Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Современные направления фармацевтической науки в области исследования магнитоуправляемых и липосомальных лекарственных форм 10
1.1 Магнитные материалы в фармации 10
1.1.1 Химическая структура магнетита 10
1.1.2 Анализ магнетита 11
1.1.3 Основные магнитные свойства ферримагнетиков 13
1.1.4 Методы измерения магнитных характеристик ферримагнетиков 15
1.1.5 Использование магнетита в медицине и фармации 19
1.2 Липосомальные формы лекарственных веществ 23
1.2.1 Проблемы производства фосфолипидов 24
1.2.2 Особенности получения и оценки качества липосомальных препаратов 27
1.2.3 Применение липосомальных форм лекарственных веществ 30
1.3 Методы анализа преднизолона 35
Выводы к главе 1 37
Экспериментальная часть
Объекты, реактивы и методы исследований 40
ГЛАВА 2 Изучение магнитных свойств магнетита 43
2.1 Прибор для измерения магнитных свойств магнетита 44
2.2 Кривая намагничивания магнетита 48
2.3 Основные магнитные характеристики магнетита 50
Выводы к главе 2 53
Глава 3 Выделение и стандартизация сырья, используемого для конструирования липосом 54
3.1 Получение фосфолипидов из головного мозга свиней 54
3.2 Изучение физико-химических показателей фосфолипидных дисперсий, полученных из головного мозга свиней 58
3.2.1 Разработка ТСХ анализа полученной фосфолипидной смеси 58
3.2.2 Определение индекса окисленности полученной фосфолипидной смеси ' 61
3.2.3 Определение общего и видового содержания фосфолипидов в полученной фосфолипидной смеси 62
Выводы к главе 3 69
ГЛАВА 4 Получение липосомальных препаратов 70
4.1 Выбор метода приготовления липосом 70
4.2 Разработка способа получения липосомальных препаратов 73
4.2.1 Получение магнитоуправляемых липосом 73
4.2.2 Получение липосом с преднизолоном 75
4.2.3 Получение магнитоуправляемых липосом с преднизолоном 76
4.3 Определение размера липосом 78
4.4 Очистка липосом от невключившегося материала 80
4.5 Стабилизация липосом 81
Выводы к главе 4 84
ГЛАВА 5 Стандартизация полученных липосомальных препаратов 85
5.1 Определение индекса окисленности полученных липосомальных препаратов 85
5.2 Описание и определение рН 87
5.3 Испытания на подлинность 87
5.3.1 Испытания на подлинность по магнитному наполнителю 87
5.3.2 Испытания на подлинность по преднизолону 89
5.4 Количественный анализ преднизолона и магнетита в липосомах 89
5.4.1 Количественное определение преднизолона в липосомах и магнитоуправляемых липосомах 89
5.4.2 Количественное определение магнетита в магнитоуправляемых липосомах и магнитоуправляемых липосомах преднизолона 92
5.4.3 Валидационная оценка методик количественного определения магнетита и преднизолона в липосомальных формах 95
5.5 Изучение магнитных свойств магнитоуправляемых липосом 100
5.6 Микробиологическое исследование липосомальных препаратов 103
5.7 Изучение стабильности липосомальных препаратов 104
Выводы к главе 5 109
ГЛАВА 6 Изучение эффективности применения полученных липосомальных препаратов при экспериментальном аллергическом дерматите 111
6.1 Макро- и микроскопическое изучение состояния эпидермиса кожи морских свинок при экспериментальном аллергическом дерматите 111
6.2 Изучение противовоспалительного действия магнитоуправляемых липосом с преднизолоном, магнитоуправляемых липосом и липосом преднизолона при экспериментальном аллергическом дерматите 114
Выводы к главе 6 123
Общие выводы 124
Литература
- Основные магнитные свойства ферримагнетиков
- Кривая намагничивания магнетита
- Изучение физико-химических показателей фосфолипидных дисперсий, полученных из головного мозга свиней
- Испытания на подлинность по магнитному наполнителю
Введение к работе
Актуальность темы. Создание новых лекарственных средств, сочетающих в себе все достоинства магнитоуправляемых и липосомальных форм лекарственных веществ, позволит повысить эффективность лечения многих патологических состояний организма.
