Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1 Противоопухолевые лекарственные средства. Общая характеристика группы, современное состояние в сфере обращения и регистрации 10
1.2 Основные аспекты проведения клинических и биоаналитических исследований противоопухолевых лекарственных средств в Российской Федерации и за рубежом 15
1.3 Оценка подходов к валидации биоаналитических методик согласно российской и зарубежной нормативной документации 17
1.4 Характеристика изучаемых препаратов и обзор методик их определения в биожидкостях 25
Выводы к разделу обзор литературы 33
ГЛАВА 2. Разработка и валидация методик определения капецитабина, темозоломида и иматиниба в плазме с помощью метода ВЭЖХ с уф-спектрофотометрическим детектированием 35
ГЛАВА 3. Разработка и валидация методики определения анастрозола в плазме с помощью метода гх с масс- спектрометрическим детектированием 65
ГЛАВА 4. Разработка и валидация методик определения капецитабина, темозоломида, иматиниба и анастрозола в плазме с помощью метода вэжх с масс- спектрометрическим детектированием 74
ГЛАВА 5. Статистическая обработка данных и сравнительный анализ разработанных методик 109
ГЛАВА 6. Анализ фармакокинетики изучаемых препаратов с помощью разработанных методик хроматографического анализа 114
Общие выводы 122
Список литературы 123
- Основные аспекты проведения клинических и биоаналитических исследований противоопухолевых лекарственных средств в Российской Федерации и за рубежом
- Оценка подходов к валидации биоаналитических методик согласно российской и зарубежной нормативной документации
- Характеристика изучаемых препаратов и обзор методик их определения в биожидкостях
- Разработка и валидация методики определения анастрозола в плазме с помощью метода гх с масс- спектрометрическим детектированием
Основные аспекты проведения клинических и биоаналитических исследований противоопухолевых лекарственных средств в Российской Федерации и за рубежом
Главной особенностью для проведения клинических исследований для противоопухолевых лекарственных препаратов является возможность проведения исследований на людях, больных онкологическими заболеваниями [12]. Так, в проекте руководства FDA на иматиниба мезилат (таблетки) по исследованию биоэквивалентности лекарственнных средств, такое исследование рекомендуется проводить на пациентах, уже принимающих препараты иматиниба по назначению врача [13]. Исследования биоэквивалентности препаратов темозоломида FDA рекомендует проводить на пациентах, принимающих, либо не принимающих препараты темозоломида (капсулы), но имеющих в анамнезе показания к их назначению [14]. Биоэквивалентность препаратов капецитабина проект руководства FDA рекомендует также проводить на пациентах, принимающих препараты капецитабина дважды в день с одновременным определением содержания в плазме как нативного препарата, так и его активного метаболита (5 фторурацила), т.к. фармакологическое действие обусловлено обеими формами препарата [15]. В то же время, в Российской Федерации на данный момент, согласно данным, опубликованным на портале Государственного реестра лекарственных средств (ГРЛС), утверждено несколько протоколов проведения клинических исследований сравнительной фармакокинетики и биоэквивалентности препаратов иматиниба и анастрозола как с участием здоровых добровольцев, так и с участием пациентов, имеющий в анамнезе хронический миелобластный лейкоз – для иматиниба, а для анастрозола – пациенток с поставленным диагнозом рак молочной железы, тогда как исследования биоэквивалентности препаратов капецитабина и темозоломида проводятся, согласно порталу ГРЛС, только на пациентах с соответствующими показаниям к применению препаратов заболеваниям в анамнезе [16].
