Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Ботанико-фармакогностическая характеристика диоскореи 11
1.1.1. Характеристика семейства диоскорейных 11
1.1.2.Ботанико-фармакогностическая характеристика диоскореи ниппонской и диоскореи супротивной 12
1.1.3. Особенности заготовки и сушки сырья диоскореи 16
1.1.4. Химический состав метаболома диоскореи ниппонской и диоскореи супротивной .18
1.2. Фармакологическая активность и медицинское применение сырья и препаратов диоскореи 20
1.3. Стандартизация сырья диоскореи 25
Выводы главы 1 26
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования 27
ГЛАВА 3. Морфолого-анатомическое изучение двух видов диоскореи 29
3.1. Изучение внешнего вида сырья диоскореи ниппонской и диоскореи супротивной .29
3.2. Анатомическое изучение корневищ с корнями диоскореи ниппонской 31
Выводы главы 3 36
ГЛАВА 4. Изучение состава биологически активных веществ диоскореи ниппонской и диоскореи супротивной и определение некоторых числовых показателей 37
4.1. Изучение состава БАВ сырья диоскорей ниппонской и супротивной с помощью качественных реакций 37
4.2.Изучение состава БАВ двух видов диоскореи методом ТСХ .38
4.3. Определение некоторых числовых показателей сырья диоскореи 46
4.3.1. Определение влажности сырья диоскореи.. 46
4.3.2. Определение содержания экстрактивных веществ 47
Выводы главы 4 49
ГЛАВА 5. Количественная оценка содержания отдельных групп БАВ диоскореи ниппонской и диоскореи супротивной 50
5.1. Определение содержания суммы стероидных сапонинов и диосгенина в сырье двух видов диоскореи 50
5.2. Определение содержания полисахаридов в сырье диоскореи 54
5.3. Определение содержания флавоноидов в сырье диоскореи
5.4. Определение содержания дубильных веществ в сырье диоскореи 62
5.5. Определение содержания в сырье диоскореи органических кислот 67
5.6. Определение содержания аскорбиновой кислоты в сырье диоскореи супротивной 71
5.7. Определение содержания аминокислот в сырье диоскореи ниппонской и супротивной 73
Выводы главы 5 77
ГЛАВА 6. Изучение фармакологической активности сырья диоскореи ниппонской и диоскореи супротивной 78
6.1. Изучение гипогликемической активности полисахаридов диоскореи супротивной 78
6.2. Изучение иммуномоделирующего действия сапонинов диоскореи ниппонской при адъювантном артрите 85
Выводы главы 6 90
ГЛАВА 7. Разработка проекта ФС Корневища с корнями диоскореи ниппонской 91
Выводы главы 7 92
Общие выводы 93
Литература
- Химический состав метаболома диоскореи ниппонской и диоскореи супротивной
- Анатомическое изучение корневищ с корнями диоскореи ниппонской
- Определение влажности сырья диоскореи..
- Определение содержания в сырье диоскореи органических кислот
Химический состав метаболома диоскореи ниппонской и диоскореи супротивной
Семейство диоскорейных – Dioscoreaceae – входит в порядок диоскореецветных класса однодольных цветковых растений. Оно представлено многолетними травянистыми растениями или кустарниками своеобразного габитуса. В подавляющем большинстве это вьющиеся растения с подземным запасающим клубнем или корневищем. Клубни достаточно крупные, несут всего один тонкий и недолговечный, чаще всего однолетний вьющийся побег, не успевающий, как правило, за один сезон существования подняться по своей опоре на большую высоту. Листья диоскорейных очередные, реже супротивные, достигающие иногда больших размеров, характеризуются пальчатым жилкованием с анастомозами между жилками первого порядка, чем создается сетчатость (что является более характерным для двудольных растений). Цветки большей частью мелкие, собранные в соцветия разных типов, двудомные, реже обоеполые, актиноморфные, трехчленные. Околоцветник из 6 сегментов, расположенных в два круга, большей частью сросшихся в короткую трубку. Тычинок 6, также расположенных в два круга, причем 3 внутренние иногда перекрещиваются в стаминодии или вообще не развиваются. Нити тычинок прикреплены к трубке околоцветника; гинецей синкарпный, с трехгнездной нижней завязью и свободными, более или менее сросшимися столбиками. В каждом гнезде завязи развивается по 2, реже 3–4 анатропных семязачатка. Плод диоскорейных обычно коробочка, иногда нераскрывающаяся крылатка, редко – ягода [20].
