Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1. Природные триацилглицерины - источник полиненасыщенных жирных кислот 10
1.1.1. Полиненасыщенные жирные кислоты: функции, свойства 10
1.1.2. Сурок сибирский (Marmota sibirica Radde). Химический состав и биологическая ценность жира 12
1.1.3. Семена сосны сибирской (Pinus sibirica du Tour). Химический состав и биологическая ценность 18
1.1.4. Химический состав околоплодной пленки семян сосны сибирской 20
1.1.5. Антиоксиданты как стабилизаторы жиров '21
1.2. Липосомы 22
1.2.1. Характеристика липосом 22
1.2.2. Строение, структура, свойства и способы получения липосом...24
1.2.3. Методы введения липосом 35
1.2.4. Использование липосом при туберкулезе 38
1.2.5. Противотуберкулезные препараты 40
1.2.6. Побочное действие противотуберкулезных препаратов 44
Выводы к главе 1 47
ГЛАВА 2. Экспериментальная часть 48
2.1. Природные триацилглицерины 48
2.2. Противотуберкулезное средство 4-тиоурен-доиминометилпиридиний перхлорат 48
2.3. Методы исследования исходного сырья 50
2.3.1. Получение метиловых эфиров жирных кислот с применением 2 н. хлористого водорода в метиловом спирте
2.3.2. Идентификация веществ методом ГХМС 50
2.3.3. Идентификация веществ методом ВЭЖХ 51
2.3.4. Инструментальные методы исследования 51
2.3.5. Статистическая обработка результатов анализа 51
ГЛАВА 3. Оптимизация, разработка метода получения и исследования природных триацилглицеринов 53
3.1. Исследование физико-химических характеристик жира сурка сибирского (Marmota sibirica Radde) 53
3.2. Разработка и оптимизация методики получения концентрата полиненасыщенных жирных кислот из жира сурка сибирского 64
3.2.1. Разработка технологической схемы получения концентрата полиненасыщенных жирных кислот из жира сурка сибирского 64
3.2.2. Изучение химического состава концентрата полиненасыщенных жирных кислот из жира сурка сибирского 70
3.3. Определение физико-химических характеристик экстракта околоплодной пленки кедрового ореха 72
Выводы к главе 3 75
ГЛАВА 4. Разработка состава и технологии получения липосом с включением противотуберкулезного средства 4 тиоурендоиминометилпиридиний перхлората на основе природных триацилглицеринов .78
4.1. Получение липосом 78
4.1.1. Выделение яичных фосфолипидов 78
4.1.2. Приготовление липосом 78
4.1.3. Определение эффективности включения 4-тиоурен доиминометилпиридиний перхлорат в липосомах 79
4.2. Разработка лабораторного регламента изготовления липосом 80
4.2.1. Сведения о приборах, используемых при получении и контроле липосом 80
4.2.2. Биохимические характеристики исходного сырья для получения липосом 81
4.2.3. Получение липосом 82
4.2.4. Стабилизация и стерилизация липосом 84
4.2.5. Контроль качества липосом и их физико-химических и биологических свойств 85
4.2.6. Контроль качества противотуберкулезного средства 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлората 91
4.2.7. Идентификация 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлората в липосомах методом ВЭЖХ 93
4.2.8. Разработка методики количественного определения 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлората в липосомах 94
4.2.9. Изложение технологического процесса 102
Выводы к главе 4 108
Выводы 110
Список литературы 111
- Сурок сибирский (Marmota sibirica Radde). Химический состав и биологическая ценность жира
- Получение метиловых эфиров жирных кислот с применением 2 н. хлористого водорода в метиловом спирте
- Разработка технологической схемы получения концентрата полиненасыщенных жирных кислот из жира сурка сибирского
- Контроль качества противотуберкулезного средства 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлората
Введение к работе
Актуальность темы. В России за последние десятилетия возросла заболеваемость населения туберкулезом. По данным информационного центра Министерства здравоохранения Бурятии следует, что республика входит в число неблагополучных регионов России по уровню заболеваемости населения туберкулезом. В городе Улан-Удэ превышение эпидемического порога наблюдали в 1995 году, а к 2009 году число заболевших увеличилось и составило 154,8 чел. на 100 тысяч населения, что значительно превышает среднероссийский уровень. Особенно высока заболеваемость детей до 17 лет – 61,9 чел. на 100 тысяч детского населения, что в 4 раза выше аналогичного показателя по России (пресс-служба администрации г. Улан-Удэ). Одним из факторов, сдерживающих улучшение ситуации, является прерывание курса химиотерапии или снижение доз туберкулостатических препаратов из-за их высокой токсичности и развития побочных реакций со стороны желудочно-кишечного тракта, печени, почек, иммунной системы и т.д.
