Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы
1.1. Торф как источник биологически активных веществ 13
1.2. Химические свойства гуминовых кислот 15
1.3. Биологическая активность гуминовых кислот 20
Экспериментальная часть:
ГЛАВА II. Материалы и методы исследования
2.1. Объекты исследования 34
2.2. Методы исследования 35
2.2.1. Анализ группового состава органического вещества торфов 35
2.2.2. Методы качественного и количественного определения биологически активных веществ торфов 39
2.2.2.1. Качественное определение биологически активных веществ 39
2.2.2.2. Количественное определение биологически активных веществ 43
2.2.3. Методы химического исследования гуминовых кислот торфов 47
2.2.3 Л. Элементный анализ 47
2.2.3.2. Ультрафиолетовая спектроскопия 47
2.2.3.3. Инфракрасная спектроскопия 48
2.2.3.4. Спектроскопия электронного парамагнитного резонанса 48
2.2.3.5. Спектроскопия протонного и ядерного магнитного резонанса 48
2.2.3.6. Молекулярно-массовое распределение 49
2.2.3.7. Определение содержания кислых функциональных групп 49
2.2.3.8. Определение содержания тяжелых металлов методом нейтронно-
активационного анализа 50
2.2.4. Методы исследования биологической активности гуминовых кислот 51
2.2АЛ. Экспериментальные животные 51
2.2.4.2. Оценка острой токсичности 51
2.2.4.3. Патоморфологическое исследование на крысах 52
2.2.4.4. Исследование динамики концентраций в сыворотке крови 52
2.2.4.5. Исследование влияния на реологические свойства крови 53
2.2.4.6. Оценка антигипоксической активности 54
2.2.4.7. Исследование влияния гуминовых кислот на окислительное фосфорилирование в митохондриях печени и головного мозга мышей при гипоксии 55
2.2.4.8. Оценка гепатозашитной активности 57
2.3. Статистическая обработка результатов 58
ГЛАВА III. Химико-фармакогностическое исследование торфов и строения гуминовых кислот
3.1. Анализ группового состава органического вещества и ботанический состав торфов 59
3.2. Общий фитохимический анализ торфов 63
3.3. Исследование химической структуры гуминовых кислот 67
3.3.1. Элементный анализ гуминовых кислот 68
3.3.2. Спектральный анализ гуминовых кислот 71
3.3.2.1. Ультрафиолетовая спектроскопия гуминовых кислот 71
3.3.2.2. Оптические свойства гуминовых кислот 73
3.3.2.3. Инфракрасная спектроскопия гуминовых кислот 75
3.3.2.4. Спектроскопия электронного парамагнитного резонанса гуминовых кислот 82
3.3.2.5. Спектроскопия протонного и ядерного магнитного
резонанса гуминовых кислот 86
ГЛАВА IV. стандартизация биологически активной субстанции для проекта фармакопейной статьи предприятия «гуминовые кислоты торфа» 91
4.1.Требования к сырьевому источнику гуминовых кислот - низинному древесно-травяному виду торфа 93
4.1.1. Анализ морфологических признаков сырья 93
4.1.2. Товароведческая характеристика сырья 94
4.2. Определение подлинности и качества гуминовых кислот низинного древесно-травяного вида торфа 95
4.2.1. Разработка методики качественного обнаружения гуминовых кислот методом инфракрасной спектроскопии 95
4.2.2. Методика исследования доброкачественности гуминовых кислот методом элементного анализа 97
4.2.3. Разработка методики качественного обнаружения гуминовых кислот методом спектроскопии в ультрафиолетовой области 97
4.2.4. Определение молекулярно - массового распределения гуминовых кислот методом эксклюзионной хроматографии 99
4.2.5. Определение количественного содержания гуминовых кислот в сырье гравиметрическим методом 100
4.2.6. Количественное определение гуминовых кислот в гуминовых
препаратах и биологических жидкостях методом УФ-спектроскопии 101
4.3. Определение содержания тяжелых металлов и микробиологической чистоты гуминовых кислот низинного древесно-травяного вида торфа 101
ГЛАВА V. Фармако-токсикологическое изучение гуминовых кислот низинного древесно-травяного торфа месторождения «клюквенное»
5.1. Исследование острой токсичности гуминовых кислот 103
5.1.1. Патоморфологическое исследование погибших животных 105
5.1.2. Исследование кардиотоксического действия гуминовых кислот 106
