Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Оксибензол и его монометильные производные как объекты химического и химико- токсикологического исследования 13
1.1. Физические свойства и применение объектов исследования 13
1.2.Получение исследуемых соединений 15
1.3 Токсикологическая характеристика 16
1.4. Идентификация объектов исследования 21
1.5. Количественное определение оксибензола, его монометильных производных и близких по структуре оксиаренов 24
1.6. Изолирование из различных субстратов и очистка 29
1.7. Метаболизм рассматриваемых соединений, распределение их в организме теплокровных и выделение 31
Экспериментальная часть
Приборы и реактивы, материалы, посуда 33
Глава 2. Качественный анализ оксибензола и его монометильных производных 40
2.1 Хроматографические методы 40
2.2. Спектральные методы 45
2.3. Хромогенные реакции 50
Выводы ко второй главе ; 57
Глава 3. Количественное определение оксибензола и его монометильных производных 60
3.1. Определение методом ВЭЖХ 60
3.1.1. Определение с использованием нормальнофазного сорбента 60
3.1.2. Определение с использованием обращеннофазного сорбента 66
3.2. Определение фотометрическими методами 69
3.2.1. Определение методом УФ-спектрофотометрии 69
3.2.2. Определение на основе цветных реакций 70
Выводы к третьей главе 81
Глава 4. Экстракционные и хроматографические методы выделения и очистки оксибензола и его монометильных производных 83
4.1. Особенности экстрагирования из водных растворов 83
4.2. Очистка с применением хроматографии и особенности хроматографической активности анализируемых оксиаренов 100
4.2.1. Хроматографирование на колонке с силикагелем 100
4.2.2. Хроматографирование в тонком слое сорбента «Silpearl» .103
4.3. Оценка эффективности очистки извлечений из контрольных
образцов биологического материала 104
Выводьгк четвертой главе 109
Глава 5. Определение рассматриваемых монооксиаренов и их метаболитов в биологическом материале 111
5.1. Сравнительное изучение изолирования исследуемых веществ из биологического материала различными изолирующими агентами 111
5.2. Определение рассматриваемых монооксиаренов и ряда их метаболитов в биологическом материале при использовании в качестве изолирующего агента этилацетата 112
5.3. Методики определения исследуемых монооксиаренов и отдельных их метаболитов в биологическом материале 116
5.3.1. Методика определения оксибензола и его монометильных производных 119
5.3.2. Методика определения метаболитов оксибензола и его монометильных производных 131
5.4. Распределение отдельных оксипроизводных бензола в организме теплокровных животных 137
5.4.1. Распределение оксибензола 138
5.4.2. Распределение 4-метилоксибензола 144
5.5. Сохраняемость рассматриваемых монооксиаренов и их метаболитов 149
5.5.1. Сохраняемость оксибензола и его монометильных производных 150
5.5.2. Сохраняемость 1,2- и 1,4-диоксибензолов 153
5.5.3. Сохраняемость 4-оксибензойной кислоты 157
Выводы к пятой главе 160
Общая схема исследования биологического материала при отравлении оксибензолом и его монометильными производными 163
Общие выводы 169
Список использованных литературных источников...
- Идентификация объектов исследования
- Хромогенные реакции
- Определение с использованием обращеннофазного сорбента
- Очистка с применением хроматографии и особенности хроматографической активности анализируемых оксиаренов
Введение к работе
Актуальность темы. Оксибензол и его монометильные производные широко применяются в качестве полупродуктов в ряде важнейших органических синтезов, известны как лекарственные средства, стабилизаторы, реактивы. Данная группа соединений является побочными продуктами коксово-газовой промышленности.
Оксибензол и его монометильные производные обладают значительной токсичностью по отношению к теплокровным животным и человеку. Описаны многочисленные случаи отравления оксиаренами, в том числе и с летальным исходом. Отравления могут происходить при непосредственном контакте с веществами в процессе производства , хранения и применения, вследствие аварий , техногенных катастроф, в условиях загрязнения объектов окружающей среды отходами химических производств, выбросами в атмосферу и сточными водами предприятий , употребления недоброкачественных продуктов питания, а также при суицидных попытках.