В Иркутском институте химии им. А.Е. Фаворского СО РАН совместно со специалистами Санкт-Петербургского НИИ фтизиопульмонологии Министерства здравоохранения и социального развития РФ разработано новое высокоэффективное противотуберкулезное средство в виде таблеток: 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлорат. Средство эффективно действует против микобактерий туберкулеза и активность его по отношению к отдельным штаммам туберкулеза в 200 и 400 раз выше, чем у стандартных лекарственных средств, токсичность его в 2,4 и 1,9 раза меньше изониазида и стрептомицина; установлено отсутствие мутагенности. Несмотря на перечисленные преимущества, данное средство обладает умеренной токсичностью, что может негативно отразиться при курсовом лечении больных туберкулезом.
В связи с этим актуальным представляется разработка липосом с включением указанного противотуберкулезного средства, обогащение липосом полиненасыщенными жирными кислотами (ПНЖК) природного происхождения (из жира сурка и кедрового масла, широко используемых в народной медицине при лечении туберкулеза), что значительно повысит фармакотерапевтическое влияние и снизит его токсичность. По своей химической природе ПНЖК близки к кислотам, входящим в структуру клеточной мембраны, т.е. являются биосовместимыми, включаются в биохимические процессы, обладают фармакологической активностью и отличаются отсутствием отрицательных реакций при длительном использовании.
Практический интерес представляет опыт народной медицины, который с давних времен при простудных заболеваниях органов дыхания использует жир сурка. Наряду с этим, известны лечебные свойства семян сосны сибирской (кедровые орехи), настойки и отвары которой обладают вяжущим, обезболивающим, противовоспалительным действием и являются потенциальным источником биологически активных веществ.
Исходя из вышеизложенного, можно заключить, что разработка липосом на основе жира сурка и кедрового ореха с включением 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлората, позволит усилить фармакологическую активность противотуберкулезных препаратов и уменьшить их токсическое действие.
Целью настоящей работы является разработка и стандартизация липосом с 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлоратом, полученных на основе природных триацилглицеринов.
Для достижения указанной цели необходимо решить следующие основные задачи:
исследовать физико-химические характеристики подкожного, полостного и бурого жира сурка сибирского;
получить и исследовать концентрат полиненасыщенных жирных кислот из жира сурка;
изучить физико-химические характеристики экстракта околоплодной пленки кедрового ореха;
разработать компонентный состав липосом с включением 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлората и вспомогательных веществ;
разработать методики качественного и количественного определения степени включения 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлората в липосомы и изучить стабильность полученной композиции;
разработать проект фармакопейной статьи предприятия (ФСП) и лабораторный регламент на получение липосом с содержанием 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлората.
Научная новизна работы
Исследован и определен физико-химический состав подкожного, полостного и бурого жира сурка сибирского. Наибольшее содержание полиненасыщенных жирных кислот отмечено в подкожном жире (80%). Получен концентрат ПНЖК из подкожного жира сурка и установлен его химический состав. Показано, что основными компонентами концентрата являются незаменимые жирные кислоты, такие как линолевая и линоленовая. Определены основные параметры получения концентрата ПНЖК из жира сурка, обеспечивающие максимальный выход продукта.
Исследован физико-химический состав экстракта околоплодной пленки кедрового ореха; установлено наличие ПНЖК в количестве 65 %.
