Rf совпадает с достоверным образцом куманина. Проба смешения не дает депрессии температуры плавления. В ИК-спектре наблюдаются характерные интенсивные полосы поглощения 3500-3300 см"1 (гидроксильные группы), 1745 см 1 (карбонильная группа у-лактона) для сесквитерпеновых лактонов. На основании проведенных исследований и отсутствия депрессии т. пл. в пробе смешения с достоверным образцом соединение Л1 идентифицировано как куманин [50].
Соединение Л2 - состава С15Н20О4, белые кристаллы с т. пл. 168-170С (из смеси этанол-эфир), нерастворимые в воде, растворимые в хлороформе и этаноле.
При анализе методом ТСХ в системах I, II, III, V вещество по значению Rf совпадает с достоверным образцом перувина. Проба смешения не дает депрессии температуры плавления.
В ИК-спектре наблюдаются характерные интенсивные полосы поглощения 3450 см"1 (гидроксильные группы), 1720, 1750 см"1 (карбонильная группа у-лактона) для сесквитерпеновых лактонов.
На основании проведенных исследований и отсутствия депрессии т. пл. в пробе смешения с достоверным образцом соединение Л2 идентифицировано как перувин [50].
По данным ТСХ анализа в анализируемых фракциях, кроме того обнаружены следы псилостахиина С (Rf I. 0.42; III. 0.58; IV. 0,76) и коронопилина (Rf I. 0.29; II. 0.26; III. 0.38;V. 0,74).
Таким образом, преобладающими компонентами среди сесквитерпеновых лактонов амброзии полыннолистной в период бутонизации являются куманин и перувин, остальные вещества - минорные.
При элюировании сесквитерпеновых лактонов (раздел 3.1.1.) петролейным эфиром и петролейным эфиром с бензолом выделено вещество СТ1 состава С29Н50О, представляющее собой белые игольчатые кристаллы с температурой пл. 138-139С (из ацетона).
Хроматографически в тонком слое на силикагеле Rf 0,91 (система бензол-этанол 9:1) и Rf 0,87 (петролейный эфир-хлороформ-этилацетат 2:2:1) вещество идентифицировано как р - ситостерин. При элюировании колонки смесью хлороформа с этанолом и этанолом выделены соединения К1, К2, которые являются кумаринами и описаны в разделе 3.1.2.2.
Фармаколоі ическое изучение суммарных фракций на основные показатели сердечно-сосудистой системы
Имеется обширная информация о защитном действии флавоноидов, кумаринов, фенолкарбоновых кислот и сесквитерпеновых лактонов при различных поражениях печени, в патогенезе которых определяющим фактором является усиление процессов перекиспого окисления лшшдов (ПОЛ) биомембран [2,3,4,5,18].
В качестве исследуемых соединений отобраны суммарные полифенольные фракции I, II, III, IV, полученные из амброзии полыннолистной в период бутонизации (раздел 3.1.2., рисунок 6). Химический состав этих фракций представлен в основном фенолокислотами - феруловой, изоферуловой, хлорогеновой, кофейной и глюкозидом кофейной кислоты; кумаринами - скоиолином, скополетином, эскулином, эскулетином, умбеллифероном, скиммином; флавоноидами кверцетином, изорамнетином и их гликозидами, полиметоксилированнымн флавонами и флавонолами - яцеидином (5,7,4 -тригидрокси-3,6,3 триметоксифлавон), 4 ,5-дигидрокси-3,6,7,8-тетраметоксифлавоном и ксантомикролом (4 ,5-дигидрокси-6,7,8-триметоксифлавон).
Эффективность гепатозащитного действия оценивали но нормализации функциональных и биохимических показателей состояния печени, которые являются наиболее информативными тестами, доказывающими эффективность, испытываемых в качестве геиатопротекторов соединений: активности аланинамшютрансферазы (АлАт), щелочной фосфатазы (ЩФ) и общего билирубина в сыворотке крови, содержанию белка, нуклеиновых кислот (ПК), триглицеридов (ТРГ) и ТБК-активных продуктов в гомогенате печени [15,16].
