Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы по теме исследования 7
2.1 .Карбоксиметильная схема модификации полисахаридов - как метод создания новых физиологически активных полимеров 7
2.2.Синтез карбоксиметилполисахаридов(КМЛ) 7
2.3.ФАП «прививочного типа» с ионными, водородными и координаци онными связями 10
2.4. Методы фиксации спиртов, аминов и производных гидразина на кар боксиметилполисахаридной матрице 12
2.5.Использование сложных эфиров КМП в синтезе физиологически активных полимеров 22
2.6.Ацилирование аминов карбоновими кислотами 30
3. Обсуждение результатов 34
3.1.Синтез полисахаридных ацилиругощих агентов 34
3.1.1..Синтез карбоксиметилполисахаридов 34
3.1.2. Синтез Н+- формы карбоксиметилполисахаридов 45
3.1.3.Синтез этиловых эфиров карбоксиметилполисахаридов 46
3..2.Ацилирование ароматических аминов 48
3.2.1.Исследование реакций ІҐ-форм и этиловых эфиров КМП с арома тическими аминами в ДМСО... 51
3.2.2.Ацилирование ароматических аминов в диоксане 59
3.2.3.Реакции КМП и их этиловых эфиров с бензиламином 68
3.2.4. Ацилирование ароматических аминов в диоксане, содержащем 4 5% воды 73
3.2.5. Ацилирование ароматических аминов в среде низших одноатом ных спиртов 78
3.3.Ацилирование гетероциклических аминов 84
З.З.І.Ацилирование аминотиазолов 87
3.3.2.Ацилирование производных антипирина 91
3.3.3.Ацилирование производных пиримидина 93
3.3.4.Ацилирование производных пиридина 95
ЗАИзучение антимикробной активности некоторых синтезированных производных полисахаридов 99
4.Эксперимеыталбная часть 105
4.1 .Приборы и материалы, используемые в исследовании 105
4.2. Объекты исследования 106
4.3. Химический синтез соединений на основе полисахаридов 113
4.4. Синтез используемых аминов и модельных соединений 116
4.5. Количественный анализ синтезированных производных полисахаридов 117
4.6. Определение антимикробной активности соединений 129
Выводы 131
Список литературы 133
- Методы фиксации спиртов, аминов и производных гидразина на кар боксиметилполисахаридной матрице
- Синтез Н+- формы карбоксиметилполисахаридов
- Ацилирование ароматических аминов в среде низших одноатом ных спиртов
- Синтез используемых аминов и модельных соединений
Методы фиксации спиртов, аминов и производных гидразина на кар боксиметилполисахаридной матрице
Исследование кинетики карбоксиметилирования целлюлозы монохло-руксусной кислотой в изопропиловом спирте в присутствии NaOH в интервале температур 45-65С показало, что гетерогенный процесс протекает в 2 стадии с разной скоростью по реакции псевдопервого порядка. С увеличением степени замещения (С3) плотность заряда вдоль макромолекулярной цепи увеличивается, и распределение заместителей вдоль и между макромолеку-лярными цепями становится более однородным [155].
Разрабатываются также технологии карбоксиметилирования полисахаридов, в которых используются иные щелочные агенты. Так, в N,N-диметилацетамиде в присутствии LiCl, без добавлении щелочи и в присутствии пиридина, триметиламина или трет, бутилата калия синтезирована 2,3-ди-О-карбоксиметилцеллюлоза [119]. Декстран карбоксиметилируют монохлоруксусной кислотой в воде с добавлением соды[143]. Как уже указывалось, карбоксиалкилполисахариды обладают ценными свойствами и используются в фармацевтической и медицинской практике.
Особенно широко применяются наиболее доступные карбоксиметил-полисахариды [27,39,78-80,128,144]. Наличие карбоксиметильных групп в молекуле полисахаридов увеличивает устойчивость полимеров к действию микроорганизмов и ферментов.