Разработана оптимальная композиция состава липосом с включением 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлората.
Разработаны методики стандартизации качества липосом с включением 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлората методом гель-проникающей хроматографии, определены средние размеры липосом методом электронной микроскопии и спектротурбидиметрии.
Установлены показатели качества, которые включены в проект нормативной документации.
Практическая значимость
На основании проведенных исследований разработаны и внедрены:
лабораторный регламент на получение липосом с 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлоратом;
проект ФСП «Липосомы с 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлоратом»;
Апробация работы и публикации
Материалы диссертационной работы представлены и обсуждены на:
всероссийской научно-технической конференции с международным участием «Новые технологии добычи и переработки природного сырья в условиях экологических ограничений», 26-30 июля 2004г., г. Улан-Удэ;
научно-практической конференции Восточно-Сибирского государственного технологического университета, 18-20 апреля 2006г., г. Улан-Удэ;
XIV Международном молодежном научном форуме «Ломоносов-2007», 10-12 апреля 2007 г., г. Москва;
седьмой региональной межвузовской научно-практической конференции молодых ученых, посвященной 80-летию заслуженного деятеля науки РФ, профессора Б.И. Кузника и 70-летию академика РАМН В.Н. Иванова «Медицина завтрашнего дня», 15-16 мая 2008 г., г. Чита;
III International scientific conference «Traditional medicine: a current situation and perspectives of development», 18-22 August, 2008, Ulan-Ude;
V школе-семинаре молодых ученных России «Проблемы устойчивого развития региона», 5-10 июня 2009 г., г. Улан-Удэ.
По результатам исследований опубликовано 12 научных работ, из них 3 статьи в периодических изданиях, рекомендованных ВАК МО и науки РФ.
Работа выполнена в рамках исследований по программам и проектам: комплексная программа РАН «Фундаментальные науки - медицине»; проекты «Новый противотуберкулезный препарат «Перхлозон» и его композиции с природными соединениями», «Изучение композиций противотуберкулезного препарата «Перхлозон» с природными соединениями» (РФФИ – Байкал); грант Федерального агентства по науке и инновациям №2005-РИ-111.0/003 «Выполнение научно-исследовательских, опытно-конструкторских и технологических работ молодыми учеными и преподавателями во время проведения стажировок в российских научно-образовательных центрах».
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов и материалов исследования, экспериментальных глав, заключения, выводов, библиографии и приложения.
Сурок сибирский (Marmota sibirica Radde). Химический состав и биологическая ценность жира
Жир сурка широко известен своими положительными качествами и применяется населением Забайкалья при различных заболеваниях. Основное его применение связано с заболеваниями органов дыхания и пищеварительной системы.
Отношение забайкальских народов к суркам с давних времен основывалось на промысловой мотивации. Сурок наряду с кабаном и бобром стал предметом охоты еще в эпоху неолита. Шкурки сурка использовались для шитья одежды. Мясо и некоторые внутренние органы (печень, почки, желудок) сурка употреблялись в пищу. Очевидно, со времен раннего промыслового использования сурков были обнаружены полезные и целебные свойства продуктов, получаемых от них. Об этом можем судить по сведениям из средневекового трактата тибетской медицины «Чжуд-ши» [16]. В нем упоминается об использовании мяса и печени сурка: «...Мясо сурка «маслянистое», «тяжелое», «горячее», полезно при нарывах, изгоняет болезни холода и ветра из желудка, почек, поясницы и головы»... «При болезнях ветра сочетанием жара и холода лечи мясом сурка», «...печень сурка соединяет сломанные кости»... В монгольской традиционной медицине [17] указывается, что мясо тарбагана используется при простудных заболеваниях, лечит женские болезни. Жир тарбагана применяют при простудных заболеваниях, устраняет воспаление мышц. Сердце тарбагана рекомендуют при жарах сердца, а его желчь можно использовать при отравлениях ядом, полезна она для ран, устраняет болезни, вызванные алкоголем. Мясом и жиром тарбагана лечили туберкулез, раны, повреждения внутренних и наружных органов, обморожения и ожоги - суммирует известный монгольский исследователь тарбагана Эрэгдэндагва [18].