5.1.3. Исследование влияния гуминовых кислот на реологические свойства крови 108
5.2. Исследование динамики концентраций гуминовых кислот в сыворотке крови крыс 109
5.3. Исследование цитопротективных свойств гуминовых кислот 113
5.3.1. Оценка гепатопротективных свойств гуминовых кислот 113
5.3.2 Исследование антигипоксической активности гуминовых кислот 121
5.3.2.1. Исследование влияния гуминовых кислот на выживаемость животных при различных гипоксических состояниях 121
5.3.2.2. Исследование влияния гуминовых кислот на окислительное фосфорилирование в митохондриях в условиях гипоксии 124
Заключение 136
Выводы 141
Список литературы
- Биологическая активность гуминовых кислот
- Методы качественного и количественного определения биологически активных веществ торфов
- Исследование химической структуры гуминовых кислот
- Определение подлинности и качества гуминовых кислот низинного древесно-травяного вида торфа
Введение к работе
Актуальность темы: Поиск новых сырьевых ресурсов биологически активных веществ (БАВ) природного происхождения для разработки на их основе новых лекарственных препаратов является актуальной задачей современной фармации. Одним из перспективных источников БАВ является торф, содержащий уникальный комплекс биологически активных соединений (гуминовые кислоты, углеводы, полифенолы и др.) и обладающий значительными, и что немаловажно, возобновляемыми сырьевыми ресурсами. Являясь продуктом частичного распада болотных растений, торф сохраняет присущие растительным биоценозам те или иные физиологически активные соединения, устойчивые к биологическим разрушениям, и пополняется новыми веществами как растительного происхождения, так и метаболитами жизнедеятельности микро- и макроорганизмов, населяющих торфяную залежь. Специфическую и наиболее представительную в количественном отношении группу БАВ торфа составляют гуминовые кислоты (ГК), являющиеся сложной смесью высокомолекулярных и полифункциональных соединений алициклической, гидроароматической, ароматической и гетероциклической природы.
В настоящее время в научной литературе имеется большое количество сведений о биологической активности солей ГК и применении препаратов на их основе в медицине и ветеринарии. Фармакологические свойства и токсичность нативных ГК практически не изучены. Кроме того, необходимо отметить, что химическая структура и фармакологические эффекты гуминовых препаратов могут существенно различаться в зависимости от происхождения торфа, способов извлечения, очистки и фракционирования препаратов. Эти обстоятельства делают практически невозможными попытки внеэкспериментального прогнозирования особенностей их токсических и фармакологических свойств по общим элементам структуры, и, соответственно,
обуславливают необходимость химической и биологической стандартизации каждого из образцов ГК различного происхождения.
По объемам запасов торфа, Томская область занимает 2-е место в России (32,8 млр. тонн, что составляет 20,9 % Российских ресурсов) [73, 74,260].
Таким образом, недостаточная изученность химической структуры и биологической активности нативных ГК торфов Томской области, наряду с их огромными сырьевыми ресурсами, определяет необходимость их системного химико-фармакологического изучения.
ЦЕЛЬ: химико-фармакологическое исследование нативных гуминовых кислот торфов Томской области, как перспективных объектов для разработки новых лекарственных средств.
Для достижения цели были поставлены следующие ЗАДАЧИ:
Провести сравнительное химико-фармакогностическое исследование ряда торфов Томской области.
Провести сравнительное изучение химической структуры нативных гуминовых кислот, выделенных из исследуемых торфов, современными методами физико-химического анализа.
На основании полученных данных выбрать наиболее перспективный сырьевой источник и разработать методы его стандартизации.
Подготовить проект фармакопейной статьи предприятия «Гуминовые кислоты торфа».
5. Исследовать токсикологические и фармакологические свойства
гуминовых кислот наиболее перспективного сырьевого источника.