Семейство диоскорейных состоит из 2 подсемейств: диоскорейные (Dioscoreoideae) и трихоподовые (Trichopodoideae). Подсемейство собственно диоскорейных включает две трибы – стеномерисовых (Stenomerideae) и диоскорейных (Dioscoreae). Триба диоскорейных охватывает 6 родов, объединяющих более 700 родов: тамус, рейания, стеномерис, аветра, трихопус и диоскорея. Центральное место в трибе диоскорейных, и во всем семействе занимает род диоскорея – Dioscorea L., включающий 650 родов. Виды рода диоскорея распространены во всех тропических областях мира, исключая лишь некоторые обширные крайне засушливые территории Африки (Сахара) и Евразии (Аравийский полуостров) [20].
Н.И.Вавилов (1935) и английский ботаник Г.Беркилл (1960) центром происхождения рода диоскорея считали Восточную Азию. Отсюда, в отдаленные времена предки современных видов диоскореи мигрировали на запад до Европы и оставили на этом пути, как следы переселения, ареалы таких современных внетропических видов, как диоскорея ниппонская (Dioscorea nipponica Makino), диоскорея кавказская (Dioscorea caucasica Lipsky), диоскорея балканская (Dioscorea balcanica Koanin). Позднее и другим путем (через Берингию) виды секции мигрировали на северо-восток, в Северную Америку. Но большая часть видов и ныне сосредоточена в Японии, Китае и Юго-Восточной Азии [20].
Диоскорея ниппонская – Dioscorea nipponica Makino – (синонимы: диоскореия многокистевая – Dioscorea polystachya auct. non Turcz., диоскорея Жиральда – Dioscorea giraldii Knuth.) – многолетняя травяная лиана с вьющимися стеблями длиной до 4 м, реже более. Корневище горизонтальное, расположенное неглубоко от поверхности почвы, толстое. Мало разветвленное, коричневато-бурое, длиной до 1,5 м и до 2 см в диаметре, со следами отмерших стеблей, несущее на всем протяжении тонкие, жесткие, шнуровидные корни. Молодые участки корневища более светлые, желтоватые, мясистые, упругие, с крупными почками. Опробковевший наружный слой коры корневища легко отделяется в виде тонкой темноокрашенной, шелушащейся пленки. Стеблей несколько, они простые, голые.
Листья длиной 6–12 см, очередные, черешковые, широкояйцевидные с сердцевидным основанием. Нижние листья семи-лопастные, с короткими боковыми лопастями и более крупной, вытянутой, заостренной средней. Верхние листья трех- пяти-лопастные или с почти не выраженными лопастями. Листовые пластинки коротко-опушенные или у некоторых форм снизу густо и мягко-опушенные.
Цветки однополые, двудомные, около 3 мм в диаметре, с простым венчиковидным, глубоко шести-раздельным, желтовато-зеленоватым околоцветником. Тычиночные цветки обычно собраны по 3–7 в полузонтики, образующие простые, реже ветвистые пазушные кисти. Тычинок 6, прикрепленных к околоцветнику, пестик редуцирован. Пестичные цветки собраны в простую кисть с 1 пестиком и 6 редуцированными тычинками. Пестик с нижней трехлопастной завязью, коротким столбиком и 3 рыльцами (рис. 1.1.2.1).
Плод – почти сидячая, трех-гнездная, широко эллиптическая коробочка, длиной 1,6-2,5 см, с 3 широкими крыльями на ребрах и с выемкой на верхушке. Семена плоские, с длинным, тонко-перепончатым, оттянутым вверх крылом, длина семени без крыла 5–7 мм, ширина 2–4 мм [2]. Растение цветет в июле–августе, семена созревают в августе–октябре.