Из натриевой соли КМЦ готовят пленки, а также хирургические нити, которые применяют и внутри организма, т.к. они рассасываются за месяц, при этом воспалительная или токсическая реакция организма отсутствует. Соли карбоксиметилполисахаридов не обладают канцерогенными свойствами. Они выводятся из организма через почки. Пленки обладают стимулирующим действием на репаративные процессы в инфицированных ранах кожи. КМЦ - основной компонент медицинских тампонов, губок, бинтов, она обладает гемостатическими свойствами [28,53].
Карбоксиметилпроизводные целлюлозы, декстрана, хитина, хитозана, гемицеллюлоз и других полисахаридов и их соли регулируют иммунные функции, проявляют противоопухолевую активность[124], обладают ярко выраженным ранозаживляющим действием, и применяются в практике глазной хирургии [27,34].
Полисахариды, содержащие кроме гидроксильных сульфатные, фосфатные, карбоксильные или аминогруппы (например, полиурониды, хито-зан), образуют соли с биологически активными соединениями [8,58,81,135]. Простое ионное связывание БАВ с полиэлектролитом-носителем в большинстве случаев недостаточно прочно, и БАВ быстро отщепляется при изменении значения рН и ионной силы раствора. В то же время связывание двух полиэлектролитов - полезный прием, особенно если желательно постепенное высвобождение БАВ, например, белка - фермента [89].
Использование ионных и водородных связей для фиксации БАВ на по-лисахаридной матрице чаще всего встречается при создании фермент - поли-сахаридных комплексов. С этой целью применяют полианионы, поликатионы, а также нейтральные полисахариды. В фермент-полисахаридных комплексах полианионы представлены карбоксиметилпроизводными декстрана, целлюлозы, хитозана, полиуроно 11 выми кислотами [19,64,95,116,138,153,154,159]. Ионное связывание фосфатазы, уреазы, глюкозоксидазы карбоксиме-тилцеллюлозой (КМЦ) [89,152-154,159], фенилаланиндегидрогеназы карбок-симетилхитином (КМХ) и карбоксиметилхитозаном [138] в большинстве случаев приводило к повышению термостабильности и расширению рН Ps-OCH2COO H3N -Ф , где Ф - фермент оптимума действия ферментов.
Иногда для иммобилизации ферментов на полисахаридной матрице используется способность некоторых переходных металлов (железо, хром, титан и др.) образовывать прочные межмолекулярные комплексы с полисахаридами и белками [115]. Нерастворимые комплексы КМЦ, желатина и уреазы с ионами хрома (III) сохраняют активность в течение 2 месяцев.
Карбоксиметилированные амилоза, крахмал, декстран, целлюлоза, инулин, маннан, ксилан и хитин используются в качестве носителей комплексов двух- и четырехвалентной платины общей формулы Pt[(A )(A")Pt]Cl2, где А и А" - одинаковые или разные азотсодержащие соединения (аммиак, алкиламины, циклоалифатические амины и др.).
Полимерные комплексы представляют собой ценные противоопухолевые препараты [35,37,148].Получен прочный комплекс КМД с кобальтом, который расщепляется аналогично КМД и обладает антианемическим действием ].
Целлновокаин - новокаиновая соль карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) (1:1) - местный анестетик. Превосходит новокаин по силе в 3 раза, по продолжительности в 2-3 раза, менее токсичен. Целлпилокарпин - пилокарпи-новая соль КМЦ (56% пилокарпина) - для лечения глаукомы. В 2,2 раза превосходит исходное лекарство по гипотензивному действию и по миотическои активности [53,107]. Путем химического сочетания природного полифенола (госсипола) с низкозамещенной КМЦ получен - кагоцел, обладающий ин-терферониндуцирующей и противовирусной активностями. Рекомендован, как профилактическое и лечебное средство при вирусных инфекциях[93]. Получены соли КМД с канамицином [98], цистамином, серотонином, тубазидом [18], карбоксиметилсефадекса с канамицином и тубазидом [71].