Имеются данные, согласно которым LD50 оксибензола и его
монометильных производных для мышей и крыс составляет приблизительно 400-500 мг/кг, летальные дозы оксибензола и крезолов для человека соответственно около 14 мг/кг и 150 мг/кг . Большие объемы промышленного синтеза, широкое применеие оксибензола и его метальных производных , их высокая токсичность, наличие случаев смертельного отравления обусловливает необходимость изучения этих соединений в химико-токсикологическом отношении.
До настоящего времени остаются недостаточно разработанными вопросы изолирования оксибензола и монометилоксибензолов из объектов биологического происхождения , их обнаружения, идентификации и
количественного определения. В доступной литературе отсутствуют данные по сохраняемости рассматриваемых соединений в трупном материале.
Исходя из вышеизложенного, разработка методики химико-токсикологического исследования оксибензола и его монометильных производных является актуальной.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей диссертации является разработка методики химико-токсикологического исследования оксибензола и его монометильных производных.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Определить особенности хроматографической активности исследуемых веществ и их основных метаболитов в тонких слоях и колонках сорбентов. Выявить оптимальные условия идентификации и количественного определения оксибензола , его монометильных производных и их основных метаболитов методом ТСХ и ВЭЖХ .
Изучить возможность применения спектрофотометрии в УФ-, видимой, и ИК-областях для идентификации рассматриваемых соединений в субстанциях и в извлечениях из биологических объектов.
Исследовать особенности взаимодействия оксибензола и его монометильных производных с рядом цветореагентов. Показать возможность применения отдельных реакций электрофильного замещения и образования молекулярных продуктов типа п-донор - п-акцептор в условиях анализа рассматриваемых соединений.
Провести изучение возможности применения жидкость-жидкостной экстракции и хроматографии для концентрирования, разделения и очистки объектов исследования.
Исследовать особенности изолирования рассматриваемых веществ различными группами изолирующих агентов из биологического материала, разработать схему очистки извлечений.
Изучить характер распределения объектов исследования в организме теплокровных животных.
Исследовать сохраняемость рассматриваемых соединений в гнилостно разлагающемся трупном материале.
Научная новизна. Изучены особенности хроматографической
активности оксибензола, его монометильных производных и их основных
метаболитов в сорбентах с гидроксилированной поверхностью и
поверхностью с привитыми алкильными радикалами , выявлены
оптимальные условия и расчитаны отдельные параметры
хроматографирования рассматриваемых соединений в тонких слоях и колонках сорбентов.
По результатам исследования разработаны методики идентификации и количественного определения оксибензола, его монометильных производных и их основных метаболитов методами ТСХ и ВЭЖХ.
Исследованы некоторые особенности электронных и ИК-спектров рассматриваемых соединений. Рассчитан ряд основных оптических характеристик электронных спектров для повышения селективности качественного спектрофотометрического определения исследуемых веществ.
Показана возможность идентификации и количественного определения оксибензола и его монометильных производных на основе образования молекулярных продуктов и ионных ассоциатов в хромогенных реакциях с хлоридом 2,3,5-трифенилтетразолия, родамином Ж после предварительного переведения анализируемых веществ в их полинитропроизводные.
Исследованы особенности экстрагирования рассматриваемых веществ из водных растворов в зависимости от рН среды, природы органических экстрагентов, насыщения экстрагентов водой, присутствия электролитов в водном слое.
Для извлечения оксибензола и его монометильных производных из биологического материала в качестве изолирующего агента предложен этилацетат. На основе использования в качестве изолирующего агента этилацетата и очистки методом хроматографии или сочетанием методов экстракции и хроматографии разработаны методики определения рассматриваемых соединений в тканях трупных органов и биожидкостях, приемлемые для исследования свежего и гнилостно измененного трупного материала.
На примере оксибензола и его 4-монометильного производного показаны особенности распределения монооксиаренов в органах и биожидкостях теплокровных (кролики).