В России на территории Приморья и южного Приамурья преобладает разновидность с опушенными снизу листьями (Dioscorea nipponica var.rosthornii Prain et Burk.), которую некоторые исследователи выделяют в отдельный вид – диоскорею Жиральда. В долине реки Раздольной встречается разновидность с листьями, опушенными с двух сторон.
Анатомическое изучение корневищ с корнями диоскореи ниппонской
Микроскопические исследования анатомического строения сырья проводили согласно методикам ГФ XI и методикам, приведенным в научной литературе [15,19,51,52,53,].
На поперечном срезе видно, что корневище диоскореи ниппонской с наружной стороны покрыто тонким слоем перидермы. Узкая полоска коры состоит из мелких, тангентально-вытянутых клеток с неодревесневшими оболочками. В отдельных, более крупных клетках находятся пучки рафид длиной около 110 мкм, ориентированные строго вдоль корневища. Эндодерма выражена неясно. Центральный цилиндр занимает большую часть корневища, состоит из паренхимных клеток, среди которых без особого порядка расположены закрытые коллатеральные проводящие пучки. Паренхима корневища состоит из крупных, многоугольных клеток, плотно прилегающих друг к другу. Оболочки клеток одревесневшие, с многочисленными крупными порами. В клетках паренхимы в большом количестве встречаются крахмальные зерна, различные по форме (слегка угловатые, элипсовидные или округлые), их диаметр колеблется от 1,8 до 24 мкм. По периферии центрального цилиндра проводящие пучки более мелкие, слегка радиально вытянутые, ближе к центру – крупные, в очертании почти округлые (рис. 3.2.1; 3.2.2).
Корни диоскореи ниппонской покрыты двух-, трехслойным эпидермисом, несущим корневые волоски, клетки эпидермиса прямоугольные. Кора занимает поперечного сечения корня, представлена неодревесневшими паренхимными клетками. В наружных слоях коры располагаются более крупные клетки с пучками рафид, ориентированных вдоль корня. Эндодерма хорошо выражена. В центральном цилиндре насчитывается 13–15 сосудистых групп. Участки ксилемы чередуются с участками флоэмы. Над флоэмой располагаются группы волокон. Крахмал в клетках паренхимы отсутствует. Поперечный срез корневища диоскореи ниппонской. Ув. х 90. 4
Поперечный срез корневища диоскореи ниппонской. Ув. х 90. 1– клетки паренхимы; 2– крахмальные зерна. Изучение анатомического строения измельченных корневищ с корнями диоскореи проводили с использованием методики изготовления «давленного» препарата [15,19,51]. Для микроскопической картины измельченного сырья диоскореи характерно наличие обрывков клеток перидермы. Видны обрывки крупных многоугольных толстостенных клеток основной паренхимы, обрывки сосудов с окаймленными порами (диаметром 16–55 мкм). Клетки паренхимы с пучками рафид, клетки с крахмальными зернами (рис. 3.2.3).
Используя собственные экспериментальные данные и материалы, представленные в нормативных документах и научной литературе [51,95], была составлена сравнительная характеристика диагностических признаков анатомического строения корневищ двух видов диоскорей – ниппонской и супротивной (табл. 3.2.1).
Примечание: по лит. данным [51,95] Анализ выявил общий признак, характеризующий их как представителей рода диоскорея – наличие пучков рафид, ориентированных строго по длине корневища. Отличить два вида диоскореи, особенно в измельченном виде, можно по строению паренхимных клеток, наличию других включений оксалата кальция (в форме мелких кубических кристаллов), каменистых клеток, механических волокон с сильно одревесневшими стенками, форме крахмальных зерен
1. Проведено морфологическое изучение корневищ с корнями диоскореи ниппонской и корневищ диоскореи супротивной и дана характеристика внешнего вида цельного сырья.
2. Проведено анатомическое изучение корневищ с корнями диоскореи ниппонской. Выявлены и визуализированы диагностические признаки: строение проводящих пучков, клеток паренхимы, наличие пучков рафид, ориентированных по длине корневища, форма и размер крахмальных зерен.
3. Сравнительный анализ анатомического строения корневищ диоскореи ниппонской и диоскореи супротивной выявил признаки, позволяющие различать эти виды сырья друг от друга.