Продолжительный прием глюкокортикостероидных лекарственных препаратов часто осложняется целым рядом побочных эффектов, связанных с их системным действием. В связи с этим актуальным является поиск новых лекарственных форм глюкокортикостероидов, обладающих высокой терапевтической эффективностью при использовании минимальных доз. Наиболее полно этим требованиям отвечает магнитоуправляемая липосомальная форма.
Преимущества липосомальных форм лекарственных веществ общеизвестны, но их применение сопряжено с рядом трудностей, связанных с отсутствием методологических подходов к получению и стандартизации липосомальных лекарственных форм.
Решение проблемы создания магнитных лекарственных средств непосредственно связано с производством и стандартизацией исходных магнитных компонентов.
Из всего арсенала веществ, обладающих магнитными свойствами, исследователи наибольшее предпочтение отдают магнетиту, полномасштабное использование которого в практической медицине и фармации на данном этапе невозможно, так как отсутствует нормативная документация (НД), позволяющая оценить его качество.
В настоящий момент изучены некоторые физико-химические, фармакологические характеристики магнетита, полученного в лабораторных условиях. Для его практического применения в фармации как вспомогательного вещества необходимым условием является стандартизация магнитных свойств этого носителя.
Все вышеперечисленное подтверждает тот факт, что стандартизация магнитных носителей, разработка оптимальной технологии получения, стандартизация фосфолипидов (ФЛ) и магниточувствительной липосомальной формы полусинтетического глюкокортикостероида является актуальной проблемой.
Цель и задачи исследований. Целью настоящего исследования является разработка норм качества магнетита по показателю "магнитные свойства", обоснование состава, получение и стандартизация магнитоуправляемых липосом, изучение возможности включения глюкокортикостероидных препаратов в магнитолипосомы на примере преднизолона и изучение их противовоспалительного действия. Для реализации поставленной цели необходимо решение следующих задач:
предложить методики измерения магнитных свойств магнетита и содержащих его лекарственных форм;
установить нормы качества магнетита по показателю "магнитные свойства";
предложить сырьевой источник, способ получения и стандартизацию ФЛ; -разработать проекты НД на магнитный носитель-магнетит и на ФЛ из головного мозга свиней;
обосновать состав, получить липосомы с магнитным носителем и провести их стандартизацию;
-обосновать состав, предложить способы получения и стандартизацию липосом
и магнитолипосом с глюкокортикостероидным препаратом на примере
преднизолона;
-изучить противовоспалительное действие полученных образцов
липосомальных препаратов.
Научная новизна. Теоретически обоснована и экспериментально подтверждена необходимость стандартизации магнитных носителей, ФЛ и липосом, приготовленных на их основе. Изучены магнитные свойства магнетита с помощью вибрационного магнетометра. Исследован процесс
получения ФЛ из головного мозга свиней, показана идентичность полученных ФЛ и ФЛ из головного мозга крупного рогатого скота. Разработаны научно-методические подходы к обоснованию состава и конструированию новых липосомальных препаратов. Впервые в РФ проведены исследования по включению магнетита в липосомы. Выяснено, что магнетит включается во внутреннюю полость липосом. Обоснован состав и способ получения магнитоуправляемых липосом. Показана возможность совместного включения магнетита во внутреннюю полость липосом и глюкокортикостероидного препарата, на примере преднизолона, в бислойную фосфолипидную мембрану. С учетом этой новации выбран и обоснован состав, способ получения и методы стандартизации липосом и магнитолипосом, содержащих преднизолон. Установлен выраженный противовоспалительный эффект магнитоуправляемых липосом преднизолона, который обусловлен суммарным действием внутриклеточно доставляемого преднизолона, липосомальных ФЛ и воздействием магнитного поля, способных восстанавливать поврежденные мембраны клеток.