Методы фиксации спиртов, аминов и производных гидразина на карбоксиметилполисахаридной матрице. Полисахаридкарбоновые кислоты, как правило, не используют в качестве ацилирующих агентов в реакциях со спиртами, так как полисахариды в условиях реакции этерификации подвержены гидролизу или ацидолизу. Необходимо применять более активные ацилирующие агенты, либо проводить реакцию в условиях основного катализа. Поэтому для ацилирования спиртов и аминов применяют хлорангидриды, ангидриды, "активированные" эфиры карбоновых кислот, а также карбодиимидныи, азолидный методы активации карбоксигрупп и др. Использование хлорангидридов КМП для ацилирования спиртов и аминов встречается редко, так как их синтез сопровождается деструкцией полисахарида, нуклеофильным замещением гидроксильных групп моносаха-ридных звеньев, их ацилированием и другими побочными реакциями. В качестве примера можно привести синтез хлорангидрида КМЦ, действием тио-нилхлорида на КМЦ в пиридине в присутствии небольшого количества ди-метилформамида, и использование его в реакциях с БАВ [53,61]:
Синтез Н+- формы карбоксиметилполисахаридов
Ранее в Санкт-Петербургской химико-фармацевтической академии была предложена и осуществлена схема синтеза производных полисахаридов, которая включает алкилирование полимера монохлоруксусной кислотой, этерификацию полученного карбоксиметилполисахарида (КМП) спиртом и ацилирование первичных и вторичных алифатических аминов полученными эфирами КМП [47-49]. Установлено, что сложные эфиры КМП являются хорошими ацилирующими агентами и реагируют с алифатическими аминами в достаточно мягких условиях, как в воде, так и в органическом растворителе. При этом при температуре больше 80С в среде органического растворителя с аминами реагируют как сложноэфирные, так и карбоксильные группы КМД [43].
Нашей задачей было исследование ацилирующей способности КМП и их эфиров в реакциях с ароматическими аминами, нахождение оптимальных условий проведения этого процесса и разработка простого метода модификации полисахаридов ароматическими аминами.
Амины ацилировали ІҐ- формами (III) и этиловыми эфирами (IV) кар-боксиметилполисахаридов в диоксане и диметилсульфоксиде (ДМСО) при температурах 60-100 в течение 1-16 часов. Полученные амиды отфильтровывали (при необходимости их осаждали из реакционной среды этанолом) и переосаждали спиртом из водно-щелочного раствора для удаления ионосвя-занного амина и получения натриевой соли полимера (V). Чистоту продуктов реакции контролировали тонкослойной хроматографией и УФ-спектроскопией.
Амиды КМП (V) в натриевой форме представляют собой порошкообразные вещества белого или светло-коричневого цвета, растворимые в воде, нерастворимые в спирте, эфире и других органических растворителях.
Синтез замещенных амидов КМП контролировали с помощью УФ-спектроскопии по появлению в УФ-спектрах полисахаридных образцов полос поглощения, характерных для ароматических соединений (см. табл. 5 и рис. 5).
Значение максимумов поглощения водных растворов N-ариламидов КМД и синтезированных нами N-ацетилпроизводных аминов совпали, в то время как сами амины имеют другие значения X тах , а полисахарид в этой области не поглощает. Анализ замещенных амидов КМП осуществляли методами ИК- и УФ-спектроскопии, кондуктометрического титрования и элементного анализа. В ИК-спектрах образцов замещенных амидов КМП, обработанных кислотой для превращения карбоксилат-анионов в карбоксильные группы, были обнаружены полосы поглощения при 1535-1545 см 1 и 1650-1660 см"1, характерные для SN-H " амид II " и v с=о " амид I", отсутствующие в спектрах исходных веществ (см. приложение).
Таблица 5. Величины Атоах полос поглощения в УФ-спектрах аминов, N-ацетиламинов, амидов КМД
Количественно амиды КМП характеризовали определением степени аминокарбонилметилирования Сашш (число амидных групп в расчете на мо-носахаридный фрагмент полимера), а результаты ацилирования - расчетом степени амидирования Сам (процент вступивших в реакцию ацильных групп полисахарида). Значения Самкм рассчитывали по данным элементного анализа и УФ-спектроскопии при помощи уравнений калибровочных прямых (которые строили при Хтах по модельному соединению), а также по результатам кондуктометрического титрования свободных карбоксильных групп поли 51 амида с учетом степени карбоксиметилирования (Скм) образца исходной поликислоты. Значения, полученные разными методами, не отличались более, чем на 5% (табл.6).