Анализ литературных данных показал, что химический состав БАВ корневищ с корнями диоскореи ниппонской и корневищ диоскореи супротивной изучен не в полном объеме, в связи с чем было проведено изучение качественного состава этих видов сырья с использованием цветных реакций и метода ТСХ [5,7,12,14,25,28,31,42,54,58].
Для проведения качественных реакций готовили спиртовое и водное извлечения из корневищ с корнями диоскореи ниппонской и корневищ диоскореи супротивной по следующей методике: 5 г измельченного сырья, проходящего сквозь сито с диаметром отверстий 3мм, помещали в коническую колбу вместимостью 250 мл, заливали 50 мл воды (для приготовления водного извлечения) или 50 мл 70% спирта этилового (для приготовления спиртового извлечения) и нагревали с обратным холодильником на водяной бане в течение 30 мин при периодическом перемешивании. Полученное извлечение охлаждали до комнатной температуры, фильтровали через складчатый бумажный фильтр.
С полученными извлечениями проводили качественные реакции на основные группы БАВ, включенные в ГФ ХI изд., а также применяемые в научной литературе. В результате проведенных реакций в сырье двух видов диоскореи было показано присутствие сапонинов, дубильных веществ, флавоноидов, полисахаридов (табл. 4.1.1.). Таблица 4.1.1. Результаты качественных реакций на основные группы БАВ в извлечениях из сырья диоскореи.
На следующем этапе исследования в сырье двух видов диоскорей хроматографически (методом ТСХ) было подтверждено присутствие основных классов БАВ. При проведении ТСХ-анализа были использованы как фармакопейные методики, так и методики, приведенные в научной литературе [16,36,55,57,73]. ТСХ-анализ использовали для доказательства присутствия стероидных сапонинов, флавоноидов, аскорбиновой кислоты, органических кислот, свободных сахаров, аминокислот.
При проведении анализа использовали водные и спиртовые извлечения из корневищ с корнями диоскореи ниппонской и корневищ диоскореи супротивной. Извлечения готовили по следующей методике: 5 г измельченного сырья помещали в колбу со шлифом вместимостью 200 мл, прибавляли 100 мл экстрагента (воды или 70% спирта). Колбу присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на водяной бане при температуре не более 40С в течение 20 мин, периодически встряхивая для смывания частиц сырья со стенок. Затем извлечение охлаждали до комнатной температуры и фильтровали через вату и складчатый бумажный фильтр.
В анализе использовали пластинки «Сорбфил ПТСХ АФ-УФ», на которые наносили по 10 мкл каждого извлечения и растворы имеющихся стандартов. Хроматографирование проводили восходящим способом. После хроматографирования пластинку вынимали из камеры, сушили на воздухе в течение 5 мин и обрабатывали соответствующим детектирующим реагентом и прогревали при 105-110о С.
В качестве «свидетелей» использовали растворы ГСО диосгенина (Shanghai yuanye), РСО рутина, кверцетина, аскорбиновой кислоты, яблочной кислоты, лимонной кислоты, щавелевой кислоты, глюкозы, рамнозы, фруктозы, маннозы, валина, аргинина, пролина.
Определение влажности сырья диоскореи..
Корневища с корнями диоскореи ниппонской и корневища диоскореи супротивной в Китае применяются либо в виде порошка, либо – отвара или спиртовой настойки. В связи с чем мы сочли целесообразным определить в этих видах сырья содержание экстрактивных веществ, извлекаемых водой и 70% спиртом. Определение влажности сырья было необходимо для дальнейшей количественной оценки отдельных групп БАВ.
Определение влажности сырья диоскореи ниппонской и диоскореи супротивной Определение влажности в объектах исследования проводили в соответствии с методикой ОФС ГФ XI «Определение влажности лекарственного растительного сырья» [15].