Изучена сохраняемость рассматриваемых соединений в трупном материале в зависимости от продолжительности процесса сохранения .
На основании проведенных исследований разработана общая схема исследования биологического материала при отравлении оксибензолом и его монометильными производными.
Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований разработаны и внедрены:
-методики изолирования из биологического материала, очистки,
идентификации, и количественного определения моно- и
динитропроизводных 2- и 4-метилоксибензолов (информационное письмо «Об определении нитрафена при судебно-химическом исследовании биологического материала» (утверждено Российским центром судебно-медицинской экспертизы МЗ РФ, № 330 от 19. 06. 2000).- Москва, 2000;
-методики идентификации оксибензола, его монометильных производных и их основных метаболитов методами ТСХ и ВЭЖХ (внедрены в.токсикологической лаборатории Ейской больницы (г.Ейск, Краснодарский край), акты внедрения № 235 и № 236 от 21 октября 2003 г.;
-методики идентификации и количественного определения оксибензола и его монометильных производных на основе хромогенных реакций с производными ксантена и тетразолия после предварительного введения в структуру анализируемых веществ электрофильных заместитетелей (нитрогруппы) (внедрены в учебный и научный процесс кафедры фармацевтической химии, акты внедрения № 219 и № 220 от 2 ноября 2003 г., и кафедры органической химии, акты внедрения № 224 и № 225 от 7 октября 2003 г., Курского государственного медицинского университета;
-методика идентификации и количественного определения
оксиароматических соединений по реакции с гидроксидом натрия после
предварительного нитрования (методические рекомендации
«Идентификация и количественное определение лекарственных средств производных 8-оксихинолина» (разрешены к опубликованию цикловой методической комиссией физико-химических и фармацевтических дисциплин Курского государственного медицинского университета от 01.12.99 г., протокол №2).-Курск, 1999.
На защиту выносятся:
-результаты исследования хроматографической подвижности оксибензола и его монометильных производных и их основных метаболитов в тонких слоях и колонках сорбентов с гидроксилированной и привитой поверхностью;
-особенности светопоглощения исследуемых веществ в УФ-видимой и ИК-областях спектра;
-оптимальные условия взаимодействия оксибензола и его монометильных производных с рядом цветореагентов;
-методики идентификации и количественного определения рассматриваемых соединений хроматографическими и фотометрическими методами;
-результаты изучения особенностей экстракции исследуемых веществ из водных растворов;
-методики изолирования из биологического материала и очистки оксибензола и его монометильных производных;
-особенности распределения оксибензола и его 4-метилпроизводного в организме теплокровных;
-сохраняемость монооксиаренов и их основных метаболитов в трупном материале.
Апробация работы. Основные положения работы апробированы на III Всероссийской конференции «Экоаналитика-98» с международным участием (Краснодар, 1998 г); на V Всероссийском съезде судебных медиков (Москва-Астрахань, 2000 г); на Всероссийской конференции «Экоаналитика -2000» с международным участием (Краснодар, 2000 г); на Всероссийской конференции «Человек и лекарство» (Москва, 2003 г); на Международном Форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2003г).
Связь задач исследования с проблемным плано м фармацевтических наук. Работа выполнялась в соответствии с планом научных исследований кафедры фармацевтической химии Курского государственного медицинского университета (номер государственной регистрации 01. 20. 0004473), отраслевой научно-исследовательской программой № 35 МЗ РФ.
Публикации. Основное содержание работы отражено в 12 публикациях, одна из которых - патент на изобретение.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, пяти глав, общих выводов, общей схемы исследования и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 198 страницах, содержит 18 рисунков, 52 таблицы. Список цитируемой литературы включает 222 источника, из которых 121 на русском и 101 на иностранных языках.
В первой главе (обзор литературы) приводятся известные данные об оксибензоле, его монометильных производных, их основных метаболитах и ряде других близких по структуре веществ как объектах химического и химико-токсикологического исследования.