Практическая значимость работы. Усовершенствована аппаратурная
схема вибрационного магнетометра. Предложена методика, позволяющая
определять магнитные свойства ферримагнетиков. Установлены нормы
качества магнетита по показателю "магнитные свойства". Усовершенствован
способ получения ФЛ из животного сырья. Предложены методы контроля и
показатели качества ФЛ из тканей головного мозга свиней. Разработаны ТУ на
магнетит и ФЛ, используемые для получения липосом. Предложены способы
получения и методы стандартизации магнитоуправляемых липосом, липосом и
магнитолипосом с преднизолоном. Результаты исследований
противовоспалительной активности образцов магнитоуправляемых липосом с преднизолоном позволяют рекомендовать их для дальнейшего изучения с целью создания эффективного противовоспалительного лекарственного средства.
Внедрение результатов исследований в практику. Разработаны
-ТУ 9154-001-01897080-2004 "Фосфолипиды для получения липосом",
утвержденные Зам. Главного санитарного врача Российской Федерации
(Письмо ФЦ№ 12ФЦ/2514А от 19.08.2004г.)3
-ТУ 9154-01962942-2004 "Магнетит - магнитный носитель",
утвержденные Зам. Главного санитарного врача Российской Федерации от
3.08.2004г.,
- промышленный регламент производства "Липосомальная основа для
получения диагностических, липосомальных и косметических препаратов",
утвержденный Ученым советом Ставропольского научно-исследовательского
противочумного института (протокол № 4 от 20 апреля 2004г.).
- результаты исследований по получению магнитоуправляемых липосом с
преднизолоном, представленные в информационном письме "Разработка
технологии, стандартизация и фармакологическое исследование
магнитоуправляемых липосом с преднизолоном", используются в научно-
исследовательской работе 1-го Военно-Морского Клинического Госпиталя (акт
внедрения от 17 августа 2004г.).
Положения, выносимые на защиту:
результаты исследований по стандартизации магнитных свойств магнетита;
обоснование состава и стандартизация ФЛ;
- результаты исследований по способу включения магнитного носителя в
липосомы;
- данные по стандартизации магнитоуправляемых липосом;
-итоги исследований по иммобилизации и стандартизации
глюкокортикостероидных препаратов на примере преднизолона в липосомы и магнитолипосомы;
- результаты изучения противовоспалительной активности полученных
липосомальных препаратов.
Связь задач исследования с проблемами фармацевтических наук.
Диссертационная работа выполнена согласно плану научно-исследовательских работ ГОУ ВПО Пятигорской государственной фармацевтической академии Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию и ФГУЗ Ставропольского научно-исследовательского противочумного института Роспотребнадзора и соответствует проблеме "Фармация" Ученого совета Минздравсоцразвития РФ, секция № 38 "Фармация".
Апробация работы. Основные фрагменты диссертационной работы изложены на 60-й региональной конференции по фармации, фармакологии и подготовке кадров (Пятигорск, 2005).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста в компьютерной верстке и состоит из введения, обзора литературы (глава 1), экспериментальной части (5 глав), общих выводов и списка литературы, включающего 210 источников, в том числе 54 иностранных, содержит 24 таблицы, 13 рисунков.
Основные магнитные свойства ферримагнетиков
Магнитные свойства ферримагнетиков описываются следующими параметрами.
1. Основная характеристика магнитных материалов - намагниченность (J), которая определяется как магнитный момент единицы объема вещества. Единица намагниченности в СИ - А/м . Зависимость намагниченности (J) от напряженности поля (Н), для ферро- , ферримагнетиков определяется кривой намагничивания с петлей гистерезиса [2].
2. Намагниченность насыщения (JJ (или магнитная индукция насыщения Bs) представляет одну из основных характеристик ферримагнитных материалов, каковым является и магнетит. На практике намагниченность насыщения определяют как зависимость намагниченности от напряженности внешнего магнитного поля. Когда намагниченность перестает изменяться с ростом напряженности поля, это означает, что достигнуто максимально возможное значение намагниченности насыщения [5].
3. Важным параметром является остаточная намагниченность (Jr) (или остаточная магнитная индукция Вг).