Необходимо отметить, что в данном случае выражение «степень ами-дирования» не совсем корректно, поскольку мы имеем дело с реакцией аци-лирования, а термин "амидирование" применяют в случае введения в молекулу амидной группы . Но реакция ацилирования в общем случае может пойти не только по аминогруппе, но и по гидроксильнои группе, с образованием сложных эфиров, поэтому мы, подчеркивая, что у нас образуются амиды, используем этот термин.
Для определения ацилирующей способности Н -формы КМП и их сложных эфиров в разных условиях, а также для определения условий реакций, позволяющих получать модифицированный полисахарид с запланированной степенью замещения, исследовали зависимость Сам от соотношения реагентов, времени и температуры реакции. Ранее было показано, что наилучшими растворителями для проведения реакций алкиловых эфиров КМП с алифатическими аминами являются вода, ДМСО и диоксан, причем наилуч 52 шиє результаты достигаю гея в воде и ДМСО [43,48]. Однако ацилировать амины поликислотой в воде невозможно. Кроме того, эфиры КМП и большинство ароматических аминов не растворяются в воде. Основным недостатком ацилирования алифатических аминов сложными эфирами КМП в ди-оксане являются гетерогенные условия реакции и, как следствие, меньшая скорость реакции и эффективность процесса, сложность управления им [43]. В связи с этим среди органических растворителей большой интерес представляет ДМСО, в котором растворимы как низкомолекулярные соединения, так и многие производные декстрана, и возможно ацилирование аминов по-лисахаридкарбоновыми кислотами.
При ацилировании анилина if-формой и этиловым эфиром КМД в ДМСО оказалось, что карбоксильные группы полисахаридов вступают в реакцию при температурах выше 70-80С (табл. 7, рис. 6), что связано с образованием аммониевых солей при взаимодействии исходных веществ. Небольшое количество амидных групп (до 8%), которое образуется в реакции КМД с анилином при температурах ниже 80С, является, вероятно, результатом взаимодействия амина с лактоном, который образуется в небольших количествах при выделении поликислоты. группы;а - КМД (Скм = 0,94), Эфир КМД (Скм=0,53; СакМ=41) Нагревание солей выше 80С вызывает их частичное превращение в исходные соединения, и чем сильнее нагрев, тем больше образуется карбоксильных групп, способных реагировать с нуклеофилом. В связи с этим увеличение скорости реакции с повышением температуры объясняется не только повышением кинетической энергии молекул, но и увеличением концентрации реагирующих веществ. При ацилировании аминов карбоксильные группы полисахарида проявляют сначала меньшую, а выше 100С - большую реакционную способность, чем соответствующие сложные эфиры.
Ацилирование ароматических аминов в среде низших одноатом ных спиртов
Как видно из таблицы, при смене растворителя активности ионов могут меняться более чем на 10 порядков, совершенно меняя картину реакции.
Вероятно, и в наших реакциях сольватация молекул поликислоты и амина ди полярным апротонным растворителем ДМСО затрудняет их кислотно-основное взаимодействие и, в случае сильных нуклеофилов (алифатических аминов), способствует реакции ацилирования. При проведении реакции в среде нейтрального апротонного диоксана поликислоты образуют прочные соли с сильными основаниями (алифатическими аминами), что резко уменьшает концентрацию ацилирующего агента (карбоксильных групп) и замедляет реакцию ацилирования.