Во второй главе рассмотрены вопросы идентификации анализируемых веществ хроматографическими, спектральными методами, а также хромогенными реакциями.
В третьей главе представлены результаты исследований по количественному определению рассматриваемых веществ.
Четвертая глава посвящена вопросам выделения и очистки анализируемых соединений методами экстракции и хроматографии.
В пятой главе приведены результаты изучения особенностей изолирования рассматриваемых оксиаренов из биологического материала и их последующего определения в получаемых извлечениях, рассмотрены
вопросы распределения в организме теплокровных и сохраняемости анализируемых веществ в биологических объектах.
Идентификация объектов исследования
Оксиарены со свободным по отношению к оксигруппе пара-положением могут быть идентифицированы на основе реакций конденсации с некоторыми аминами с последующим окислением образующихся продуктов [30,143,149,164,166].
Данные методики неселективны по отношению к отдельным оксиаренам. В ряде случаев они трудоемки и длительны по выполнению.
Окрашенный продукт образуется при обработке оксибензола смесью оксида иода и диметил-п-фенилендиамина в щелочной водно-этанольной среде [11]. Методика отличается относительной длительностью выполнения анализа.
Возможна идентификация ряда монометильных и хлорпроизводных оксибензола по образованию окрашенных комплексов с ионами Со 2+ после предварительного нитрозирования [25].
Для идентификации оксиаренов известно применение реакций электрофильного замещения, цветореагентами в которых могут являться N -хлоримиды [32, 203] , соли диазония [14, 112, 114, 146] , галогены, азотная кислота и ее соли [175].
В целом описанные реакции мало селективны по отношению к отдельным оксипроизводным аренов.
Показана возможность определения метаболитов оксибензола (1,2- и 1,4-диоксибензола) на основе цветной реакции с ионами Си2 и пиридином [147]. Методика недостаточна избирательна для анализируемых диоксибензолов. Описана хромогенная реакция 1,2-диоксибензола с флороглюцином в присутствии этанольного раствора гидроксида натрия [198]. Окрашенный продукт отличается низкой стабильностью.
1,2-Диоксибензол обнаруживают по образованию красного окрашивания при обработке нитритом натрия в уксусно-кислом растворе и последующей нейтрализации реакционной смеси избытком щелочи [175]. Методика недостаточно хорошо воспроизводима и относительно малочувствительна.
2. Идентификация хроматографическими методами
Описаны варианты определения оксибензола и алкилоксибензолов методом ВЭЖХ на обращенно-фазных сорбентах (привитые фазы С-8 и С-18) с использованием сильно полярных элюентов и различных детекторов [69, 124,165,185,190,219].
Оксибензол и ряд его окси- и метальные производные могут быть идентифицированы методом обращеннофазной ВЭЖХ в режиме градиентного элюирования [138, 148, 196], а также после предварительного получения соответствующих производных в ряде реакций [44, 183,221 ]. Оксибензол и отдельные его окси-, метил- и галогенпроизводные могут быть идентифицированы по характерным значениям времени или объемов удерживания методом нормальнофазной ВЭЖХ с применением малополярных элюентов, и УФ-детектора [173]. Описанные методики характеризуются недостаточно высокой селективностью.
Известен ряд других методик, позволяющих идентифицировать оксибензол и его производные методом ВЭЖХ [37,104,177].
Предложены методики газохроматографического определения оксиаренов в колонках с хромасорбом [101], хроматоном NAW, содержащим 5% ПДЭТС и 1% ортофосфорной кислоты [45, 97] , сорбентом Envir Elut [145].
Для определения оксибензола, его монометильных и монохлорпроизводных методом газовой (газожидкостной ) хроматографии могут использоваться в качестве неподвижных фаз фенилметилсиликоновое масло, модифицированные фенантролинатом и диметилглиоксиматом никеля
или ацетилацетонатом никеля ПЭГ-20 М и ПМС-100, а также химически связанные силикон OV-1701 или 8Е-54 [75, 107, 122,171].
