Введение к работе
Актуальность темы. Соединения группы фторхинолонов являются значимой группой химиотерапевтических средств с выраженным антибактериальным эффектом. Они проявляют высокую противомикробную активность как против грамположительных, так и грамотрицательных микроорганизмов. Однако, имеется ряд побочных эффектов, характерных в большей или меньшей степени для всех препаратов группы. Это артро-, кардио-, гепато-, нефротоксичность, фотосенсибилизация. Серьезность побочных действий, выявленных в клинических исследованиях, предопределило снятие с медицинского применения ряда фторхинолонов и поиск способов снижения интенсивности и количества проявляемых побочных эффектов.
Перспективным направлением в терапии различных патологий является использование технологий направленного транспорта лекарственных средств, позволяющих значительно снизить их системную токсичность, удлинить время полувыведения препаратов из организма, уменьшить терапевтическую дозу и кратность введения. Контролируемая и целенаправленная доставка в организм антибактериальных препаратов основана на использовании различных носителей или векторов, обладающих тропностью к определенным органам или их клеткам. В качестве векторов могут выступать гормоны, ферменты а также микроконтейнеры: липосомы, капсулы из человеческого альбумина и аутоклетки крови. Наиболее выгодными с точки зрения биологической совместимости считаются системы доставки, в которых используются собственные клетки организма, в частности, эритроциты, лейкоциты и тромбоциты.
Для получения клеточных форм фторхинолонов с дозированным содержанием действующего вещества необходима точная, экспрессная, легко воспроизводимая и экономически выгодная методика их стандартизации. Для количественного определения фторхинолонов в субстанциях и лекарственных формах фармакопейным является метод титрования в неводных средах, который характеризуется большой трудоёмкостью и длительностью, а также высокой токсичностью используемых реактивов. В современных лабораториях большое распространение получил метод высокоэффективной жидкостной хроматографии, но высокая стоимость одного анализа, трудоемкость и необходимость наличия высококвалифицированного специалиста для работы с хроматографом снижают возможные темпы распространения данного метода.
В последние годы всё большее внимание исследователей привлекают оптические методы анализа, одним из которых является спектрофотометрия. К достоинствам данного
метода можно отнести высокую воспроизводимость и экспрессность. Анализ литературных источников показывает, что спектрофотометрические методики количественного определения фторхинолонов разработаны недостаточно. В связи с этим возникает необходимость разработки экспрессной и точной методики количественного определения фторхинолонов в субстанциях, лекарственных формах и иммобилизованных в клеточные носители.
Цель и задачи исследования.
Цель работы - получение клеточных форм соединений группы фторхинолонов, разработка методик их анализа.
Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие основные задачи:
Разработать методики качественного и количественного определения фторхинолонов в субстанциях и лекарственных формах;
Выделить и получить клеточные носители: эритроцитарные (ЭН) и лейкоцитарные (ЛН);
Получить клеточные формы фторхинолонов;
Разработать методики выделения исследуемых препаратов из клеточных носителей и биоматериала.
Разработать методики качественной оценки и количественного определения клеточных форм фторхинолонов;
Изучить иммуномодулирующую и антиоксидантную активности изучаемых фторхинолонов, иммобилизованных в ЭН и ЛН при токсическом поражении почек, осложненном стафилококковой инфекцией.
Научная новизна исследований.
Впервые получены клеточные (эритроцитарные и лейкоцитарные) формы норфлоксацина, офлоксацина и цопрофлоксацина. Изучено влияние различных факторов на динамику включения и высвобождения фторхинолонов из клеточных носителей. Экспериментально обоснована возможность использования ЭН и ЛН для транспорта изучаемых веществ, определены их сроки хранения.
Разработаны спектрофотометрические методики количественного определения фторхинолонов в субстанциях и таблетках, которые отличаются простотой, достаточной точностью и экспрессностью.
Исследованы условия выделения фторхинолонов из биологических материалов при помощи колоночного варианта гель-хроматографии.
Предложены методики количественного спектрофотометрического определения фторхинолонов в плазме крови, гемолизате клеток и в клеточных носителях, которые отличаются достаточной точностью, чувствительностью и экспрессностью.
Проведена сравнительная оценка метрологических характеристик разработанных спектрофотометрических методик с данными анализа методом ВЭЖХ, что позволило сделать объективные выводы о преимуществах и недостатках сравниваемых методов.