Таким образом, карбоксиметилпроизводные разных по строению поли сахаридов и их сложные эфиры могут использоваться для ацилирования аро матических и алифатических аминов. Строение исходного полисахарида влияет на реакционную способность полимерных ацилирующих агентов. КМД и его этиловый эфир являются наиболее активными реагентами. Сте пень амидирования зависит как от нуклеофильности амина, так и от условий проведения реакции и растворителя. В ДМСО реакционная спо собность КМП и их эфиров в реакциях с алифатическими аминами выше, чем в диоксане, а реакции с ароматическими аминами лучше идут в диоксане, чем в ДМСО. В одинаковых условиях бензиламин реагирует с эфирами поликислот всегда быстрее ароматических аминов. В работе В.Б.Соколова [99] было показано, что на ход реакции ацили-рования ароматических аминов карбоксиметилдекстраном очень большое влияние оказывает содержание воды в диоксане. Автор объясняет это тем, что добавление небольшого количества воды приводит к возможности изменения надмолекулярной структуры полисахарида и к активации механизма кислотного автокатализа, т.е. протонирования части карбоксиметильных групп за счет диссоциации других. Ситуация, по-видимому, напоминает трехфазный катализ [25,72]. Поскольку в условиях трехфазного катализа иммобилизованный на нерастворимой полимерной матрице катализатор является гетерогенным, скорость реакции определяется тремя основными процессами: массопереносом реагентов из объема жидкой фазы к поверхности катализатора, диффузией реагентов к активному центру и, собственно, химической реакцией на этом центре. Каждый из этих процессов зависит от ряда экспериментальных параметров. В нашем случае роль иммобилизованного на полимерной матрице катализатора играет сам карбоксиметилполисахарид. При увеличении количества воды сверх необходимого для активации кислотного автокатализа, скорость реакции снижается. Для ацилирования ароматических аминов карбоксиметилдекстраном в среде диоксана при температуре выше 70С и 10-кратном избытке амина оптимальная концентрация воды составила 4-5%. При полном отсутствии воды в реакционной массе реакция с анилином идет очень медленно, т.к. полисахарид нерастворим в среде реакции (диоксане).
Нами были проверены и подтверждены эти факты. Действительно, ацилирование ароматических аминов в диоксане, содержащем 4-5% воды, повышает выход целевого продукта. Однако утверждение В.Б. Соколова о том, что с увеличением рКа амина его реакционная способность в реакциях с КМД в диоксане, содержащем 4% воды, уменьшается, вызвало сомнение.
Зависимость степени аминокарбонилметилирования КМД (Скм=1,2 Сакм=0,05) от р/ Га ароматического амина. (100С, диоксан, 12 часов) Амин рКа г амкм и-броманилин 3,91 0,70 Анилин 4,58 0,30 п -толуидин 5,12 0,19 п -анизидин 5,29 0,16 В.Б.Соколов объясняет эти результаты изменением значений констант диссоциации поликислот и аминов при переходе из водной среды к органическому растворителю, что коренным образом меняет картину их взаимодействия. Ссылаясь на мнение большинства исследователей, что основное влияние на скорость реакции при проведении ее в апротонных средах оказывают сольватационные эффекты, В.Б.Соколов приводит примеры влияния растворителя на рКа кислот и оснований. Так, бензойная кислота в воде в 4 раза сильнее уксусной, в 20% водном этаноле она сильнее только в 2,5 раза, а в 50% этаноле обе кислоты равны по силе. Значения рКа для анилина, метила-нилина и диметиланилина измеренные в воде равны, соответственно, 4,64; 4,84; 5,01. Значения рКа для этих же аминов в 60% этаноле составляют 3,80; 3,64; 3,50, то есть более сильное основание стало вести себя как более слабое. Холл и Спринкл построили график зависимости величины рКа от концентрации этанола для 18 алифатических и ароматических аминов и установили, что в среднем величина рКа снижается при прибавлении спирта на 0,54 (максимально на 0,9; минимально на 0,26). Титрование в 50% ацетоне дает еще более высокие значения депрессии величины рКа (от 1,5 до 2,5 единиц). Депрессия в 50% диоксане была значительно больше, чем в 50% ацетоне [1].
При сравнении реакционной способности аминов следует учитывать то, что у частиц, атакующие атомы которых одинаковы, нуклеофильность изменяется в соответствии с их рКа [67]. Действительно, ранее нами показано, что повышение р/С ароматических аминов увеличивает степень амидирова-ния КМД в реакциях его с аминами в ДМСО и безводном диоксане (см. табл. 10, 15 и рис. 9, 19). В связи с этим, зная рКа аминов в диоксане, содержащем 4-5% воды, мы можем объяснить их реакционную способность в реакциях с поликислотой.