Остаточная намагниченность {Jr) - это величина намагниченности, сохраняющаяся в образце, после того как он был намагничен внешним магнитным полем до насыщения, а затем напряженность поля была сведена до нуля. Величина остаточной намагниченности существенно зависит от формы образца, его кристаллической структуры, температуры, механических воздействий (удары, сотрясения и т.п.) [30].
Нормальная остаточная намагниченность - это намагниченность, наблюдающаяся после кратковременного (около 1 с) наложения постоянного поля (например, 10-10000 Э). Исследования магнитного гистерезиса магнетита показывают, что нормальная остаточная намагниченность в полях менее 500 Э, обусловлена трансляционным смещением доменных стенок, а в больших полях - их необратимым поворотом [31].
4. Коэргщтивностъ. Коэрцитивность — в некотором смысле "внешнее" магнитное свойство, зависящее от размера и формы частиц магнетика, силы магнитного взаимодействия между частицами, давления, температуры.
Коэрцитивной силой (HJ называют величину, равную напряженности поля, которую нужно приложить, чтобы довести намагниченность образца от значения остаточной намагниченности (Jr) до нуля, причем это поле должно иметь направление, противоположное направлению первоначального намагничивания. Коэрцитивная сила зависит от магнитной, кристаллографической и др. видов анизотропии вещества, наличия дефектов, способа изготовления образца и его обработки, а также от внешних условий, например, от температуры [6].
5. Относительная магнитная проницаемость fa) характеризуется изменением магнитной индукции среды при воздействии магнитного поля [6].
6. Магнитная восприимчивость характеризует способность вещества намагничиваться в магнитном поле. Относительная магнитная проницаемость связана с магнитной восприимчивостью (%) соотношением \ь- 1+х [6].
Таким образом, по значению остаточной намагниченности и коэрцитивной силы можно судить о процессе получения магнитного носителя, что нам представляется важным для его стандартизации. Поэтому в качестве основных характеристик, позволяющих достаточно полно оценить магнитные свойства магнетита, выбраны намагниченность насыщения, остаточная намагниченность и коэрцитивная сила.
Методы измерения магнитных характеристик ферримагнитных материалов В основу классификации методов измерений магнитных характеристик положено физическое явление, на котором базируется тот или иной метод измерения. Для каждого нижеуказанного метода возможно прямое и косвенное измерение.
Наиболее распространенным в настоящее время является так называемый силометрический метод. Этот метод основан на эффекте Фарадея, когда на намагниченное тело, находящееся в неоднородном магнитном поле, действует сила пропорциональная магнитной восприимчивости (%) и объему тела и направленная в сторону наибольшего изменения магнитной индукции (В). Практическая реализация эффекта Фарадея в измерительной технике сводится к измерению или преобразованию силы, возникающей в результате силового взаимодействия между намагниченным образцом и источником намагничивающего поля и пропорциональной магнитной восприимчивости. При прямом измерении магнитной восприимчивости (х) градуировка измерительных устройств ведется с помощью стандартного образца, имеющего тот же объем, что и исследуемый образец [32].
Наиболее точные косвенные измерения магнитной восприимчивости (х) могут быть осуществлены с помощью метода Гуи, когда необходимо осуществлять измерение магнитной индукции однородного ПОЛЯ.
Метод Торпа-Сенфтла позволяет, в отличие от метода Гуи, производить сравнительно точные косвенные измерения магнитной восприимчивости малых по размеру образцов, в том числе и неправильной формы [33].
Все силометрические методы измерения магнитной восприимчивости (х) обладают высокой и примерно одинаковой чувствительностью.
Измерительные устройства, реализующие силометрические методы измерения магнитной восприимчивости (х), как правило, представляют собой довольно сложные измерительные установки, состоящие из намагничивающего устройства, а также средства измерений магнитной индукции и силы, действующей на образец. В качестве намагничивающего устройства используют электромагниты или системы катушек с током. Для измерения магнитной индукции могут быть использованы холловские или ядерные тесламетры [31,33].