Методика: аналитическую пробу сырья измельчали до размера частиц около 10 мм, перемешивали и брали навеску массой около 3 г, взвешенную с погрешностью ±0,01 г. Навеску помещали в предварительно высушенный и взвешенный бюкс и помещали в нагретый до 100–105С сушильный шкаф. Первое взвешивание проводили через 2 часа. Высушивание осуществляли до постоянной массы. Постоянная масса считалась достигнутой, если разница между двумя последующими взвешиваниями после 30 мин высушивания и 30 мин охлаждения в эксикаторе не превышала 0,01 г. Влажность сырья (Х) в процентах рассчитывали по формуле:
Установлено, что значение влажности корневищ с корнями диоскореи ниппонской в среднем составило 8,45±0,47%, что соответствует как требованиям ФС 42-1521-80 (не более 13%), так и ГФ Китая (не более 9%) для корневищ диоскореи супротивной влажность составила 7,65±0,11% (числовые показатели для этого вида диоскореи в ГФ Китая отсутствуют).
Определение содержания экстрактивных веществ в сырье двух видов диоскореи. Содержание экстрактивных веществ является показателем, характеризующим всю группу БАВ ЛРС, извлекаемых соответствующим экстрагентом. В качестве одного из экстрагентов использовался 50% этиловый спирт, так как при изготовлении настойки диоскореи в Китае используется спирт этой концентрации.
Определение суммы экстрактивных веществ, извлекаемых водой и водно-спиртовой смесью, в сырье двух видов диоскореи проводили по методике ОФС ГФ XI «Определение содержания экстрактивных веществ в лекарственном растительном сырье» [15].
Методика: около 1 г измельченного сырья (точная навеска), просеянного сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм, помещали в коническую колбу вместимостью 200 мл, прибавляли 50 мл воды или 50 мл 50% спирта этилового, колбу закрывали пробкой, взвешивали (с погрешностью ±0,01 г) и оставляли на 1 ч. Затем колбу соединяли с обратным холодильником, нагревали, поддерживая слабое кипение в течение 2 ч. После охлаждения колбу с содержимым вновь закрывали той же пробкой, взвешивали и потерю в массе восполняли экстрагентом. Содержимое колбы тщательно взбалтывали и фильтровали через сухой бумажный фильтр в сухую колбу вместимостью 200 мл. 25 мл фильтрата пипеткой переносили в предварительно высушенную при температуре 100- 105С до постоянной массы и точно взвешенную фарфоровую чашку диаметром 7 - 9 см и выпаривали на водяной бане досуха. Чашку с остатком сушили при температуре 100 - 105С до постоянной массы, затем охлаждали в течение 30 мин в эксикаторе, на дне которого находился безводный кальция хлорид, и немедленно взвешивали.
Содержание экстрактивных веществ в процентах (Х) в пересчете на абсолютно сухое сырье вычисляли по формуле:
Х где m - масса сухого остатка в граммах; п - масса сырья в граммах; W - потеря в массе при высушивании сырья в процентах.
Полученные результаты представлены в табл. 4.3.2.1. Установлено, что содержание в сырье диоскореи ниппонской экстрактивных веществ, извлекаемых водой и 50% спиртом этиловым, в пересчете на абсолютно сухое сырье составило 27,31±0,80% и 33,86±0,60% соответственно, в сырье диоскореи супротивной - 28,74±0,10% и 34,87±0,62%. Полученные результаты показывают, что сырье диоскореи ниппонской и диоскореи супротивной содержит близкие количества суммы БАВ.
Определение содержания в сырье диоскореи органических кислот
Проведенные исследования показали, что в корневищах диоскореи супротивной содержаится свободных аминокислот в 3,6 раза больше, чем в корневищах с корнями диоскореи ниппонской (7,26% и 2,01% соответственно).
Незаменимые аминокислоты (треонин, валин, метионин, изолейцин, фенилаланин, лизин) присутствуют в подземных органах обоих видов диоскореи. В корневищах с корнями диоскореи ниппонской преобладают аспартат и аланин, на долю каждой аминокислоты приходится 10,45% от общей суммы. В корневищах диоскореи супротивной основными свободными аминокислотами основными являются серин (15,43% от общей суммы), а также аспартат и глутамат (12,53% от общей суммы на каждую аминокислоту).
1. Дана количественная оценка БАВ, входящих в метаболом сырья диоскореи ниппонской и диоскореи супротивной: суммы стероидных сапонинов, диосгенина, полисахаридов, флавоноидов, дубильных веществ, органических кислот, аскорбиновой кислоты и свободных аминокислот.
