Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Свойства и методы анализа
производных адамантана и сиднонимина 9
1.1. Производные адамантана. Ладастен 9
1.1.1. История создания, фармакологические и физико-химические свойства ладастена 9
1.1.2. Фармакологические и физико-химические свойства производных адамантана 13
1.1.3. Методы анализа производных адамантана. 14
1.1.3.1. ИК-спектрофотометрия 14
1.1.3.2. УФ-спектрофотометрия 18
1.1.3.3. ЯМР-спектроскопия 19
1.1.3.4. Химические реакции определения подлинности 20
1.1.3.5. Хроматография в тонком слое сорбента 21
1Л .3.6. Газожидкостная хроматография. 24
1.1.3.7. Высокоэффективная жидкостная хроматография 26
1.1.3.8. Титриметрические методы анализа 28
1.2. Производные сиднонимина. Сиднокарб. 30
1.2.1. Фармакологические и физико-химические свойства сиднокарба и других производных сиднонимина 30
1.2.2. Методы анализа сиднокарба. 34
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 36
ГЛАВА 3. РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ АНАЛИЗА И УСТАНОВЛЕНИЕ НОРМ КАЧЕСТВА СУБСТАНЦИИ ЛАДАСТЕНА 41
3.1. Физико-химические свойства ладастена 41
3.1.1. Внешний вид, растворимость, температура плавления ладастена... 41
3.1.2. Спектральные характеристики ладастена 42
3.2. Разработка методов анализа субстанции ладастена 49
3.2.1. Разработка качественной реакции определения подлинности ладастена 49
3.2.2. Разработка методики ТСХ для обнаружения посторонних примесей в субстанции ладастена 50
3.2.3. Разработка методики количественного определения ладастена. 64
3.3. Изучение основных показателей качества и стабильности серийных образцов ладастена. Установление норм качества и срока годности субстанции ладастена 68
3.3.1. Прозрачность и цветность растворов 68
3.3.2. Определение потери в массе при высушивании и содержания
остаточного органического растворителя 68
3.3.3. Изучение стабильности при хранении, установление срока годности, показателей и норм качества фармакопейной субстанции ладастена 72
ВЫВОДЫ 77
ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ АНАЛИЗА И УСТАНОВЛЕНИЕ
НОРМ КАЧЕСТВА ТАБЛЕТОК «ЛОКСИДАН» 79
4.1. Разработка методик определения подлинности и обнаружения примесей в таблетках локсидана с помощью метода ТСХ 79
4.2. Использование УФ-спектрофотометрии для разработки методики идентификации действующих веществ в локсидане 80
4.3. Разработка методики количественного определения действующих веществ в локсидане 85
4.3.1. Количественное определение сиднокарба и ладастена в таблетках спектрофотометрическим методом 85
4.3.2. Количественное определение сиднокарба и ладастена в таблетках методом ВЭЖХ 96
4.3.3. Сравнение методов ВЭЖХ и УФ-спектрофотометрии при количественном анализе модельных смесей локсидана 106
4.4. Разработка методики определения однородности дозирования
таблеток локсидана 112
4.5. Разработка теста «растворение» для таблеток локсидана 113
4.6. Изучение стабильности локсидана 123
4.7. Установление срока годности, показателей и норм качества таблеток локсидана 124
ВЫВОДЫ Т. 127
ОБЩИЕ ВЫВОДЫ 133
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 135
ПРИЛОЖЕНИЯ 150
ПРИЛОЖЕНИЕ 1.ФСП 42- «Ладастен»
ПРИЛОЖЕНИЕ 2. Разрешение на проведение клинических испытаний ладастена№26от23.01.2003
ПРИЛОЖЕНИЕ З.ФСП 42- «Локсидан» таблетки
- Производные адамантана. Ладастен
- ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
- Физико-химические свойства ладастена
- Разработка методик определения подлинности и обнаружения примесей в таблетках локсидана с помощью метода ТСХ
Введение к работе
Актуальность темы. Сегодня психостимуляторы применяются не только для лечения заболеваний, но и в разных областях профессиональной деятельности, где требуется длительное и непрерывное поддержание работоспособности на высоком уровне, или есть необходимость быстро мобилизовать ресурсы организма.