Научная новизна. Впервые проведено сравнительное
фармакогностическое исследование ряда торфов Томской области и сравнительное изучение химической структуры их нативных ГК современными методами физико-химического анализа. Определены основные группы БАВ исследуемых торфов и установлено, что ГК являются наиболее представительной в количественном отношении группой БАВ торфа. Показано,
что низинный древесно-травяной торф месторождения «Клюквенное», в силу особенностей химической структуры их ГК, является наиболее перспективным сырьевым источником ГК. Впервые проведена стандартизация ГК, определены показатели их подлинности и качества. Впервые изучены токсикологические и фармакологические свойства нативных ГК наиболее перспективного сырьевого источника. Проведена оценка острой токсичности ГК при разных способах введения, выявлены органы-мишени, показано прямое кардиотоксическое действие ГК. На экспериментальных моделях патологий установлены выраженные антигипоксические и гепатозащитные свойства ГК.
Работа поддержана грантами: Роснауки 2005-РИ-111.0/002/049, РФФИ № 05-07-98002, № 06-04-58593, Грантом Главы Администрации (Губернатора) Томской области научных разработок молодых ученых № 340, стипендией Президента РФ, стипендией Фонда им. Шамахова Ф.Ф.
Практическая значимость. На основании проведенных исследований низинный древесно-травяной вид торфа обоснован как наиболее перспективный источник получения гуминовых препаратов высокого качества. Полученные результаты и сделанные выводы важны для решения задач, связанных с использованием ГК из торфа в ветеринарии и медицине.
Проведена стандартизация и определены критерии оценки доброкачественности - качественной и количественной идентификации ГК торфа. Разработан проект фармакопейной статьи предприятия «Гуминовые кислоты торфа» (Акт сдачи-приемки результатов ннаучно-технических работ по Договору № 1390 от 06 сентября 2007 г на выполнение НИР по теме: «Разработка методов стандартизации и проекта фармакопейной статьи предприятия «Гуминовые кислоты торфа»», действующего на основании договора № 154 от 16 марта 2007 г. о научно-техническом сотрудничестве ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Росздрава и ООО «Инновационные коммуникации» - Приложения 1-3).
Проведенные исследования легли в основу выполнения НИОКР по проекту Администрации Томской области «Разработка новых оригинальных средств для нужд ветеринарии на основе продуктов глубокой переработки торфов Томской области» (Акт сдачи-приемки результатов НИОКР по Договору № 340 от 18 июля 2007 г на финансирование проекта, победившего в областном конкурсе научныхразработок молодых ученых в 2007 году -Приложение 4).
Результаты работы использованы для создания базы данных по физико-химическим свойствам ПС торфов Томской области в клиент-серверной технологии (РФФИ № 05-07-98002).
По результатам выполненных исследований получен патент РФ № 2300103 «Способ определения биологической активности гуминовых кислот торфов» (Приложение 5).
Результаты работы используются в учебном процессе Сибирского государственного медицинского университета: в лекционном курсе и на практических занятиях интернов и студентов на кафедрах фармацевтической технологии (Акт внедрения учебно-методического пособия № 1 от 14.01.2008 «Фармацевтические аспекты использования пелоидов Сибири» Приложение 6).
По материалам диссертации подготовлены и изданы следующие учебные пособия:
1. Учебное пособие «Фармацевтические аспекты использования торфа».
2. Учебное пособие «Большой практикум: физикохимия, биология и
комплексная переработка торфа».
3. Учебное пособие «Фармацевтические аспекты использования пелоидов
Сибири».
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР ГОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» Федерального
12 агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ «Изыскание и изучение фармакологических средств. Вопросы фармации» (№ гос. регистрации темы 01.02.00. 101708).
Апробация работы. Результаты и основные положения работы представлены на следующих научных форумах: Ш Всероссийской с международным участием школе-конференции молодых ученых «Болота и Биосфера» (г. Томск, 2004); VI конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (г. Томск, 2005); Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы фармакологии и фармации» (г. Новосибирск, 2005); IV Всероссийской с международным участием школе-конференции молодых ученых «Болота и Биосфера» (г. Томск, 2005); Международной конференции «Торф в решении проблем энергетики, сельского хозяйства и экологии» (г. Минск, Республика Беларусь, 2006); 13th Meeting of the International Humic Substances Society «Humic Substances - Linking Structure to Functions» (Karlsruhe, Germany, 2006); Всероссийской конференции молодых ученых и П школы им. Академика Н.М. Эммануэля «Окисление, окислительный стресс, антиоксиданты» (г. Москва, 2006); V Всероссийской с международным участием школе-конференции молодых ученых «Болота и Биосфера» (г. Томск, 2006).