В Российской Федерации основными документами, регламентирующими проведение клинических исследований, в т.ч. исследования фармакокинетики и биоэквивалентности лекарственных средств регламентируют Федеральный закон РФ от 12.04.2001 №61-ФЗ "Об обращении лекарственных средств" и Стандарт GCP ("Надлежащая клиническая практика") ГОСТ 52379-2005. Все исследования биоэквивалентности ЛС проводятся в соответствии с Методическими указаниями МЗСР «Оценка биоэквивалентности лекарственных средств» (2008) и руководством ФГБУ НЦЭСМП «Руководство по экспертизе лекарственных средств» под ред. проф. А. Н. Миронова. Обычно, все исследования проводятся с участием здоровых добровольцев, однако для клинических исследований психотропных препаратов, препаратов для лечения ВИЧ и СПИДа разрешено проведение испытаний с участием пациентов, имеющих в анамнезе соответствующий диагноз [13,16-22]. Для исследований биоэквивалентности противоопухолевых препаратов также допускается привлечение пациентов с поставленным диагнозом «рак», и принимающих те, или иные препараты в качестве химиотерапевтического лечения [16,17]. Вместе с тем, участие пациентов в данных клинических исследованиях должно быть сугубо добровольным, пациенты должны быть информированы о возможных последствиях участия в данных испытаниях, что впервые было оговорено в кодексе Нюрнбергского трибунала (1947 г.), а затем в Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации (ВМА) в 1964 году. Эти два документа являются основополагающими с точки зрения этических аспектов клинических исследований на людях. 1.3 Оценка подходов к валидации биоаналитических методик согласно российской и зарубежной нормативной документации
Важнейшим этапом изучения фармакокинетики лекарственных средств является разработка и валидация биоаналитической методики для данного вещества. Методика количественного определения лекарственного вещества в биологических жидкостях называется биоаналитической методикой. Валидация биоаналитической методики – процедура экспериментального подтверждения соответствия аналитической методики цели исследования [23 25]. Разработка и валидация биоаналитической методики являются важнейшим этапом исследования фармакокинетики лекарственных веществ.
В мировой практике валидация биоаналитических методик проводится согласно нормативной документации: практического руководства по валидации биоаналитических методик национального агентства Food and drug administration (FDA, США) и European Medical Agency (ЕМА, Европейский Союз). Утвержднное ФГБУ «НЦЭСМП» в 2013 году "Руководство по экспертизе лекарственных средств" (Том I) является первым на сегодняшний день документом в Российской Федерации, в котором изложены требования к валидации биоаналитических методик для исследований, проводимых в Российской Федерации [26-36]. Требования Руководства близки к требованиям ЕМА, применимым к валидации биоаналитических методик, хотя и имеются характерные особенности.
Оценка подходов к валидации биоаналитических методик согласно российской и зарубежной нормативной документации
Для приготовления исходного стандартного раствора иматиниба 50,0 мг субстанции вносили в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляли 25 мл воды очищенной, перемешивали до полного растворения, доводили объем раствора тем же растворителем до метки. Полученный раствор имел концентрацию иматиниба 1 мг/мл. Для получения раствора а с концентрацией 10000 нг/мл отбирали 1 мл раствора в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили объм колбы водой очищенной до метки. Стандартные растворы готовили путем разведения раствора с концентрацией 10000 нг/мл водой очищенной (Таблица 5). Таблица 5 Приготовление стандартных растворов иматиниба Концентрацияприготовленного раствораиматиниба, нг/мл Количество компонента, мл Стандартный раствориматиниба (С = 10000нг/мл), мл Вода очищенная, мл
Для приготовления раствора с концентрацией 250 нг/мл отбирали 5 мл раствора иматиниба с концентрацией 2500 нг/мл в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводили водой очищенной до метки, перемешивали.
Для приготовления проб из образцов, содержащих иматиниб, к 600 мкл образца плазмы (или 480 мкл холостой плазмы с прибавлением 120 мкл раствора стандарта иматиниба) прибавляли 200 мкл 75% раствора трифторуксусной кислоты, встряхивали на шейкере типа "вортекс", затем центрифугировали 10 минут при 15200 об/мин, затем 700 мкл надосадочной жидкости переносили в виалы для хроматографа.