Для определения констант диссоциации некоторых ароматических аминов в диоксане, содержащем 5% воды, мы использовали спектрофото-метрический метод. Он состоит в измерении отношения концентрации иона к нейтральной молекуле исследуемого соединения, растворенного в серии растворов с точно известным значением рН. Измерения проводятся при аналитической длине волны, при которой наблюдается наибольшая разность в значениях оптической плотности между ионом и нейтральной молекулой [1].
Синтез используемых аминов и модельных соединений
Родэксман выделен и изучен в СПХФА, его производство освоено на Минском заводе медпрепаратов. Средняя относительная молекулярная масса родэксмана 65000. Он представляет собой белый аморфный порошок, растворяется в воде, ДМСО, не растворяется в ацетоне, спиртах, эфирах и большинстве других органических растворителях.
Родэксман является полисахаридом с высокой биологической активностью [2,9], практически не токсичен, нормализует систему свертывания крови и липидный обмен при экспериментальном атеросклерозе, обладает выраженной антилипидемической активностью, повышает неспецифическую резистентность, при введении по определенной схеме обладает радиозащитным действием.
Подготовка образцов родэксмана к эксперименту проводилась по разработанной в СПХФА (кафедра микробиологии) методике. 20 г маннана-сырца (образцы завода «Минмедпрепараты») растворяли в 1,7 л воды при тщательном перемешивании. Не растворимые в воде примеси отделяли фильтрацией или/и центрифугированием. К очищенному раствору добавляли реактив Фелинга (1:1 по объему) и выдерживали 4 ч. Выпавший в осадок медный комплекс полисахарида отделяли, промывали дистиллированной водой и деионизировали в статических условиях, используя ионообменную смолу КУ-2-8. После отделения ка-тионита маннан осаждали этанолом. Осадок отфильтровывали, промывали спиртом, эфиром и сушили в вакууме.
Аубазидан - внеклеточный D-глюкан, продуцируемый дрожжеподобным грибом Aureobasidium pullulans, штамм 8. Он представляет собой сильно разветвленный полисахарид, основная цепь (кор) которого состоит из р-1,3 108 связанных D-глюкопиранозных звеньев, от каждого третьего из них отходит присоединенная )3-1,6-связью боковая цепочка, состоящая из а-1,4-связанных остатков глюкозы; р-1,3-связи составляют в среднем около 50% от общего числа гликозидных связей [9,31 ]. х = 0,5-2; п = (5-14) xl О"3
Аубазидан был получен в ЛХФИ в 1959 г, полупромышленное производство его освоено на Красноярском заводе мсдпрепаратов. Молекулярная масса полисахарида 5-910 Да. Аубазидан представляет собой кремовый аморфный порошок без запаха, малорастворимый в воде, после набухания он образует бесцветные прозрачные вязкие гели, практически не растворим в большинстве органических растворителей, но при нагревании образует 0,5-2%-ные прозрачные вязкие гели в диметилсульфоксиде.
Полисахарид не обладает антигенными свойствами, малотоксичен, проявляет седативный эффект, повышает неспецифическую резистентность макроорганизмов к некоторым инфекциям, оказывает противовирусное действие; рекомендован в качестве вспомогательного и пролонгирующего средства для получения лекарственных форм.
Корапулан - линейный Р-1,3-Б-глюкан, полученный из аубазидана деградацией по Смиту. Химическая схема синтеза корапулана представлена ниже:
К раствору аубазидана приливали 480 мл расі вора периодата натрия и доводили объем смеси до 1 л дистиллированной водой, реакционную массу тщательно встряхивали и оставляли в темном месте на 5-11 суток. Параллельно ставили холостой опыт: к 12 мл исходного раствора NaI04 добавляли 13 мл дистиллированной воды и оставляли в темноте на тот же срок.