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 21 печатных работы: 18 статей и материалов научных конференций, из них 6 в реферируемых Российских журналах, 1 в реферируемом зарубежном журнале, 3 учебных пособия, получен 1 патент РФ на изобретение.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 189 страницах компьютерного текста, содержит 32 таблицы, 16 рисунков, включает введение, обзор литератур (глава 1), экспериментальную часть (главы 2-5), список литературы, содержащий 291 библиографический источник, из которых 76 на иностранных языках, и Приложение.
Биологическая активность гуминовых кислот
Как было показано выше, структурные особенности ГК позволяют им участвовать в разнообразных окислительно-восстановительных реакциях, в фермент-субстратных взаимодействиях, влиять на осмотическое давление, образовывать комплексные соединения хелатного типа и т.д. Кроме того, ГК, являясь гетерополимерами арилгликопротеидной природы, могут служить источником структурных фрагментов органических макромолекул при биосинтезе, происходящем в живых организмах. Как коллоидные дисперсии, ГК проявляют поверхностно-активные и электроповерхностные свойства. В результате ГК способны снижать поверхностное натяжение и вязкость растворов и протоплазмы, а также проявлять ионофорное действие, изменять электрофизиологические свойства клеточных мембран. Все эти вышеперечисленные свойства ГК и обусловливают их многопрофильную фармакологическую активность.
Проблема выделения в структуре ГК тех или иных фармакофорных групп или дескрипторов, обуславливающих конкретный вид биологической активности, чрезвычайно сложна и не решена до сих пор. Одним из таких потенциальных дескрипторов является фактор молекулярно-массового распределения. Все ГК полидисперсны, диапазон средневесовых молекулярных масс - от 10000 до 150000 Да. Характерная особенность заключается в том, что даже предварительно фракционированные препараты остаются полидисперсными. Строго мономолекулярные препараты получить принципиально нельзя. Наличие в одном объекте молекул различных размеров, варьирующих по структуре и составу, количеству функциональных групп, физико-химическим свойствам, способствует одновременному протеканию различных, в том числе и противоположных, реакций и, следовательно, существенно расширяет спектр его биологической активности [153,158,159].
В работах немецких ученых [234, 246-248] по изучению активности ГК против вируса простого герпеса отмечено, что активность ГК обусловлена именно их высокомолекулярной специфической структурой, а низкомолекулярные предшественники ГК - не обладают антивирусной активностью. К тому же, рассматривая ГК как продукты окисления низкомолекулярных фенолов, они установили, что высокая антивирусная активность обусловлена содержанием карбоксильных групп и увеличением длины С=С сопряженных связей в алифатической цепочке [244, 245].
Рядом других авторов [60, 182] наоборот отмечено, что стимулирующая активность ГК возрастает с уменьшением их молекулярной массы, и что одной из причин физиологической активности ГК является наличие в их молекулах фрагментов, обладающих свойствами стабильных радикалов, содержание которых снижается с увеличением доли высокомолекулярных фракций в составе ГК.
Необходимо отметить, что в литературе встречаются достаточно противоречивые данные по вопросу взаимосвязи биологической активности ГК и структурных параметров. Так, например, Flaig [226-228] считает фармакофорным фрагментом в молекулах ГК производные ортохинонов, способных влиять на окислительно-восстановительные процессы в клетке. По мнению других исследователей [55, 150], наибольшей биологической активностью обладают более ароматизированные фракции ГК, содержащие больше фенольных гидроксилов и хиноидных группировок. Считают, что носителями специфических свойств ГК служат конденсированные ароматические ядра, соединенные друг с другом через цепи, имеющие достаточное сопряжение углерод-углеродных и других связей, обеспечивающих свободное перераспределение электронной плотности в пределах всей макромолекулы. При рассмотрении вопроса взаимосвязи биологической активности ГК с их молекулярной структурой, рядом авторов [150, 163, 182, 187, 279] также отмечается, что наличие в ядре гетероциклического азота - одна из основных причин их высокой биологической активности.