2. Установлено, что корневища с корнами диоскореи ниппонской содержат 3,86±0,03% суммы фурастаноловых гликозидов и 2,2% диосгенина; 7,25±0,03% полисахаридов; 0,18% суммы флавоноидов в пересчете на кверцетин; 0,53±0,08% дубильных веществ в пересчете на танин; 0,64±0,06% суммы органических кислот в пересчете на кислоту лимонную.
3. Корневища диоскореи супротивной содержат 3,50±0,02% суммы фурастаноловых гликозидов и 2,0% диосгенина; 19,49±0,04% полисахаридов; 0,94% суммы флавоноидов в пересчете на рутин; 0,26±0,07% дубильных веществ в пересчете на танин; 0,57±0,02% суммы органических кислот в пересчете на кислоту лимонную; 0,16±0,07% аскорбиновой кислоты. 4. Подземные органы диоскореи ниппонской и диоскореи супротивной отличаются как по качественному составу свободных аминокислот, так и по их содержанию.
5. В корневищах диоскореи супротивной присутствуют 17 свободных аминокислот, содержание которых составляет 7,26%. Основными являются серин, глутамат, аспартат. В корневищах с корнями диоскореи ниппонской присутствуют 16 аминокислот, содержание которых составляет 2,01%. Основными являются аспартат и аланин.
Согласно данным статистики в мире наблюдается интенсивный рост заболеванием сахарном диабетом. По сравнению с 2010г число больных увеличилось на 30% и составило 366 млн. человек. Фактическая же распространенность заболевания в 3–4 раза превосходит регистрируемую. Необходимо отметить, что 90–95% – это больные сахарным диабетом в возрасте 35–49 лет, число вновь заболевших каждые 15 лет удваивается [11,39]. Авторами ряда работ отмечено, что ЛРС, содержащее сапонины, обладает достаточно выраженным гипогликемическим действием [1,36]. Так же следует принять во внимание наличие в подземных органах диоскореи свободной фруктозы. В качестве объекта исследования выступала сумма полисахаридов корневищ диоскореи супротивной, которую получали следующим образом: измельченное до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм, сырье экстрагировали горячей водой (температура 60-80оС). Полученное извлечение концентрировали под вакуумом и затем полисахариды осаждали спиртом.
Исследование проводили на 80 белых беспородных мышах-самцах с массой тела 22,0±2,0 г. Животные были разделены на 8 групп, по 10 животных в каждой, и 2 потока (по 4 группы в каждом потоке). Первый поток (группы 1 - 4) был контрольным, второй (группы 5 -8) - опытный. У животных опытного потока вызывали аллоксановый диабет введением аллоксана в дозе 150 мг/кг [6,47]. Через 3 дня в крови животных определяли содержание глюкозы, при ее содержании 10 ммоль/л и более мышь считалась диабетической.
Изучали влияние полисахаридов диоскореи супротивной на вес диабетических животных и содержание в крови глюкозы.
В течение 30 дней первая группа животных (NC) получала дистиллированную воду, 2,3,4 группы животных - разные дозы полисахаридов диоскореи (10, 20, 30 мг/кг соответственно). У животных с аллоксановым диабетом 5-я группа служила контролем (СД) и животные получали дистиллированную воду. Мышам 6,7,8 групп вводили полисахариды диоскореи в дозах 10, 20, 30 мг/кг соответственно. Полисахариды вводили однократно, перорально, при помощи желудочного зонда.
В конце эксперимента перед определением содержания глюкозы животных контрольного и опытного потока подвергали лишению корма в течение 6 час при свободном доступе к воде. Уровень глюкозы в крови животных определяли через 0, 6,120 мин.
![Фитохимическое изучение зверобоя продырявленного (Hypericum perforatum L.) флоры Башкортостана и перспективы создания на его основе новых лекарственных средств [Электронный ресурс]](/i/i/4374/196937.png "Фитохимическое изучение зверобоя продырявленного (Hypericum perforatum L.) флоры Башкортостана и перспективы создания на его основе новых лекарственных средств [Электронный ресурс] Файзуллина Рената Ринатовна")