В Забайкалье обитают два вида сурков: тарбаган (Marmota sibirica Radde) и черношапочный сурок {Marmota camtschatica). В экологическом отношении Сурок сибирский (рис. 1.1) является представителем фауны млекопитающих степных экосистем, а черношапочный сурок — высокогорных альпийских или гольцовых (рис. 1.2). Численность: Общие запасы сурка оцениваются примерно в 10 миллионов особей [20]. В России, по данным Всероссийского учета сурков 1984г., обитало около 38 тысячи особей сурков, из них 25 тысяч в Бурятии, 11 тысяч в Тыве и около 2 тысяч в Юго-Восточном Забайкалье. Однако эти цифры недостаточно достоверны, особенно по Тыве [21], где по другим данным в конце 80-х гг. обитало более 50 тысяч сурков [22], в 70-е гг. их численность оценивалась в 13-15 тысяч особей, что ближе к первой из вышеназванных цифр. В Бурятии в 70-е гг. численность оценивалась примерно в 20 тысяч особей, в т.ч. промысловые запасы составляли не более 4 тыс. [23]. В 1989г. здесь учтено около 15 тыс. сурков [24], т.е. наблюдается явная тенденция сокращения численности. В течение XX в. численность сурка в Тыве и Бурятии сократилась в десятки раз. Оценочная численность сурка в Юго-Восточном Забайкалье в конце 80-х гг. лежала в диапазоне 1-2 тысячи особей [25]. За тот же период она сократилась. Современная численность здесь, вероятно, в значительной степени поддерживается миграциями сурков из Монголии. Естественные колебания численности в серьезном диапазоне сурку не свойственны. Основные причины сокращения численности и ареала сурка -неумеренный промысел, браконьерство, сельскохозяйственное освоение местообитаний, в Юго-Восточном Забайкалье — истребительные мероприятия, проводившиеся в 40-50-х гг. в природном очаге чумы и обусловившие почти полную редукцию ареала [25-27]. Те же факторы (охота, браконьерство, трансформация местообитаний) препятствуют естественному восстановлению, хотя истребление сурков в очагах чумы с конца 50-х гг. не проводилось в связи с появлением новых эффективных методов профилактики. Основные свойства и биологическая активность. Жир сурка жидкий, с высоким йодным числом, что является следствием проживания этого животного в условиях низких температур, вплоть до - 40 - 52С. Животное девять месяцев в году спит в своей норе. Для того чтобы нормально протекала жизнедеятельность организма при столь низких температурах, необходимо, чтобы жир животного оставался жидким и мог свободно циркулировать в теле. Жировые отложения подразделяют на жир подкожно-мышечный (в области паха, у лопаток, на спине, огузке и у корня хвоста) и внутренний, накапливающийся в полости тела на брыжейке кишечника и монолитной гроздью в районе почек. По весу накопленный внутренний жир примерно в два раза меньше, чем подкожный. Ценность жира меняется в зависимости от глубин его залегания. Чем ближе к поверхности тела залегает жир, тем больше в нем ненасыщенных жирных кислот (биологически наиболее активных) и ниже температура его плавления. Температура плавления снижается с увеличением в составе жира непредельных и низкомолекулярных жирных кислот, а также не предельности (наличия двойных связей) жирнокислотных радикалов. То есть чем глубже жир залегает в теле животного, тем он более тугоплавкий и менее качественный по составу. Подкожный жир содержит больше непредельных жирных и летучих кислот, чем внутренний. Наиболее ценный жир откладывается под кожей животного, а менее ценный — в полости и на кишках. При визуальном осмотре подкожный жир имеет плотную и грубую консистенцию (подобие свиного сала), так как находится в многочисленных толстых соединительнотканных «одеждах». Это не только энергетический резерв организма, также он выполняет и защитно-механическую функцию. Внутренний жир только, выглядит более жидким из-за большего размера белковых капсул, в которых жир находится. Благодаря более высокой ценности, подкожный жир полностью обеспечивает все жизненные потребности животного во время продолжительной зимовки (зимнего сна, спячки) и в первую очередь используется организмом в этот бескормный период, а внутренний жир расходуется в основном после выхода из зимней спячки (сна) для поддержания организма в малокормный весенний период. С. Мажигсурэн и др., изучали жирнокислотный и глицеридный состав сурочьего жира, его физические и химические свойства [28].