Качественное определение ряда окси- аренов может быть осуществлено методом газовой хроматографии после после предварительного их переведения в алкилсилиловые эфиры, дабсилаты, пентафторбензильные и пентафторбензоильные производные [ 24, 26, 115, 188], а также в ацетильные или О-алкильные производные [127, 140, 141, 207].
Известен ряд других вариантов применения метода газовой хроматографии как для определения оксибензола [ 68,169 ] , так и отдельных его производных [51,59,113,118]. Описаны варианты опредения оксибензола и ряда его метальных и хлорпроизводных методом ионообменной хроматографии [106, 214]. Идентификация оксипроизводных ароматического ряда непосредственно или после проведения цветных реакций может быть осуществлена в тонких слоях различных сорбентов [60, 116, 175, 204]. Предложена методика обнаружения оксибензола путем хроматографирования на бумаге «Ватман №1» с использованием фенолоксидазы в качестве проявителя [180].
Хромогенные реакции
Рассмотрена возможность применения ИК-спектрофотометрии для идентификации оксибензола , его монометильных производных и их основных метаболитов.
В процессе проведения эксперимента вещества, имеющие кристаллическую структуру, мелко измельчали и запрессовывали в таблетки с бромидом калия. В случае работы с жидкими веществами использовали их тонкие пленки.
Измерения проводили на РЖ-спектрофотометре «Paragon-500» IR FT фирмы «Perkin Elmer» и ИК-Фурье-спектрометре Nikolet Magna-750 (США).
В ИК-спектрах рассматриваемых соединений определены частоты, соответствующие максимумам отдельных полос поглощения , проведено отнесение отдельных полос к тому или иному виду колебаний в молекулах. Полученные результаты представлены в таблицею.
Как свидетельствуют полученные данные, в высокочастотной части спектров исследуемых веществ отмечается наличие полосы, обусловленной валентными колебаниями ОН-группы. Положение такой полосы у разных соединений рассматриваемой группы соответствует области частот 3432-3263 см 1.
В спектрах монометильных производных оксибензола присутствуют полосы валентных колебаний С-Н : ассиметричных -СН3 (интервал 3021-3040 см"1) и симметричных СН3 (интервал 2922-2924 см"1) колебаний С-Н У ряда рассматриваемых соединений (4-метилоксибензола, 1,2-диоксибензола, 4-оксибензойной кислоты), в интервале частот 1946-1694 см"1 отмечается присутствие ряда полос, которые можно отнести к обертонам и комбинационным тонам, свойственным производным бензола. Для каждого соединения число таких полос и их положение индивидуально.
Особенностью РЖ-спектра 4-оксибензойной кислоты является, в частности наличие в нем полосы, соответствующей колебаниям группы -С=0 , с максимумом около 1724 см"1.
Колебательные спектры всех рассматриваемых веществ в интервале частот 1623-1460 см 1 содержат полосы валентных колебаний С=-=С (ароматическое ядро).
Наличие в структуре оксибензола, его метальных производных и их метаболитов гидроксильной группы проявляется присутствием в ИК-спектрах полосы деформационных внеплоскостных колебаний О-Н в области частот 1389-1333 см"1 В спектрах исследуемых соединений можно обнаружить полосу валентных колебаний =С-0 (положение максимумов в интервале частот 1247-1239 см 1).
Полосы плоскостных деформационных колебаний = =С-Н у объектов исследования имеют максимумы поглощения в области частот 1218 -1000 см"1, полосы внеплоскостных деформационных колебаний - в области частот 877-689 см _1.
Положение полос плоскостных и внеплоскостных деформационных колебаний = С-Н у каждого из рассматриваемых веществ определяется числом и взаимным расположением заместителей в бензольном ядре.
Особенности химической структуры оксибензола , его 2-, 3- и 4-монометильных производных, а также их основных метаболитов обусловливают способность этих веществ к образованию окрашенных продуктов в реакциях с рядом цветореагентов .