Имеются данные [96] о повышенной активности ГК, содержащих большее количество периферических полисахаридных фрагментов. [215]. Некоторые исследователи считают, что наряду с высоким содержанием кислых функциональных групп, соотношение гидрофильных и гидрофобных фрагментов в структуре ГК - один из определяющих факторов их биологической активности [14].
В тоже время целый ряд исследователей считает [14, 148, 150, 152, 158, 169, 182, 212, 268, 269], что действующее начало ГК - это в основном функциональные группы (карбоксильные и гидроксильные), блокирование которых в молекулах ГК, в частности катионами металлов, устраняет их биологическую активность [6,158].
Отмечено, что образцы ГК с более высоким содержанием функциональных групп, высокой степенью ароматизации и уровнем парамагнетизма обладают наиболее сильным воздействием на ростовые процессы [150]. Ряд авторов указывает на существование определенной зависимости между концентрацией парамагнитных центров, содержанием углерода, кислородсодержащих функциональных групп, степенью ароматичности, реакционной способностью, обменной емкостью, растворимостью, электропроводностью, молекулярной массой молекул ГК и их биологической активностью [5, 88, 91,174].
Методы качественного и количественного определения биологически активных веществ торфов
Приготовление извлечения: готовили водный настой 1:10, нагревая измельченное сырье на водяной бане в течение 10 минут. Настой после охлаждения фильтровали и проводили с ним качественные реакции.
а) Реакция пенообразования. Брали две пробирки, в одну приливали 5 мл 0,1 моль/л хлористоводородной кислоты, а в другую - 5 мл ОД моль/л гидроксида натрия. Затем в обе пробирки добавляли по 2-3 капли извлечения и сильно встряхивали. По образованию в пробирках стойкой пены судили о присутствии в сырье сапонинов, а по высоте пенного столба - о природе сапонинов.
б) Реакция с ацетатом свинца. К 2 мл настоя в пробирке прибавляли несколько капель раствора ацетата свинца. О наличии сапонинов судили по образованию осадка.
Обнаружение фенольных соединений
Приготовление извлечения: 1,0 г сырья заливали 100 мл воды. Нагревали на водяной бане 20-30 минут, процеживали через вату, и полученное извлечение использовали для проведения качественных реакций.
а) К 2-3 мл извлечения добавляли несколько капель раствора железоаммонийных квасцов. О наличии . в сырье фенольных соединений свидетельствует появление черно-синего или черно-зеленого окрашивания и осадка.
б) К 1 мл извлечения добавляли 2 мл раствора 10 % уксусной кислоты и 1 мл 10 % раствора средней соли ацетата свинца. О наличии в сырье фенольных соединений судили по образованию осадка.
Обнаружение фенолокислот Для определения фенолокислот 0,5 г измельченного сырья помещали в колбу со шлифом вместимостью 50 мл, приливали 25 мл 40 % этанола, присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение 45 минут с момента закипания спирта в колбе. Колбу с содержимым охлаждали, извлечение перемешивали и фильтровали через бумажный фильтр («синяя лента»). После чего проводили спектрофотометрическое определение, для этого 1 мл извлечения вносили в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводили объем раствора водой до метки. Спектр полученного раствора снимали на спектрофотометре СФ-46 в УФ области, при длине волны 325±5 нм. В качестве раствора сравнения использовали воду.
Обнаружение кумаринов Для определения кумаринов готовили извлечение, для чего брали 0,5 сырья, заливали 10 мл 30 % этанола и нагревали на кипящей водяной бане 15 минут. После охлаждения извлечение профильтровали и проводили с ним-качественные реакции.
а) реакция диазотирования. К 1 мл извлечения добавляли 3 мл 1 % спиртового раствора натрия гидроксида и нагревали на водяной бане в течение 5 минут (при наличии кумаринов раствор желтеет). Затем прибавляли 5 капель свежеприготовленного раствора диазотированной сульфаниловой кислоты. При наличии кумаринов появляется вишнево-красное или оранжево-красное окрашивание.