В качестве методики количественного определения иматиниба в плазме крови человека была использована методика сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии (СВЭЖХ), что позволило резко сократить время анализа и расход компонентов подвижной фазы. Подвижная фаза: 50 мМ фосфатный буфер рН 2,5/ацетонитрил, 85,5:14,5 предварительно профильтрованная и дегазированная на устройстве для фильтрования под вакуумом.
Валидация биоаналитической методики была проведена согласно руководств FDA (Guidance for Industry: Bioanalytical method validation. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evolution and Research (CDER). U.S. Government Printing Office: Washington, DC, 2001) и EMA (Guideline on validation of bioanalytical methods (draft).European Medicines Agency. Committee for medicinal products for human use: London, 2009) по следующим характеристикам: селективность, линейность, правильность (на уровнях inter-day и intra-day), прецизионность (на уровнях inter-day и intra-day), предел количественного определения, стабильность растворов.
Для оценки селективности был проведн анализ 7 образцов холостой плазмы, образца холостой плазмы с прибавлением стандартного раствора 5-48 фторурацила и капецитабина в диапазоне концентраций 0,05 – 5 мкг/мл для 5-фторурацила и 0,1 мкг/мл – 10 мкг/мл для капецитабина. На хроматограммах образцов холостой плазмы не наблюдалось пиков со временами удерживания, соответствующим времени удерживания 5-фторурацила и капецитабина. Соответствующие хроматограммы приведены ниже на рис. 5 и 6.
Был проведн анализ 7 образцов холостой плазмы с прибавлением стандартных растворов капецитабина и 5-фторурацила до получения концентраций 0,1; 0,2; 0,5; 1; 2; 5 и 10 мкг/мл – для капецитабина и 0,05; 0,1; 0,2; 0,5; 1; 2; 5 – для 5-фторурацила. По полученным значениям был построен калибровочный график (для 5-фторурацила r2 = 0,99881, для капецитабина - r2 = 0,99952) (рис. 7).
Характеристика изучаемых препаратов и обзор методик их определения в биожидкостях
Во время проведения исследования образцы холостой и исследуемой плазмы крови хранили в морозильнике для плазмы при температуре от - 45 до - 50 оС. Стандартные растворы темозоломида, иматиниба и анастрозола хранили в холодильнике при температуре от 2 до 8 оС. Стандартные растворы капецитабина и 5-фторурацила, приготовленные на метаноле, хранили в морозильнике – 45 до – 50 оС.
Для пробоподготовки плазмы для исследуемых препаратов использовались методы осаждения белков с помощью раствора трифторуксусной кислоты и ацетонитрила. Для препаратов, не подвергающихся разрушению в кислой среде использовался метод осаждения белков раствором трифторуксусной кислоты, поскольку он позволяет получать, как было отмечено выше, более чистые пробы, что особенно актуально при анализе проб плазмы методом ВЭЖХ-МС, поскольку во время анализа проб, полученных при осаждении белков растворами ТФУ, в значительно меньшей степени засоряется масс-селективный детектор, в первую очередь капилляр системы ионизации. Осаждение белков ацетонитрилом применялось при анализе веществ, разрушающихся в кислой среде (капецитабин). В случае с капецитабином это особенно актуально, т.к. при определении капецитабина в одной пробе с 5-фторурацилом разрушение капецитабина в кислой среде приведт к образованию 5-фторурацила, что исказит результаты анализа.
Для количественного определения исследуемых веществ в биожидкостях был выбран жидкостный хроматограф Waters Acquity H-class system с масс-селективным. Поскольку одной из основных задач исследования была поставлена разработка наиболее подходящих методик для количественного определения исследуемых препаратов в плазме крови человека в пределах предполагаемого терапевтического диапазона концентраций в плазме крови человека с целью применения их в фармакокинетических исследованиях, для разработки методик анализа методом ВЭЖХ-МС использовались стандартные растворы с теми же концентрациями исследуемых веществ, что и при анализе методом ВЭЖХ-УФ (темозоломид, иматиниб, капецитабин с 5-фторурацилом) и анастрозол (ГХ-МС), поэтому методики приготовления стандантых растворов в данном разделе не приводятся.