В частности, боеспособность армии в связи с усложнением систем управления военной техникой, оснащением ее компьютерами все более зависит от функционального состояния организма и работоспособности человека-оператора. Деятельность личного состава воинских подразделений, особенно спецформирований, часто осуществляется в ситуациях, требующих экстренного повышения бое- и работоспособности, переносимости высоких физических и эмоциональных нагрузок. Кроме того, работа в экстремальных условиях (ликвидация последствий аварий и катастроф, работа в районах вооруженных конфликтов) создает повышенный риск формирования психоэмоциональных расстройств [27, 55, 66, 86, 144, 165].
Для сохранения и повышения работоспособности и адаптации субъекта к экстремальным условиям деятельности могут служить психостимуляторы мобилизующего типа действия, которые задерживают развитие нервно-психического утомления и продлевают период эффективной операторской деятельности [19, 62].
Однако применяемые в мировой практике психостимуляторы имеют ограничения по выраженности психостимулирующего действия, а также обладают нежелательным последействием в виде истощающего влияния и существенного снижения резервных возможностей организма. Для указанных препаратов характерны узкий дозовый диапазон психостимулирующего действия, зависимость фармакологического эффекта как от вида осуществляемой деятельности, так и от исходного состояния субъекта, индивидуальная чувствительность, наличие выраженного периферического симпатомиметического действия, довольно высокая токсичность и наркоманический потенциал [125, 131, 150].
Действие известных природных адаптогенов и ноотропов развивается при курсовом назначении, их эффективность индивидуальна, а психомоторная стимуляция выражена весьма незначительно [20, 23, 25].
В институте Фармакологии на основе фундаментальных исследований найдено новое биологически активное вещество, обладающее психостимулирующим действием с анксиолитическим компонентом, — «ладастен», которое лишено недостатков, присущих классическим психостимуляторам. С целью создания нового психостимулирующего фармакологического средства была предложена комбинация лекарственных веществ, включающая наряду с ладастеном сиднокарб в оптимальном соотношении. Таблетки с данной комбинацией действующих веществ получили название «локсидан». В связи с этим изучение свойств, разработка методик анализа и создание нормативной документации на ладастен и локсидан являются весьма актуальными.
Цель настоящей работы — изучение физико-химических свойств, разработка методик фармацевтического анализа и составление нормативной документации на субстанцию нового психо- и иммуностимулирующего средства ладастена и таблетки нового комбинированного психостимулирующего препарата локсидана.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: изучить физические, физико-химические и химические свойства субстанции ладастена; изучить хроматографическое поведение в тонком слое сорбента ладастена и его возможных примесей, а также смеси ладастена с сиднокарбом; - проанализировать характер поглощения растворов смеси сиднокарба и ладастена в УФ-области спектра;
7 подобрать условия хроматографического разделения смеси сиднокарба и ладастена методом ВЭЖХ; на основании проведенных исследований разработать методики идентификации, количественного анализа и определения других показателей качества субстанции ладастена и таблеток локсидана; выбрать оптимальные условия для оценки качества таблеток локсидана по тесту «растворение»; изучить стабильность ладастена и локсидана при хранении, установить сроки их годности и определить условия хранения; установить показатели и нормы качества субстанции ладастена и таблеток локсидана и составить соответствующие проекты Фармакопейных статей предприятия.
Научная новизна. Впервые проведено комплексное фармацевтическое изучение ладастена — нового психо- и иммуностимулирующего средства и локсидана — нового комбинированного психостимулирующего препарата.
Изучены физические, физико-химические и химические свойства ладастена, в том числе методами УФ-, ИК-, 'Н-ЯМР-спектроскопии и хроматографии.
Исследовано хроматографическое поведение смеси сиднокарба и ладастена как в тонком слое сорбента, так и методом ВЭЖХ, подобраны условия их оптимального разделения. Определена возможность использования спектральных характеристик и хроматографических методов для фармацевтического анализа ладастена, сиднокарба и локсидана.
Изучены УФ-спектры индивидуальных и смешанных растворов сиднокарба и ладастена. Показано, что метод УФ-спектрофотометрии может быть использован для количественного определения ладастена и сиднокарба при их совместном присутствии.