б) лактонная проба. В две пробирки наливали по 1 мл извлечения. В одну из них добавляли 0,5 мл 10 % раствора натрия гидроксида. Обе пробирки нагревали на водяной бане до кипения и охлаждали. В каждую пробирку наливали по 4 мл воды. О присутствии кумаринов судили по сохранению прозрачности раствора со щелочью. Обнаружение флавоноидов
Для определения флавоноидов в исследуемом сырье получали извлечение. С этой целью 1,0 г сырья помещали в широкогорлую колбу, заливали 30 мл 70 % этанола и нагревали на кипящей водяной бане с обратным холодильником 10 минут. Извлечение охлаждали, фильтровали через вату и проводили с ним качественные реакции.
а) реакция со щелочью. К 0,5 мл полученного выше спиртового извлечения добавляли несколько капель 1 % спиртового раствора щелочи. Флавоны и флавонолы растворяются в щелочах с образованием желтой окраски. Халконы и ауроны сразу же образуют красные или пурпурные растворы. б) проба с 0,5 % раствором хлорного э/селеза. К 0,5 мл полученного выше спиртового экстракта добавляли 1-2 капли раствора хлорного железа.
Давать окраску с хлорным железом — общее свойство полиоксифенольного соединения. Ортооксифенольные группы в молекулах флавоноидов обуславливают зеленую, а триоксифенольные группы - синюю окраску. в) проба с алюминия хлоридом. К 1 мл спиртового извлечения добавляли 3-5 капель 5 % спиртового раствора реактива. При наличии флавоноидов появляется желтое окрашивание.
Обнаружение дубильных веществ Для определения дубильных веществ получали водное извлечения, для чего 5 г сырья заливали 100 мл горячей воды и кипятили в течение 5 минут. С фильтратом проводили качественные реакции:
а) Осаждение 1 % раствором эюелатииа: к 2 мл испытуемого раствора добавляли по каплям 1 % раствор желатина в 10 % растворе натрия хлорида. При наличии дубильных веществ появляется муть, исчезающая при добавлении избытка желатина.
б) реакция с солями алкалоидов: к 3-5 мл извлечения добавляли 2 3 капли 1 % раствора соли кодеина. При наличии таннидов наблюдается помутнение раствора.
Обнаружение антраценпроизводных 0,5 г измельченного сырья кипятили с 10 мл 10 % раствора щелочи. При этом должен происходить щелочной гидролиз антрагликозидов, окисление восстановленных форм и взаимодействие агликонов со щелочью с образованием красного окрашивания (антрахиноляты). В случае присутствия в сырье дубильных веществ, флавоноидов и пигментов извлечение может быть не красным, а бурым.
Исследование химической структуры гуминовых кислот
Результаты показывают, что фенольные соединения представлены в основном флавоноидами, остальные группы (фенолкарбоновые кислоты и кумарины) во всех образцах торфа представлены незначительным содержанием, и количественно практически не различаются между собой. Отмечено, что увеличение данных групп БАВ в образцах отмечается при переходе от низинного к верховому типу торфа.
Количественное содержание углеводной составляющей торфа (сумма водорастворимых и легкогидролизуемых веществ, а также трудногидролизуемых веществ) представлено в разделе 3.1, табл. 3.2.
Таким образом, результаты изучения состава торфов различных типов и ботанической принадлежности показывают, что все они имеют одинаковый набор БАВ. Различия наблюдаются лишь в количественных соотношениях, и в целом между пятью видами торфа они незначительны. Из всех БАВ, присутствующих в торфах, наибольшее содержание отмечено для ГК, максимальное количество которых содержится в низинном древесно-травяном виде торфе с месторождения «Клюквенное». Также данные результаты показывают, что ГК в силу своего высокого удельного содержания, являются наиболее представительной группой веществ для дальнейшего изучения. Химические свойства и биологическая активность ГК в первую очередь зависят от ботанической принадлежности торфа (типа и вида) (разд. 1.3), поэтому основополагающей причиной при выборе торфяного сырья для медицинских целей является качественная характеристика химической структуры ГК, которая и обуславливает их биологическую активность.