Получение метиловых эфиров жирных кислот с применением 2 н. хлористого водорода в метиловом спирте
В настоящее время это, пожалуй, наиболее активно развивающееся направление практического использования липосом. Способность липосом включать в себя самые разные вещества практически без каких-либо ограничений в отношении их химической природы, свойств и размера молекул дает уникальные возможности для решения данных проблем.
С точки зрения биологической совместимости липо сомы идеальны как переносчики лекарственных препаратов. Липосомы нетоксичны, не вызывают нежелательных иммунных реакций и биодеградируемы, то есть разрушаются под действием обычных ферментов, присутствующих в организме.
Повышение эффективности химиотерапевтических средств может быть достигнуто путем их включения в липосомы [89-94]; при этом активность дигидрострептомицина против s. aureus, расположенных внутри макрофагов, возрастает в 40 раз [92], антилейшманийная активность соединений сурьмы — в 30-200 раз [93], способность индуцировать туморицидный эффект альвеолярных макрофагов мурамилдипептидов - в 4000 раз [94]. Терапевтическая активность противотуберкулезных препаратов при экспериментальном туберкулезе также повышается при включении их в липосомы [89-91], что может быть обусловлено увеличением их концентрации на участке действия и внутри клеток моноцитарно-фагоцитирующей системы, имеющих важное значение при туберкулезном воспалении; снижением инактивации лекарственных веществ в сосудистом русле; замедлением их выведения из организма.
Так, например М.А. Владимирским и другими [95] создана липосомальная форма стрептомицина, способная обеспечить внутриклеточную доставку антибиотика и характеризующаяся более низкой токсичностью, чем обычные растворы антибиотика. Ими была изучена антимикобактериальная активность стрептомицина, включенного в липосомы. Исследования показали повышенное накопление дигидрострептомицин ДГС в органах моноцитарно-фагоцитирующей системы; особенно важным являлось увеличение содержания ДГС в пораженных туберкулезом тканях селезенки и легких. Изменение фармакокинетики стрептомицина при использовании липосом ведет, в конечном счете, к повышению его антимикобактериальной активности, что и показано авторами в опытах на примере экспериментального туберкулеза.
Adams и др. [96] изучали эффективность липосомального клофазимина при лечении острого и хронического экспериментального туберкулеза мышей. Максимально переносимая доза свободного антибиотика (5 мг/кг) оказалась неэффективной, тогда как применение липосомальной формы клофазимина в десятикратной дозировке (50 мг/кг), во-первых, не привело к появлению каких-либо токсических эффектов, во-вторых, позволило резко снизить либо полностью предотвратить бактериальный рост в легких, печени, селезенке.
S. Leitzke и др. [97] изучали активность липосомального амикацина на модели хранической инфекции Mycobacterium avium. Через 2 часа после внутривенного введения липосомального амикацина мышам уровень антибиотика в легких был в пять раз выше по сравнению со свободным антибиотиком. Через семь месяцев после ежемесячного введения липосомального амикацина все экспериментальные животные выжили, тогда как все животные контрольной группы умерли уже через четыре месяца.
Poiani и др. [98] использовали покрытые амилопектином липосомы для доставки в легочную ткань противотуберкулезного вещества гидроксипролина. Использование модифицированных липосом позволило почти вдвое повысить уровень гидроксипролина в легких по сравнению с непокрытыми липосомами.