Расход периодата контролировали спектрофотометрически. По окончании окисления избыток NaI04 разлагали добавлением 2 мл этиленгликоля или глицерина в течение часа. Осадок отфильтровывали, тщательно промывали дистиллированной водой (для очистки от низкомолекулярных примесей), затем спиртом, эфиром и сушили 2 ч в вакууме (20-25 мм рт. ст.) при 61 С. Выход ау-базиданполиальдегида (АПА) 64-70%.
Аубазиданполиспирт (АПС). К суспензии 1 г аубазиданполиальдегида (АПА) в 100 мл дистиллированной воды добавляли порциями при перемешивании 0,79 г боргидрида натрия. Примерно через 30 мин реакционная масса загустевает и становится однородным гелем, насыщенным пузырьками водорода. Через сутки реакционную массу нейтрализовали 50% уксусной кислотой и упаривали при 40-50С в вакууме (15-20 мм рт.ст.). Продукт реакции осаждали ацетоном и АПС выделяли, как описано для АПА. Выход 69%.
Корапулан (Кор). 0,75 г Аубазиданполиспирта суспендировали в 250 мл дистиллированой воды. Перемешиваемую смесь нагревали до 100С, добавляли 1,1 мл 2н H2SO4 до рН 2, выдерживали при 100С 1,5 ч, охлаждали и нейтрализовали 2н NaOH до рН 6. Водный слой декантировали, осадок отфильтровывали и корапулан выделяли, как описано для АПА. Выход 77%.
Амилоза - линейный а-1,4-0-глюкан - полисахарид, состоящий из а-1,4-связанных глюкопиранозных фрагментов, выделяется из крахмала. Амилоза (молекулярная масса 2-нб 103) - белый аморфный порошок, плохо растворяется в воде, не растворяется в органических растворителях.
Амилозу выделяли из картофельного крахмала по методике, основанной на её способности (в отличие от амилопектина) растворяться в водных щелочах и образовывать нерастворимый в воде комплекс с 1-бутанолом. Комплекс разрушали этанолом, продукт отмывали от 1-бутанола этанолом или ацетоном и сушили в вакууме (20-25 мм рт.ст.) над СаСЬ при 18-20С 3-5 суток. Выход амилозы 8-10%. Средняя молекулярная масса выделенной амилозы, определенная вискозиметрическим методом, составляет около 400000. Выделение амилозы из картофельного крахмала.
В стеклянный сосуд с 4 л 0,157 н NaOH добавляли при перемешивании суспензию 35 г крахмала в 312 мл воды. Температура смеси должна быть не менее 22С. Оптимальная температура 25С. Смесь осторожно перемешивали до получения вязкого гомогенного раствора - в течение 5 минут. После этого к смеси добавляли 1100мл 5% раствора NaCl, перемешивали и нейтрализовали реакционную массу 1н соляной кислотой до рН=6,5-7,5. Емкость с реакционной массой оставляли на сутки в защищенном от света месте. За это время гель амилопектина оседал так, что составлял 1/2 первоначального объема.
Жидкость над гелем отсасывали через погружной фильтр. К раствору амилозы добавляли по частям примерно 10% н-бутанола, до образования насыщенного раствора и выпадения комплекса н-бутанола с амилозой. Комплекс отделяли центрифугированием (10 минут при 5000 об/сек), дважды промывали избытком спирта с последующим центрифугированием для отмывки от бутанола, растирали полученную амилозу в спирте или ацетоне, отфильтровывали и су 112 шили в вакуум-эксикаторе над СаСЬ в течение 3-5 суток. Выход амилозы на исходный крахмал составлял 8-10%, что соответствовало указанному в методике.
Определение молекулярной массы амилозы вискозиметрическим метод ом. Капиллярный вискозиметр Оствальда ВПЖ-2 с диаметром капилляра 0,99мм, вымытый хромовой смесью, термостатировали при 18±0,05С в водяном термостате. Амилозу высушивали в вакуум-пистолете при 61 С в течение 4 часов. 0,5 М раствор КОН готовили из твердого едкого кали (чда) и фильтровали через пористый стеклянный фильтр №16. Готовили растворы амилозы (0,6-3,7 мг/мл) в 0,5 М КОН.