При обработке рассматриваемых оксиаренов нитрующими агентами в определенных условиях в структуру анализируемых веществ могут быть введены одна или несколько нитрогрупп. Получаемые при этом нитроароматические соединения, содержащие одновременно электроноакцепторные (нитро-) и электронодонорные (гидроксо-) группы в водно-щелочной среде образуют интенсивно окрашенные аци-нитросоли. Если электроноакцепторная (-NO2) и электронодонорная (-ОН) группы в молекуле нитрооксиарена находятся в орто- или пара-положении по отношении друг к другу, то возникает явление сопряжения, и аци-нитросоль такого вещества бывает более интенсивно окрашена.
С целью определения оптимальных условий нитрования исследуемых оксиаренов рассмотрен ряд нитрующих агентов: 10% раствор нитрата калия в концентрированной ( /0=1,828 - 1,834 г/см3 ) серной кислоте; смесь азотной (р = 1,368-1,393 г/см ) и серной (р = 1,828-1,834 г/см3) кислот, взятых в объемном отношении 1:1; раствор азотной (р = -у -2 1,368-1,393 г/см ) кислоты ; смесь азотной (р = 1,368-1,393 г/см ) кислоты и уксусного ангидрида, взятых в объемном отношении 1:1; 5% раствор нитрата ртути в азотной (р =1, 368-1,393 г/см3) кислоте; насыщенный раствор нитрата меди в уксусном ангидриде.
Сравнительное изучение нитрования рассматриваемых оксиароматических соединений перечисленным рядом нитрующих агентов поводилось на примере оксибензола и его метальных производных. Процесс нитрования осуществлялся в двух температурных режимах - при 20-22 С и при 98-100 С. Параллельно нитрованию подвергали субстанции веществ и эти же вещества, находящиеся в растворенном состоянии в воде.
Установлено, что для нитрования монооксиаренов оптимальным является использование в качестве нитрующего агента 10% раствора нитрата калия в концентрированной (р = 1,828-1,834 г/см3) серной кислоте или смеси азотной (р = 1,368-1,393 г/см ) и серной (р =1,828-1,834 г/см3) кислот (1:1). В этом случае при достаточно высокой скорости протекании процесса из каждого монооксиарена образуется практически только одно полинитропроизводное и наблюдается наибольший выход продуктов нитрования .
Определение с использованием обращеннофазного сорбента
Определение оксибензола и 3-метилоксибензола в виде их полинитропроизводных. Установлено, что продукты нитрования оксибензола и 3-метилоксибензола (соответственно 2,4,6-динитрооксибензол и 3-метил-2,4,6-тринитрооксибензол) могут быть определены методом ВЭЖХ с использованием обращеннофазного сорбента «Сепарон С-18».
Построение градуировочных графиков В каждом отдельном случае в ряд выпарительных чащек вносили различные последовательно возрастающие количества анализируемого соединения в незначительном объеме хлороформа. После испарения органического растворителя в токе воздуха при комнатной температуре в каждую выпарительную чашку добавляли по 0,5 мл 10% раствора нитрата калия в концентрированной серной кислоте и выдерживали реакционные смеси в течение 5 минут в условиях нагревания при 98-100 С. По истечении указанного времени в каждый реакционный раствор вносили 4,5 мл воды и количественно переносили образующийся раствор в делительную воронку. Содержимое воронки экстрагировали дважды порциями этилацетата по 5 мл каждая. Этилацетатные извлечения объединяли, фильтровали через слой безводного сульфата натрия массой 0,8 г. Слой сульфата натрия дополнительно промывали 4 мл этилацетата. Отдельные фильтраты объединяли, экстрагент испаряли. Остаток растворяли в 25 мл элюента. В хроматограф вводили 8 мкл полученного раствора. Процесс хроматографирования осуществляли на приборе «Милихром» в колонках размером 64x2 мм КАХ-2 или КАХ-4, заполненных сорбентом «Сепарон С-18». В качестве подвижной фазы использовали систему растворителей ацетонитрил-вода (2:8). Скорость подачи элюента составляла 100 мкл/мин, скорость диаграммной ленты -720 мм/ч. Масштаб регистрации 0,4ед. о. п., время измерения 0,4с. Оптическую плотность регистрировали при длине волны, соответствующей максимуму поглощения полинитропроизводного анализируемого вещества. Рассчитывали площади хроматографических пиков. По результатам вычислений строили градуировочный график, отражающий прямопропорциональную зависимость между концентрацией исследуемого вещества и площадью хроматографического пика. Рассчитывали уравнение градуировочного графика, которое имеет вид: S = kC + Ь, где S- площадь хроматографического пика, см2; С- концентрация определяемого вещества в хроматографируемой пробе, мкг; значения коэффициентов к и b и аналитических длин волн представлены в таблице 17. Методика определения