Кривая намагничивания магнетита
Одной из характеристик магнитных материалов является зависимость намагниченности (J) от напряженности магнитного поля (Н), которая определяется в виде кривой первоначального намагничивания при помещении ферримагн етика в изменяющееся магнитное поле. Получение кривой первоначального намагничивания отвечает требованиям хорошей воспроизводимости и широко используется для характеристики намагничивания материалов в постоянных полях. В общем случае кривую первоначального намагничивания можно разделить на 5 участков: область начального или обратимого намагничивания, область Рэлея, область наибольших проницаемостей, область приближения к насыщению и область парапроцесса [31].
С помощью вышеописанного устройства для 6 серий магнетита были получены его первоначальные кривые намагничивания. На основе полученных кривых первоначального намагничивания расчетным путем находили магнитные характеристики магнетита.
Точную навеску магнетита (0,04 г) таблетировали прямым прессованием без использования наполнителей. Полученный спрессованный образец магнетита, находящийся в "начальном" состоянии, помещали в магнитное поле, монотонно и медленно изменяющееся от нуля до некоторой величины. За "начальное" состояние приняли размагниченное состояние образца, при котором в отсутствии внешнего поля намагниченность равна нулю и не наблюдалось преимущественного направления намагничивания доменов. Образцы магнетита использовали один раз из-за сложности восстановления первоначального размагниченного состояния магнетита с таким же распределением областей намагничивания.
Измерения проводили на 6 сериях магнетита, определяли его кривую намагничивания (зависимость намагниченности (J) от напряженности магнитного поля (Н)). На рисунке 2 приведена кривая первоначального намагничивания магнетита для серии №1, для серий № 2-6 были получены аналогичные кривые. -100 100 Анализируя полученные кривые первоначального намагничивания магнетита можно сделать вывод, что намагничивание магнетита возможно при напряженности магнитного поля от -9000 до 9000 Э, увеличение напряженности магнитного поля ниже или выше этих значений нецелесообразно. На полученных кривых различаются три участка: начальный, соответствующий нижнему колену кривой (от 0 до 200 Э), участок быстрого возрастания намагниченности (от 200 до 6000 Э) и участок насыщения выше верхнего колена (от 6500 до 8000 Э).
С помощью полученных кривых первоначального намагничивания были рассчитаны значения основных магнитных параметров, необходимых для стандартизации магнетита по показателю "магнитные свойства", представленные в разделе 2.3.
В качестве основных магнитных параметров, характеризующих магнитные свойства магнетита, были выбраны следующие величины: намагниченность насыщения, остаточная намагниченность, коэрцитивная сила.
Точки пересечения кривой первоначального намагничивания с осями координат J и Н являются важными характеристиками магнитных материалов [31].
Точка пересечения кривой с осью намагниченности J является остаточной намагниченностью, т.е. представляет собой намагниченность в предварительно намагниченном до насыщения материале при напряженности магнитного поля в нем равной нулю.
Точка пересечения кривой с осью напряженности Н это и есть коэрцитивная сила, которая представляет собой величину отрицательной напряженности магнитного поля, необходимую для доведения до нуля намагниченности в материале, предварительно намагниченном до насыщения.
Максимальное значение намагниченности (J) при максимальном значении напряженности магнитного поля (Н)- это значение намагниченности насыщения образца.
Определение проводили на основании полученных кривых первоначального намагничивания 6 серий магнетита. На основании проведенных исследований установлены нормы качества для магнетита по показателю "магнитные свойства". Намагниченность насыщения должна находиться в интервале от 58,7 до 60,3 кА/м, остаточная намагниченность 10,3 - 10,6 кА/м, коэрцитивная сила 146,7 - 147,3 Э.
Изучение физико-химических показателей фосфолипидных дисперсий, полученных из головного мозга свиней
Целью данного раздела исследований являлась стандартизация полученных ФЛ, результаты которой легли бы в основу НД, регламентирующей качество ФЛ для получения липосом.
Следующим этапом наших исследований стало изучение качественного состава полученной фосфолипидной фракции. В ходе анализа литературных данных нами были найдены сведения по использованию хроматографии для качественного анализа выделенных ФЛ [115,201,202]. В задачи исследований входила разработка методики ТСХ анализа ФЛ в полученной липидной фракции.