Туберкулез {tuberculosis; лат. tuberculitm бугорок - osis) - хроническая инфекционная болезнь, вызываемая микобактериями туберкулеза. В зависимости от локализации поражения выделяют туберкулез органов дыхания, туберкулез кожи, периферических лимф, узлов, костей и суставов, мочеполовой системы, абдоминальный туберкулез и др.
В настоящее время, химиотерапевтические средства для лечения больных туберкулезом принято делить на 3 группы: А, В и С. Группа А включает наиболее активные в отношении микобактерий туберкулеза (МБТ) препараты: изониазид и рифампицин. Группу В составляют препараты средней активности: этамбутол, протионамид (этионамид), пиразинамид, стрептомицин, канамицин, флоримицин. К группе С отнесены препараты наименьшей активности: пара-аминосалициловая кислота (ПАСК) и тиоацетазон (тибон) [99].
Гидразид изоникотиновой кислоты (изониазид, ГИНК, тубазид) -наиболее активно действует на быстроразмножающиеся МБТ, менее активен по отношению к медленно размножающимся. Препарат в высоких концентрациях может оказывать бактерицидное действие на МБТ. Активен в отношении внутри - и внеклеточно расположенных микобактерий. Развитие других микроорганизмов изониазид не подавляет.
Изониазид быстро всасывается при приеме внутрь. Препарат равномерно распределяется в организме. Изониазид проникает в почки, мышцы, селезенку, легкие, мозг, кишечник, кожу, а также в жидкие среды организма - слюну, плевральную и спинномозговую жидкость. Концентрация изониазида в спинномозговой жидкости у здоровых лиц составляет 1/3 от уровня препарата в плазме крови, но при воспалении мозговых оболочек концентрация его в спинномозговой жидкости повышается в 2 раза. Изониазид хорошо проникает в очаги экссудативного и казеозно-некротического воспаления. Изониазид метаболизируется в печени, главным образом путем ацетилирования с участием N-ацетилтрансферазы. Ни один из метаболитов изониазида не обладает противотуберкулезной активностью. Приблизительно 50-75 % принятой внутрь дозы изониазида и его метаболитов экскретируется с мочой в течение первых суток.
По способности метаболизировать изониазид различают лиц с быстрым и медленным типами ацетилирования. После начального пика концентрации изониазида, который примерно одинаков у тех и других, концентрация препарата в плазме у лиц с быстрым типом ацетилирования снижается в 2-4 раза быстрее, чем у лиц с медленным типом. Нейротоксические реакции на изониазид наблюдаются чаще у лиц с медленным типом ацетилирования, гепатотоксические - у лиц с быстрым типом.
Разработка технологической схемы получения концентрата полиненасыщенных жирных кислот из жира сурка сибирского
При изготовлении липосом мы использовали классическую методику получения мультиламелярных липосом. Формирование липосом производили с использованием в качестве дисперсионной среды водной фазы, оказывающей существенное влияние на образование липидного бислоя.
Для приготовления липосом использовали фосфолипиды яичного желтка выделенного по методу Фолча [108]. Кроме того, для увеличения биологической ценности липосом нами было предложено обогащение липидных мембран полиненасыщенными жирными кислотами природного происхождения, что позволило увеличить биологическую ценность липосом.
Экспериментальные серии полученных липосом готовили следующим образом: навеску фосфолипидов растворяли в хлороформе, одновременно добавляя ПНЖК природного происхождения, в количестве 66,7 % от общего объема фосфолипидов и добавляли антиокислители - а-токоферола в количестве 5% от общего количества липидов. Смесь выдерживали, периодически помешивая, до полного растворения липидов, которые брали из расчета содержания их в готовых липосомах, не менее 10%.