Для пробоподготовки использовался метод осаждения белков плазмы крови ацетонитрилом. Для этого к 300 мкл исследуемой плазмы крови (или 240 мкл холостой плазмы крови с прибавлением 60 мкл раствора стандартного образца соответствующей концентрации), помещнным в микроцентрифужные пробирки объмом 1,5 мл прибавлялось 900 мкл ацетонитрила, после чего пробы центрифугировались 10 минут при 14600 об/мин, после чего отбиралась надосадочная жидкость и помещалась в виалы для хроматографа.
В качестве неподвижной фазы была использована хроматографическая колонка Acquity UPLC BEH C18, 50х2,1 мм, 1,7 мкм при температуре 40 оС, позволяющая проводить хроматографический анализ в системе сверхэффективной жидкостной хроматографии. В качестве подвижной фазы использовались: 0,1% водный раствор муравьиной кислоты/ацетонитрил (градиентное элюирование), предварительно профильтрованная и дегазированная на устройстве для фильтрования под вакуумом. Скорость потока подвижной фазы 0,5 мл/мин, схема градиентного элюирования приведена ниже в таблице 19.
Объем вводимой пробы: 10 мкл. Время хроматографирования: 5 мин. Детектирование:
Режим ионизации: ES+ (электроспрей, позитивная полярность) Температура источника: 150 С Температура газа десольватации: 500 С Поток газа десольватации: 1000 L/hr
SIM-режим: ионы с m/z 360,03 – для капецитабина, 130,90 – для 5-фторурацила. Время удерживания: 5-фторурацил – около 0,35 мин; капецитабин – 0,6 мин.
Для приготовления проб из образцов, содержащих темозоломид, к 600 мкл образца плазмы (или 480 мкл холостой плазмы с прибавлением 120 мкл раствора стандартного образца темозоломида) прибавляли 300 мкл 50% раствора трифторуксусной кислоты, встряхивали на шейкере типа "вортекс", центрифугировали 10 минут при 14600 об/мин, затем 800 мкл надосадочной жидкости переносили в виалы для хроматографа.
Разработка и валидация методики определения анастрозола в плазме с помощью метода гх с масс- спектрометрическим детектированием
Для статистической оценки достоверности полученных различий по результатам валидации разработанных методик для количественного определения исследуемых препаратов плазме крови человека был проведн сравнительный анализ с помощью расчта критерия Фишера по результатам двух независимых выборок. Сравнительный анализ проводился для каждого уровня концентраций для двух различных хроматографических методик на уровнях intra-day и inter-day.
Поскольку аналитический диапазон (в том числе и пределы количественного определения на уровне 1/20 Cmax [31]) для разработанных методик количественного определения является одинаковым, так как он был подобран с учтом ожидаемого фармакокинетического диапазона концентраций, выбор конкретной методики количественного определения для проведения фармакокинетического анализа проводилось сравнение вариабельности валидационных характеристик. Расчтные данные для критерия Фишера для каждого исследуемого препарата представлены ниже в табл. 32–35. Поскольку все разработанные методики соответствуют критериям приемлемости в случае отсутствия статистически значимых различий валидационных характеристик, выбор методики для дальнейшего исследования проводился на основе общих аналитических параметров сравниваемых методик (общее время анализа, простота проведения пробоподготовки).