Как было рассмотрено выше, свойства ГК, выделенных из различных видов сырья, в каждом конкретном случае специфичны и определяются составом и соотношением индивидуальных структур [113, 114]. Основные принципы описания «скелетной структуры» макромолекул ГК основываются на представлениях о двучленном строении и делокализации неспаренных электронов в молекулярных 7и-орбиталях системы полисопряженных связей [88, 156].
Большое разнообразие структурных единиц и функциональных групп, множество вариантов их сочетаний, непостоянство состава молекулярных масс ГК делают прямое определение их структуры в настоящее время невозможным. Поэтому применение традиционно используемых для исследования ГК методов (элементного анализа, УФ-, ИК-, ЭПР- и ЯМР- спектроскопии) позволяют получить новые индивидуальные данные о составе и свойствах ГК конкретных сырьевых источников.
Результаты элементного анализа позволяют охарактеризовать особенности ГК исследуемых торфов и дают некоторые сведения о принципах их строения. Элементный состав ГК всех изучаемых торфов представлен в табл. 3.5.
Анализируя данные элементного состава (табл. 3.5), следует отметить довольно невысокое содержание углерода в исследуемых ГК (47,0-52,1 %). Согласно разработанным Д.С. Орловым [156] диагностическим признакам отнесения выделенных из природных объектов веществ к ГК, данные результаты составляют нижний предел содержания углерода в ГК (46-62 масс. %), что весьма характерно для торфяных ГК [114, 122, 123, 218, 263]. Полученные результаты показывают, что наибольшим развитием алифатических структур и наименьшей степенью ароматичности, согласно данным атомного соотношения Н/С, отличаются ГК низинного древесно-травяного и переходного осокового видов торфа- 1,40 и 1,29 соответственно. В ГК низинных травяного и травяно-мохового вида торфа наблюдается самое низкое отношение Н/С (1,04), что свидетельствует о более низком вкладе алифатических структур в построение их молекул, а также о большей замещенности ароматических структур в составе молекул ГК этих видов торфа [116,117,150,182,212]. Содержание кислорода в молекулах ГК косвенно характеризует содержание кислородсодержащих функциональных групп [112], самые высокие значения отмечены в низинных древесно-травяном (43,50 %), травяно-моховом (42,39 %) и травяном (42,15 %) видах торфа, в связи с этим в ГК данных торфов возможно ожидать наиболее высокое содержание кислородсодержащих функциональных групп. Согласно атомному отношению О/С, наибольшая окисленность молекул характерна для ГК низинных древесно-травяного (0,69), травяного (0,64), и травяно-мохового (0,63) видов торфа. Данное обстоятельство возрастания величины О/С связано с увеличением содержания в структуре ГК карбоксильных групп [116]. В молекулах ГК верхового и переходного торфов относительно низкое содержание кислорода при практически одинаковом содержании водорода может свидетельствовать о высокой степени восстановленности данных молекул [66, 81].
Определение подлинности и качества гуминовых кислот низинного древесно-травяного вида торфа
ИК-спектр должен содержать характерные полосы поглощения, при длинах волн 3500-3300 см"1 (валентные колебания гидроксильных групп (VOH)); 3250-3200 см"1 (валентные колебания N-H (VNH) В структуре амида, аминов, связанных водородными связями); 2920 см"1, 2860 см"1, 1460-1440 см"1, 700-900 см"1 (валентные колебания -СНз и -СНг групп боковых цепей); 2600-2500 см"1 (колебания карбоновых кислот); 1725-1700 см"1 (валентные колебания карбонильных групп (vc=o), которые могут быть представлены кетонами, альдегидами, карбоновыми кислотами и их функциональными производными); 1625-1610 см"1 (плоскостные колебания сопряженных углерод-углеродных (ароматические, Vc=c) и углерод-кислородных связей (карбонилы, связанные водородными связями, карбоксилат-ионы, vc=o), в ароматическом скелете и хинонах); 1510-1500 см"1 (неконденсированные ароматические соединения, связанные с атомами азота и кислорода); 1250-1225 см"1 (валентные (vc-o) и деформационные колебания (5о-н) связей); 1050-1150 см"1 (валентные колебания спиртовых и углеводных гидроксильных групп (von)).
Элементный анализ позволяет охарактеризовать качественный состав ГК торфа, согласно диагностическим признакам Д.С. Орлова [156] отнесения выделенных из природных объектов веществ к гуминовым кислотам.