Как показано на рисунке 13, острый ССЦ-гепатоз у нелеченных крыс характеризуется выраженной симптоматикой тяжелой интоксикации со значительным нарушением функционального состояния печени. В гомогенатах печени нелеченных крыс в 3,3 раза возрастало содержание триглицеридов и в 1,7 раза усиливалось накопление ТБК-активных продуктов, что является свидетельством интенсификации ПОЛ биомембран. Повреждение мембран гепатоцитов продуктами ПОЛ приводит к выходу из печени ферментов щелочной фосфатазы и аланинаминотрансферазы, активность которых в крови увеличивалась в 2,5 и 2,6 раза соответственно. Повышение активности ЩФ свидетельствует о развитии холестаза, что подтверждается увеличением в крови общего билирубина в 2,5 раза. Кроме этого, СС14-гепатоз сопровождался резким падением белково-синтетической функции печени, что проявилось в снижении количества общего белка в 0,7 раза и нуклеиновых кислот в 0,7 раза в печени.
Лечебно-профилактическое введение суммарных полифенол ьных фракций в дозах 200 мг/кг по исследованным биохимическим показателям оказало защитное действие в условиях интоксикации тетрахлорметаном. Самыми активными оказались фракции III (этилацетатное извлечение) и IV (бутанольное извлечение), под влиянием которых происходит нормализация всех изученных биохимических показателей сыворотки крови: активности АлАт (показатель цитолиза) и ЩФ (показатель холестаза) понизились соответственно на 57, 51 % и 67, 38% (Рк 0,001), содержание общего билирубина снизилось на 48 и 34% (Рн 0,001, Рк 0,05). При этом в гомогенате печени наблюдалось снижение на 12 % (Рк 0,05) и 38,6 % (Рк 0,001) соответственно содержания ТБК-активных продуктов. Содержание ТРГ снизилось на 47 % (Рк 0,001) и 30 % (Рк 0,05) по сравнению с контролем, а также наблюдалось увеличение содержания белка и нуклеиновых кислот на 32 % (Рк 0,05), 23 % (Рк 0,05) и 61, 43 % (Рк 0,001) соответственно (рисунок 14,15). ТРГ Белок НК ТБК-активные продукты 100 %- контроль (CCIj-гепатоз) -достоверно к контролю интактные «Фракция I DФракция II пФракция 111 Фракция IV иКарсил ТРГ-триглицериды, НК-ну клеи новые кислоты
Влияние суммарных полифенольпых фракций амброіии мо.іьіннолнстной на некоторые биохимические покяіа іели печени мри отром "(. Ц-гепатоіе
Необходимо отметить, что гепатозащитное действие суммы полифенолов в дозе 200 мг/кг достоверно не отличалось от такового карсила по следующим показателям: содержанию ТБК-активных продуктов, триглицеридов, белка и нуклеиновых кислот в печени.
По ряду других показателей фракции III и IV превышали эффективность действия карсила, а именно: по степени изменения активности АлАт и ЩФ, которая уменьшилась при введении карсила на 31 % (Рк 0,001) и 47 % (Рк 0,005) соответственно. Содержанию билирубина в сыворотке крови, который под действием карсила практически не нормализовался 4 % (Рк 0,1).
При этом нужно отметить, что под влиянием данных фракций наблюдается полная нормализация таких показателей как АлАт, ЩФ, общего билирубина, ТБК-активных продуктов, белка и нуклеиновых кислот в печени, т.к. они достоверно не отличалось от уровня интактных животных (Ри 0,1).
![Химическое исследование травы кориандра посевного (Coriandrum sativum) с целью получения фармакологически активных веществ [Электронный ресурс]](/i/i/4256/193791.png "Химическое исследование травы кориандра посевного (Coriandrum sativum) с целью получения фармакологически активных веществ [Электронный ресурс] Нерсесян Захар Мкртычевич")