После полного растворения липидов, колбу присоединяли к роторному испарителю и на водяной бане при температуре + 40С, и пониженном давлении, создаваемым водоструйным насосом, проводили выпаривание хлороформа. После полного удаления органического растворителя образовывалась тонкая пленка липидов на стенках колбы, которую продували газообразным азотом или аргоном для предотвращения окисления липидов. В колбу с пленкой добавляли 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлорат, растворенный в трис-буфере с рН = 7,4 и выдерживали в течение часа в термостате при 40С, для набухания фосфолипидов. После этого в колбу вносили стерильные стеклянные шарики и встряхивали в течение нескольких минут для полного снятия пленки со стенок колбы и получения гомогенной суспензии, при этом периодически замораживая суспензию для образования везикул. Полученную суспензию обрабатывали на ультразвуковом дезинтеграторе не давая перегреваться смеси, что отрицательно сказывается на качестве полученных липосом. Поэтому ультразвуковую обработку проводили с перерывами в три минуты, через каждые две минуты озвучивания.
В результате мы получали липосомы с однородной структурой и размерами. При хранении препарата в течение 8 месяцев при + 4С изменений внешнего вида суспензии, количества и качества липосом не обнаруживали.
Также на стабильность липосом влияет длительность ультразвуковой обработки. Как показали экспериментальные исследования, при продолжительном ультразвуковом воздействии стабильность липосом возрастает прямо пропорционально, но при этом снижается загрузка липосом, что негативно может сказаться на терапевтической дозе. Поэтому опытным путем установлено, что оптимальное время ультразвуковой обработки составляет — 7 минут, при которой степень загрузки превышает 56% от общего количества взятого вещества и соответствует терапевтической дозе (табл. 4.2.).
В качестве веществ, стабилизирующих мембрану липосом, широко используются антиоксиданты. В настоящее время выявлено и синтезировано огромное их количество. Однако, учитывая, что в липосомах предназначенных для введения в организм, предпочтительно использовать природные антиоксиданты, входящие в состав клеток и тканей, мы остановили свой выбор на токофероле (витамин Е). В системе антиокислительной защиты липидов биологических мембран он занимает особое место, так как является основным природным антиоксидантом и входит в состав собственной антиокислительной защитной системы организма. Механизм его действия заключается в том, что он связывается с теми участками мембраны клеток, где расположена углеводородная часть жирных полиненасыщенных кислот. В присутствии антиоксиданта реакция ПНЖК обрывается и предотвращается их потеря мембранами.
Применение липосом, взаимодействующих с клетками, органами и тканями различных биологических объектов, требует наличия стерильных препаратов. Учитывая высокую лабильность бислойной липидной мембраны, применение многих традиционных методов их стерилизации оказывается невозможным, так как при воздействии высоких температур, некоторых органических растворителей и дезинфектантов липосомы разрушаются. Поэтому наилучшим способом получения стерильных липосом является их изготовление в асептических условиях.
Определение степени включения липосом. Эффективность включения - один из важнейших параметров липосом, который является одним из основных показателей качества, так как от объема включившегося вещества внутрь липосом зависит эффективность терапевтического действия данного лекарственного средства. Сходство оболочки с естественными мембранами клеток организма, позволяют использовать их как естественный полупроницаемый барьер, легко пропускающий воду, но препятствующий диффузии различных веществ. Способность липосом включать в себя внутрь лекарственные средства и \ проносить содержимое сквозь цитоплазматические барьеры клеток значительно снижает токсичность лекарственного средства и выполняет функцию пассивного нацеливания, при этом в очагах воспаления в связи с повышением кровотока увеличивается концентрация данного вещества. Поэтому необходимо знать степень загрузки липосом. Концентрацию лекарственного вещества рассчитывали по оптической плотности раствора после разрушения липосом.
Контроль качества противотуберкулезного средства 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлората
Для получения одноламелярных везикул небольшого диаметра полученную суспензию обрабатываем ультразвуком в течение 7 минут с перерывами через каждые 2 мин.
Металлический наконечник источника ультразвука (УЗДН-А, Украина) погружают непосредственно в раствор и включают прибор на 2 мин с последующим перерывом 3 мин для охлаждения препарата. В качестве охлаждения применяют баню со льдом, для предотвращения окисления природных ненасыщенных липидов. После нескольких приемов озвучивания (до получения слегка опалесцирующего раствора).