Методика. Гуминовые кислоты извлекают из торфа согласно, описанной в разд. 4.2.1. методике. Высушенные ГК (точная навеска) гомогенизируют, растирая в агатовой ступке, помещают в кварцевую кювету С, Н, N -анализатора и сжигают при 750С, содержание кислорода определяют по разности.
Гуминовые кислоты низинного древесно-травяного вида торфа должны содержать углерода не более 47,0±5,0 масс. %; азота не менее 3,8±0,4 масс. %; водорода 5,5±0,5 масс. %; кислорода 43,5±4,5 масс. %.
В связи с наличием в молекулах ГК хромофорных и ауксохромных групп, обуславливающих их темную окраску, метод УФ-спектроскопии является одним из наиболее удобных и простых методов идентификации.
Методика обнаружения в сырье. Гуминовые кислоты извлекают из торфа согласно, описанной в разд. 4.2.1 методике. Точную навеску (около 0,1 г) ГК разбавляют в 100 мл 0,1 моль/л (0,4 % масс.) растворе гидроксида натрия, 1 мл полученного раствора помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят водой очищенной до метки, перемешивают и снимают спектр в интервале от 200 до 700 нм (раствор сравнения: 1 мл 0,1 моль/л (0,4 %масс.) раствора гидроксида натрия в 100 мл воды очищенной). Ультрафиолетовый спектр ГК должен соответствовать представленному на рис. 4.2 спектру, который имеет два максимума поглощения в области 245±2 нм и 294±2 нм (разд. 3.3.2.1).
Методика обнаружения ГК в гуминовых препаратах. 1 мл раствора препарата помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят водой очищенной до метки, перемешивают и снимают спектр в интервале от 200 до 700 нм. Ультрафиолетовый спектр ПС долясен соответствовать представленному на рис. 4.2 спектру, который имеет два максимума поглощения в области 245±2 нм и 294±2 нм.
Методика обнаружения ПС в биологических жидкостях (плазме крови). К аликвоте сыворотки крови (1 мл) добавляют 9 мл 0,1 моль/л (0,4 % масс.) раствора гидроксида натрия и перемешивают. Параллельно готовят раствор сравнения, с использованием сыворотки крови интактных животных. Спектр снимают в интервале от 200 до 700 нм. Ультрафиолетовый спектр ПС должен соответствовать представленному на рис. 4.2 спектру, который имеет два максимума поглощения в области 245±2 нм и 294±2 нм.
Методика обнаружения ПС в сырье. Гуминовые кислоты извлекают из торфа согласно, описанной в разд. 4.2.1 методике. Точную навеску (около 1,0 г) ГК разбавляют в 100 мл 0,1 моль/л (0,4 % масс.) растворе гидроксида натрия, 20 мл полученного раствора помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят водой очищенной до метки, перемешивают и проводят ВЭЖХ анализ на эксклюзионной колонке Supelco PROGELSK GMPXL 300x7.8mm, сорбент -13 микрон, эффективность колонки - 11000 т.т. Подвижная фаза - вода, 1 мл/мин. Регистрацию компонентов проводят с помощью спектрофотометрического детектора - детекцию на длине волны 190 нм.
Молекулярная масса ПС низинного древесно-травяного вида торфа должна находиться в интервале 1000-1200 кДа. Молекулярно-массовое распределение ГК должно соответствовать представленному на рис. 4.3 спектру.
Методика обнаружения в гуминовых препаратах. 20 мл раствора препарата помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят водой очищенной до метки, перемешивают и проводят ВЭЖХ анализ на эксклюзионной колонке Supelco PROGELSK GMPXL 300x7.8mm, сорбент - 13 микрон, эффективность колонки - 11000 т.т. Подвижная фаза - вода, 1мл/мин. Регистрацию компонентов проводят с помощью спектрофотометрического детектора - детекцию на длине волны 190 нм.
Молекулярная масса ГК низинного древесно-травяного вида торфа должна находиться в интервале 1000-1200 кДа. Молекулярно-массовое распределение ГК должно соответствовать представленному на рис. 4.3 спектру.