Значения, полученные при проведении статистической обработки с использованием расчта критерия Фишера по результатам двух выборок для препарата капецитабин (для концентраций 5-фторурацила и капецитабина)
По результатам статистической обработки с использованием расчта критерия Фишера по результатам двух выборок для концентраций 5-фторурацила на уровнях концентраций 0,05 мкг/мл (intra-day), 5,0 мкг/мл (intra-day), 0,1 мкг/мл (inter-day), капецитабина на уровнях концентраций 0,1 мкг/мл (intra day), 10,0 мкг/мл (intra day, inter day) показаны статистически значимые различия двух дисперсий (при P 0,05), при этом уровень вариабельности для метода ВЭЖХ-МС является более высоким на более низких точках аналитического диапазона (для 5-фторурацила RSD0,05intra=16,09, RSD0,1intra=12,78, для капецитабина RSD0,1intra=10,14), а для метода ВЭЖХ-УФ – в верхней части аналитического диапазона концентраций (для 5-фторурацила RSD5,0intra =2,03, для капецитабина RSD10,0intra =10,22, RSD10,0inter =3,05). Исходя из этих данных, с учтом того, что методика количественного определения капецитабина и 5-фторурацила в плазме с помощью метода ВЭЖХ-МС обладает несколько более пригодными валидационными характеристиками для анализа исследуемого препарата в верхней части аналитического диапазона (с учтом дозировки исследуемого препарата) и меньшего времени анализа одной пробы (5 минут для ВЭЖХ-МС и 15 минут для ВЭЖХ-УФ), для дальнейшего исследования было решено использовать метод ВЭЖХ с масс-селективным детектированием. Кроме того, необходимо отметить, что в случае с определением капецитабина и 5-фторурацила, необходимая чувствительность, селективность, правильность и прецизионность была достигнута в том числе за счт использованной методики пробоподготовки (жидкость-жидкостная экстракция), в процессе выполнения которой происходило концентрирование пробы в несколько раз. Данная методика является более трудомкой для проведения рутинного анализа. Использование методики ВЭЖХ с масс-селективным детектором позволит в больше оценить возможности непосредственно аналитического метода.
По результатам статистической обработки с использованием расчта критерия Фишера по результатам двух выборок для концентраций иматиниба на уровнях концентраций 200 нг/мл (intra-day), 2000 нг/мл (intra-day), 500 нг/мл (inter-day) показаны статистически значимые различия двух дисперсий (при P 0,05), при этом уровень вариабельности для метода ВЭЖХ-МС является более высоким (RSD200intra=11,72, RSD2000intra=8,73, RSD500inter =10,10). Исходя из этих данных, для дальнейшего исследования было решено использовать метод ВЭЖХ с УФ-спектрофотометрическим детектированием, поскольку данный метод обладает более высокими правильностью и прецизионностью и является более пригодным для анализа.
По результатам статистической обработки с использованием расчта критерия Фишера по результатам двух выборок для концентраций анастрозола на уровнях концентраций 5 нг/мл (intra-day), 20 нг/мл (intra-day), 20 нг/мл (inter-day), 100 нг/мл (inter-day) показаны статистически значимые различия двух дисперсий (при P 0,05), при этом уровень вариабельности для метода ГХ-МС является более высоким (RSD5intra=18,52, RSD20intra=14,26, RSD20inter =11,77, RSD100inter =9,49). Исходя из этих данных, для дальнейшего исследования было решено использовать метод ВЭЖХ с масс-селективным детектированием, поскольку данный метод обладает более высокими правильностью и прецизионностью и является более пригодным для анализа.
Таким образом, по результатам сравнения валидационных характеристик разработанных методик, учитывая данные дисперсионного анализа, количественное определение исследуемых препаратов в плазме крови добровольцев или пациентов проводилось методами ВЭЖХ-МС (для капецитабина и 5-фторурацила, темозоломида, анастрозола) и ВЭЖХ-УФ (для иматиниба).
![Сравнительное изучение капсулированных препаратов циклоспорина А (контроль качества и терапевтический лекарственный мониторинг) [Электронный ресурс]](/i/i/4288/210981.png "Сравнительное изучение капсулированных препаратов циклоспорина А (контроль качества и терапевтический лекарственный мониторинг) [Электронный ресурс] Ледовских Мария Владимировна")