Около 0,1 г (точная навеска) анализируемого вещества растворяли в 50 мл хлороформа. 1 мл полученного раствора вносили в выпарительную чашку и испаряли растворитель в токе воздуха при комнатной температуре. Полученный остаток обрабатывали 0,5 мл 10% нитрата калия в концентрированной серной кислоте в течение 5 минут при 98-100 С. По истечении указанного времени в реакционный раствор вносили 4,5 мл воды и количественно переносили образующийся раствор в делительную воронку. Содержимое воронки экстрагировали дважды порциями этилацетата по 5 мл каждая. Этилацетатные извлечения объединяли, фильтровали через слой безводного сульфата натрия массой 0,8 г. Слой сульфата натрия дополнительно промывали 4 мл этилацетата. Отдельные фильтраты объединяли, экстрагент испаряли. Остаток растворяли в 15-20 мл элюента, количественно переносили образующийся раствор в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводили до метки элюентом. 8 мкл полученного раствора вводили в хроматограф и далее поступали по схеме, описанной для построения градуировочных графиков. Количественное содержание определяли по уравнению градуировочного графика и пересчитывали на навеску. Результаты представлены в таблице 18.
Поглощение рассматриваемых веществ в среде этанола характеризуется присутствием интенсивных полос (е « 1767-3325) с максимумами в области длин волн 275-298нм. Это позволяет проводить количественное определение исследуемых соединений по их собственному поглощению в УФ-части спектра.
Установлено, что оптическая плотность растворов оксиаренов в этаноле остается стабильной по крайней мере в течение 16 часов.
Построение градуировочных графиков В каждом случае готовили серию стандартных растворов, содержащие различные, последовательно возрастающие количества анализируемого соединения, в 95% этаноле. Оптическую плотность стандартных растворов измеряли на спектрофотометре СФ-26 при длине волны, соответствующей максимуму наиболее длинноволновой полосе поглощения, в кварцевых кюветах с толщиной рабочего слоя 10 мл. Измерения проводили на фоне 95% этанола. Основываясь на результатах измерения, строили градуировочный график, отражающий прямопропорциональную зависимость между концентрацией определяемого вещества и оптической плотностью. Рассчитывали уравнения градуировочного графика, которое имеет общий вид : A=kC + b, где А- оптическая плотность, С - концентрация анализируемого вещества в фотометрируемом растворе, мкг/мл. Значения коэффициентов к и b и аналитических длин волн представлены в таблице 19.
Методика определения в субстанции Около 0,025 г (точная навеска) анализируемого вещества растворяли в 10-15 мл этанола в мерной колбе вместимостью 25 мл и доводили объем раствора в колбе до метки этанолом (раствор А). Для оксибензола и его монометильных производных из полученного раствора готовили раствор с приблизительной концентрацией 0,004 %. При этом 2 мл раствора А вносили в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводили до метки этанолом (раствор Б).
Для диоксиаренов и 4-оксибензойной кислоты из раствора А готовили раствор с приблизительной концентрацией 0,002 %. При этом 1 мл раствора А того или иного вещества вносили в мерную колбу вместимостью 50 мл (раствор Б). Оптическую плотность раствора Б измеряли на спектрофотометре СФ-26 при длине волны, соответствующему максимуму поглощения анализируемого вещества, используя кювету с толщиной рабочего слоя 10 мл. Измерения проводили на фоне этанола. Количественное содержание того или иного оксиарена определяли по уравнению калибровочного графика и пересчитывали на навеску. Результаты определения представлены в таблице 20.