Установлено, что введение эритроцитарных клеточных форм фторхинолонов животным с ОПН в сочетании со стафилококковой инфекцией снижало выраженность иммуносупрессии, процессов перекисного окисления липидов и активировало антиоксидантную защиту эритроцитов. Введение лейкоцитарных клеточных форм фторхинолонов крысам с ОПН, осложненной стафилококковой инфекцией нормализовало данные процессы.
Практическая значимость работы.
Разработанные методики спектрофотометрического количественного определения норфлоксацина, офлоксацина и ципрофлоксацина гидрохлоридов в субстанциях и таблетированной лекарственной форме могут быть использованы для контроля качества рассматриваемых препаратов.
На основе колоночного варианта гель-хроматографического выделения фторхинолонов из биологических материалов разработаны методики количественного определения норфлоксацина, офлоксацина и ципрофлоксацина в плазме крови и гемолизате клеточных носителей. Представленные методики могут быть использованы в клинических лабораториях для проведения терапевтического мониторинга при лечении исследуемыми препаратами, а также для их количественной оценки при использовании клеточных форм фторхинолонов.
Представленные методики имеют ряд преимуществ перед существующими: повышают объективность и оперативность анализа, не уступая по чувствительности и точности определения.
Полученные результаты внедрены в научную и практическую работы кафедр КГМУ, БГУ и ВГМА, а также в работу Курского филиала ФГУ по контролю предметов медицинского назначения Росдрава.
Связь задач исследования с проблемным планом
фармацевтических наук.
Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований кафедры фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского университета и соответствует проблеме "Фармация" межведомственного научного совета №36. Номер государственной регистрации 01.2.00703415.
Основные положения, выносимые на защиту:
-методики спектрофотометрического определения норфлоксацина, офлоксацина и ципрофлоксацина в субстанциях и таблетированой лекарственной форме;
-методики количественного спектрофотометрического определения
норфлоксацина, офлоксацина и ципрофлоксацина плазме крови и гемолизате клеток крови;
-методика количественной оценки фторхинолонов при иммобилизации их в ЭН и ЛН;
-результаты изучения включения и высвобождения исследуемых веществ из ЭН и ЛН, стабильности клеточных носителей;
-иммунометаболическая активность клеточных форм фторхинолонов при токсическом поражении почек в условиях стафилококковой инфекции.
Апробация работы.
Основные положения диссертации доложены на конференциях молодых учёных и студентов КГМУ (Курск, 2007-2009г.), итоговых научных конференциях КГМУ и сессии Центрально-Черноземного научного центра РАМН (2008, 2009гг.), международной конференции «Современные проблемы и пути их решения в науке, транспорте, производстве и образовании» (Одесса, 2007г.), а также представлены в сборниках тезисов докладов соответствующих конференций и сессий. Апробация работы проведена на научно-практической конференции кафедр фармакогнозии и ботаники, фармацевтической технологии, экономики и управления фармации, фармацевтической, токсикологической и аналитической химии.
Публикации.
Основное содержание работы отражено в 11 публикациях, 1 из которых - в международной печати, 4 публикации - в журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ для публикации основных научных трудов.
Объём и структура диссертации.
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (1 глава), экспериментальной части (6 глав), общих выводов, списка цитируемой литературы. Материалы диссертации изложены на 127 страницах машинописного текста, содержат 12 рисунков, 37 таблиц и 6 формул. Список цитируемой литературы включает 268 источников, из которых 128 на иностранных языках.
В первой главе (обзор литературы) приводятся обобщенные данные по физико-химическим и фармакологическим свойствам препаратов группы фторхинолонов,
методам их анализа, а также сведения по использованию технологии направленного транспорта лекарственных препаратов в организм.
Вторая глава включает в себя материалы и методы исследования, использованные в работе.
Третья глава диссертации посвящена качественному анализу исследуемых препаратов и разработке методик их количественного анализа в субстанциях и в таблетированной лекарственной форме.
Четвертая глава включает экспериментальные данные по разработке методик изолирования и количественного определения фторхинолонов в плазме крови и гемолизате клеток крови.
В пятой главе проводится сравнение предлагаемых методик спектрофотометрического определения фторхинолонов с существующими методиками их анализа методом ВЭЖХ.
Шестая глава посвящена вопросам выделения и получения клеточных форм фторхинолонов, разработке методик их количественного определения, изучения стабильности и устойчивости к десорбции.
Седьмая глава содержит данные о иммунометаболической активности клеточных форм фторхинолонов в условиях токсического поражения почек, осложненного стафилококковой инфекцией.