Нарушение нормального хода технологического процесса может быть вызвано перегревом смеси при ультразвуковой обработке, вследствие чего происходит окисление липидов и дальнейшее расслоение суспензии. Также на процесс влияет время ультразвуковой обработки, превышение времени удерживания влечет к уменьшению липосом и внутреннему объему, что отрицательно сказывается на степени включения лекарственного средства внутрь.
После окончания ультразвуковой обработки полученную суспензию центрифугируют при 3000 об/мин 90 мин (для удаления частичек титана, которые образуются из излучателя, и крупных мультиламелярных везикул). Берут три четверти надосадочнои жидкости, переливают в сборник и передают на следующую стадию технологического процесса.
Потери основного вещества при центрифугировании и переливании из колбы в колбу составляет 10-15 %. Для удаления, не включившегося противотуберкулезного средства используют метод гель-фильтрации. Для этого берут колонку объемом 150 мл с сефадексом G-50, уравновешенную в физиологическом растворе, и элюируют препарат. Собирают две фракции, поглощающие при 310 нм, первая из которых, содержит нагруженные липосомы, а вторая -свободный 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлорат. Потеря основного вещества составляет около 40%. Далее не включившееся вещество идет на стадию ТП 1. Нарушения нормального хода технологического процесса на стадии заключается в неправильном отборе фракции. Для устранения данной проблемы, предлагаем отбирать фракции по 4 мл и проводить измерения оптической плотности в каждой фракции. Стадия УМО 1. Фасовка и упаковка липосом с 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлората. Полученный готовый продукт — липосомы с 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлоратом после его анализа на соответствие ФСП № 42- расфасовывают по 20 мл в банки оранжевого стекла типа БВ 2000-90-ОС-1 по ОСТ 64-2-71-80. Банки укупоривают навинчиваемыми пластмассовыми крышками типа 1.1-90 по ОСТ 64-2-87-81. Под крышку вкладывают уплотнительную прокладку из картона марки «А» по ГОСТ 9347-74 и пергамента по ГОСТ 1341-84, крышки обтягивают пергаментом, обвязывают нитками хлопчатобумажными швейными по ГОСТ 6390-87, концы которых подводят под этикетку и заливают парафином по ГОСТ 23689-89. Банки обертывают бумагой оберточной по ГОСТ 8273-75. На банки и бумагу наклеивают этикетки из бумаги писчей по ГОСТ 18510-87 или бумаги этикеточной по ГОСТ 7625-86. Хранить липосомы с 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлоратом необходимо в сухом, защищенном от света месте, при температуре не выше 4С. Выход от начала технологического процесса — 60,42 %. Липосомы используются как носители лекарственных средств. Модифицируя модельные липидные мембраны фосфолипидами, содержащими полиненасыщенные жирные кислоты, можно добиться усиление их биологической ценности и повышения эффективности липосомальной технологии [22]. Разработана технология изготовления жидких липосом, с включением в мембрану триацилглицеринов животного и растительного происхождения (жира сурка и экстракта околоплодной пленки кедрового ореха). Загружая полученные липосомы 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлоратом, можно добиться усиления их фармакологической активности. Изучена зависимость продолжительности ультразвуковой обработки на степень включения 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлората в липосомы. Установлено оптимальное время ультразвуковой обработки, при которой степень загрузки составляет 56 %, - семь минут. Количественную оценку содержания 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлората в липосомах проводили спектрофотометрическим и ВЭЖХ методами после разрушения липосомальной оболочки дезоксихолатом натрия. Результаты количественного определения 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлората показали, что среднее значение содержания данного вещества составляет 38,99 %, 39,03 %, относительная ошибка не превышает 0,35 %, 0,33% соответственно. Сравнительная оценка результатов количественного определения 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлората спектрофотометрическим методом и методом ВЭЖХ показала, что оба метода дают хорошо воспроизводимые результаты. Разработанные методики с применением УФ и ВЭЖХ валидированы, с помощью статистических методов доказаны их правильность, достоверность, воспроизводимость.