Методика. Растворяли 1 часть неразведённой фосфолипидной смеси в 16 частях подвижной фазы (хлороформ : метанол (2:1)). По 2 мкл полученного липидного раствора и растворов свидетелей наносили в виде пятен диаметром около 3 мм на линию старта хроматографической пластинки "Silufol" или "Сорбтон" размером 10 х 15 см. Пластинку высушивали в сушильном шкафу при температуре 40-45С в течение 5 минут, помещали в хроматографическую камеру с системой растворителей хлороформ-метанол-вода (65:24:4), предварительно насыщенную в течение 30 минут и хроматографировали восходящим способом. Когда фронт растворителей проходил не менее 10 см, пластинку вынимали из камеры, сушили на воздухе. Идентификацию проводили проявлением в парах йода. На хроматограмме обнаруживались различные пятна ФЛ с определенными значениями Rf и Rs- В качестве свидетелей использовали тест-набор стандартов ФЛ («Sigma», USA) следующего состава: фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, сфингомиелин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозит.
Как следует из рисунка 4 и данных таблицы 3, на хроматограмме проявилось 10 пятен, 7 из которых были идентифицированы по значению Rf, которые сравнивали со значениями Rf, приведенными в литературе [202,203]. Дополнительно для подтверждения полученных результатов были рассчитаны Rs 5 из этих пятен с помощью стандартных растворов фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина, фосфатидилхолина, фосфатидилинозита, сфингомиелина. Три пятна полученных на хроматограмме не были идентифицированы. Необходимо отметить, что комплекс липидов, их процентное соотношение и величина Rf соответствовали литературным данным [202,203].
Результаты проведенных исследований позволили предложить для нормирования качественного состава полученной фосфолипидной фракции следующие данные хроматографического анализа в системе растворителей хлороформ-метанол-вода (65:24:4). На хроматограмме должны проявляться 7 пятен со следующими значениями Rf: 0,15±0,01 (фосфатидилсерин); 0,18±0, (сфингомиелин); 0,24±0,01 (фосфатидилинозит); 0,33+0,01 (фосфатидилхолин); 0,60+0,01 (фосфатидилэтаноламин); 0,74±0,01 (цереброзиды); 0,90±0,02 (холестерин) и не более 3 неидентифицированных пятен с Rf 0,29+0,01; 0,49±0,02; 0,52+0,01.
Окисленность жирнокислотных остатков отражает накопление продуктов перекисного окисления жирнокислотных остатков. На практике [204,205] измеряют накопление продуктов перекисного окисления либо на начальной стадии его прохождения - индекс окисленности: соотношение интенсивности полос поглощения в УФ свете ФЛ А2зз/А215, либо измеряется накопление конечных продуктов ПОЛ- концентрации МДА.
Определение проводили по содержанию продукта ПОЛ - МДА методом пробы с 2-ТБК [189]. Метод основан на измерении оптической плотности окрашенного комплекса, формирующегося в результате связывания двух молекул ТБК с молекулой МДА, образующейся при нагревании в кислой среде из продуктов ПОЛ.
Методика определения уровня ПОЛ. 2 мл анализируемого образца ФЛ вносили в реакционную смесь из 3 мл 2% раствора фосфорной кислоты (рН 1,3) и 1 мл 0,8% раствора ТБК, перемешивали в пробирке и нагревали на кипящей водяной бане в течение 30 минут. Затем смесь охлаждали до комнатной температуры и экстрагировали окрашенный продукт 5 мл н-бутанола. Измеряли оптическую плотность бутанольного раствора при длине волны 580 нм и 535 нм. В качестве раствора сравнения использовали раствор ТБК. Содержание МДА в пробе рассчитывали по уравнению регрессии [199]: С = 0,81 + 106-( 35 -Л580) (6) где С - концентрация МДА, нмоль/мл; А535 - оптическая плотность анализируемого раствора при длине волны 535 нм; Л580 - оптическая плотность анализируемого раствора при длине волны 580 нм; Исследования проводились на 6 сериях полученных ФЛ в трех повторностях. Результатом анализа являлось среднее значение трех определений.