Очистка с применением хроматографии и особенности хроматографической активности анализируемых оксиаренов
При изучении хроматографического поведения рассматриваемых оксиаренов в колонке с силикагелем в качестве подвижных фаз рассмотрены системы растворителей гексан-диэтиловый эфир (6:4) и гексан-диэтиловый эфир (2:8). В процессе исследования использовалась стеклянная колонка размером 240x15 мм, запорлненная 20г силикагеля L 40/100ц производства фирмы « Chemapol» (Чехия).
А. Хроматографирование монооксиаренов Селективное хроматографирование оксибензола и его монометильных производных в присутствии группы их основных метаболитов возможно с использованием подвижной фазы гексан-диэтиловый эфир (6:4).
Около 0,025 г (точная навеска) анализируемого монооксиарена растворяли в 10 мл смеси растворителей гексан-диэтиловый эфир (6:4). 2 мл полученного раствора вносили в колонку и, после полного вхождения раствора в слой сорбента начинали прибавлять элюент.
Выходящий из колонки элюат собирали фракциями по 2 мл каждая. Вещества обнаруживали во фракциях путем нанесения 1-2 капель элюата из каждой фракции на пластину "Силуфол" UV-254 и хроматографировали методом ТСХ с использованием подвижной фазы системы растворителей гексан-пропанол-2 (20:1).
Вещества на хроматограммах проявляли в УФ-свете. Результаты хроматографирования оксибензола и его монометильных производных в колонке с силикагелем представлены в таблице 38. Б. Хроматографирование метаболитов монооксиаренов Селективное хроматографирование метаболитов монооксиаренов в присутствии монооксиаренов возможно путем последовательного элюирования системами растворителей гексан-диэтиловый эфир (6:4) и гексан-диэтиловый эфир (2:8). Элюирование системой гексан-диэтиловый эфир (6:4) осуществляется до момента, соответствующего полному выходу из колонки всех рассматриваемых монооксиаренов. После этого в колонку начинает подаваться подвижная фаза гексан-диэтиловый эфир (2:8).
Около 0,025 г (точная навеска) анализируемого диоксиарена или 4-оксибензойной кислоты растворяли в 10 мл диэтилового эфира. 2 мл полученного раствора вносили в колонку на поверхность сорбента, испаряя растворитель в токе воздуха. После полного испарения растворителя начинали прибавлять подвижную фазу гексан-диэтиловый эфир (6:4).
Выходящий из колонки элюат собирали фракциями по 2 мл каждая. После истечения из колонки 30 мл элюата остаток элюента, находящийся над слоем сорбента, удаляли, а вместо него в колонку начинали прибавлять подвижную фазу гексан-диэтиловый эфир (2:8). Выходящий из колонки элюат собирали фракциями по 2 мл каждая. Вещества обнаруживали во фракциях путем нанесения 1-2 капли элюата из каждой фракции на пластину «Силуфол» UV-254 и хроматографировали методом ТСХ с использованием в качестве подвижной фазы системы растворителей гексан-диэтиловый эфир (2:8). Вещества на хроматограммах проявляли в УФ-свете.
Результаты хроматографирования основных метаболитов оксибензола и его монометильных производных в колонке с силикагелем представлены в таблице 38. В. Количественное определение моно о к с и арено в и их метаболитов в э л ю атах Фракции элюата, содержащее то или иное анализируемое вещество, объединяли, испаряли до сухого остатка в токе воздуха при комнатной температуре. Остаток растворяли в 10-15 мл этанола, количественно переносили полученный раствор в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводили до метки. 1,0-2,5 мл этанольного раствора вносили в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводили до метки этанолом и фотометрировали образующийся раствор.
Количественное определение монооксиаренов и их метаболитов осуществляли по интенсивности их поглощения в среде этанола в соответствии с методиками, описанными в разделе 3.2.1.