Таким образом, на основании проведенного анализа содержание МДА в готовом продукте ФЛ должно находиться в интервале 5,80-6,20 нмоль/л.
Все серии полученных фосфолипидных фракций соответствовали разработанным нормам. В таблице 4 приведены данные, характеризующие содержание продуктов ПОЛ в полученных фракциях ФЛ.
Испытания на подлинность по магнитному наполнителю
Магнетит представляет собой смешанный оксид железа (II) и (III), которому соответствует формула FeO -Fe203. Для идентификации ионов железа (II) и (III) использовали реакции подлинности, которые рекомендует ГФ СССР XI издания [27].
Методика. К 5 мл липосомального раствора прибавляли 2,5 мл 1% раствора тритона Х-100, перемешивали, фильтровали. Осадок с фильтра переносили в химический стакан, отмывали декантацией водой очищенной с помощью магнита. Полученный осадок растворяли в 10 мл раствора кислоты хлористоводородной (1:1) (раствор А).
Обнаружение иона оіселеза (II). 5 мл раствора А переносили в пробирку, прибавляли 2,5 мл раствора гексацианоферрата (III) калия. Выпадал синий осадок.
Обнаружение иона железа (III). К 5 мл раствора А прибавляли раствор тиоцианата аммония. Раствор окрашивался в красный цвет.
Обе реакции позволили провести идентификацию ионов железа (II) и (III) и являются реакциями подлинности на магнетит.
Для идентификации преднизолона использовали качественные реакции, рекомендованные ГФ СССР X издания [ 182]
Методика. К 5 мл липосомального раствора прибавляли 2,5 мл 1% раствора тритона Х-100, перемешивали, фильтровали. К 5 мл фильтрата добавляли 15 мл изооктана, выпавший осадок (осадок А) отфильтровывали и высушивали.
Полученный осадок А растворяли в 2 мл метилового спирта, прибавляли 2 мл реактива Фелинга и нагревали. Наблюдалось образование желто-оранжевого окрашивания.
Полученный осадок А растворяли в 2 мл кислоты серной концентрированной. Через несколько минут появлялось красное окрашивание.
Обе реакции позволили провести идентификацию преднизолона в липосомальных формах и использовались для установления его подлинности.
Количественное определение эффективности включения различных веществ во внутренний объем липосом или в структуру их мембран можно проводить одним из нижеуказанных способов.
Способ 1. Для определения количества фиксированного в липосомы вещества их освобождают от невключившегося материала, после чего разрушают для высвобождения иммобилизованных в них лекарственных веществ. Добавление детергентов - додецилсульфатата натрия или тритона X-100 до концентрации 0,5 - 1% приводит к полному разрушению липосом. Если же включенный в липосомы материал инертен к хлороформу и не растворяется в нем, то липосомальный препарат обрабатывают хлороформом. Нижний слой с растворенными липидами отбрасывают. В надхлороформеном слое определяют содержание включенного вещества одним из доступных методов (химические и физико-химические методы анализа, радиометрический контроль, выявление количественной специфической биологической активности и т.д.) [109].
Способ 2. Липосомы с включенным материалом подвергают центрифугированию для их полного осаждения, супернатант декантируют и определяют в нем количество невключившегося материала. По разнице между количеством вещества, взятого в опыт и количеством вещества, невключившегося в липосомы, определяют количество вещества, иммобилизованного в липосомы [109].
В случае определения преднизолона в его липосомальных формах при разрушении липосом раствором тритона Х-100, ФЛ мешали определению преднизолона в полученном растворе. Поэтому количественное содержание преднизолона находили по разнице между исходным и невключившимся количеством вещества.
Методика. 10 мл липосом центрифугировали до полного осаждения липосом, надосадочную жидкость помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл с притертой пробкой, прибавляли 10 мл метилового спирта и растворяли невключившийся преднизолон при легком подогревании на водяной бане и помешивании в течение 10 мин. Объем раствора доводили до метки метиловым спиртом, хорошо перемешивали (раствор А).