Изучена стабильность субстанции ладастена и таблеток локсидана при хранении, и установлены сроки их годности. Рассмотрено влияние факторов внешней среды, а именно света и воздуха, на стабильность локсидана.
8 Показано, что действующие вещества таблеток, особенно сиднокарб, неустойчивы в данных условиях хранения.
Подобраны условия проведения теста «растворение» таблеток локсидана, особенностью которых является то, что оба действующих вещества практически нерастворимы в воде.
Практическая значимость. Разработаны методики аналитического контроля, и установлены показатели и нормы качества ладастена и локсидана. Результаты исследований реализованы в подготовленных проектах Фармакопейных статей предприятия на субстанцию ладастена и таблетки локсидана. Получено разрешение на проведение клинических испытаний ладастена (см. приложение 2).
Апробация работы. Основные результаты выполненной работы доложены на межлабораторных конференциях НИИ Фармакологии РАМН (2001 - 2003 гг.) и на заседании кафедры фармацевтической химии фармацевтического факультета ММА им. И.М. Сеченова (26.09.2003).
Публикация результатов исследования. По теме диссертации опубликованы три работы.
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова ив рамках плановой тематики ГУ НИИ Фармакологии РАМН..
На защиту выносятся: результаты комплексного фармацевтического изучения нового психо- и иммуностимулирующего средства — ладастена и нового комбинированного препарата на его основе — локсидана, полученные с использованием спектральных, хроматографических и других методов анализа, а именно: разработанные методики анализа субстанции ладастена; разработанные методики анализа таблеток локсидана; - результаты по изучению стабильности ладастена и локсидана и влияния факторов внешней среды на качество локсидана.
9 v ГЛАВА 1. СВОЙСТВА И МЕТОДЫ АНАЛИЗА ПРОИЗВОДНЫХ АДАМАНТАНА И СИДНОНИМИНА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)
ТЛ. Производные адамантана. Ладастен
1.1.1. История создания, фармакологические и физико-химические свойства ладастена
Работа по синтезу и изучению фармакологических свойств производных адамантана проводится в НИИ Фармакологии РАМН с 1966 года. Здесь были синтезированы и фармакологически исследованы производные адамантана, замещенные по мостиковому положению углерода, и проведен скрининг адамантансодержащих соединений с целью отбора веществ с низкой токсичностью и селективным действием на иммунную и нервную системы организма. В ходе исследований установлено, что введение в качестве заместителя у азота 2-аминоадамантана ароматического кольца при минимальном расстоянии между ними повышает стимулирующие свойства вещества. Поэтому был синтезирован и фармакологически изучен ряд ароматических производных 2-аминоадамантана, родоначальником которых стал №(2-адамантил)анилин. Это соединение проявило, однако, высокую токсичность. Последующее введение галогена в п-положение ароматического ядра: Ы-(2-адамантил)анилина увеличило его фармакологическую активность, а именно стимулирующее действие на физическую работоспособность [1, 68, 91].
Так фундаментальные исследования привели к созданию нового лекарственного средства из группы производных адамантана, обладающего психостимулирующими, анксиолитическими и иммуностимулирующими свойствами - бромантана [1, 6, 27, 68, 78, 81, 91, 92]. Дальнейшее изучение показало, что бромантан как крупнокристаллическое и малорастворимое вещество имеет недостаточную биодоступность. С целью ее повышения была
10 изменена технология получения препарата. Мелкокристаллическая субстанция, которую получают по новой технологии, обеспечивает достоверное повышение физической работоспособности, в то время как эффект крупнокристаллического вещества, приготовленного прежним способом, проявляется лишь в тенденции повышения работоспособности [76]. Впоследствии были проведены дополнительные фармакологические исследования, расширены показания к применению, и препарат получил название «ладастен».
Обладая психостимулирующими, транквилизирующими, иммуностимулирующими свойствами и положительным влиянием на когнитивные функции, ладастен может применяться для лечения астенических состояний и в случае необходимости повышения операторской и физической работоспособности, особенно в экстремальных условиях. При этом он не имеет недостатков известных психостимуляторов фенилалкиламиновой структуры и их аналогов [1, 6, 27, 56, 68, 69, 76, 78, 81, 91,92,103].
Ладастен, сочетая в себе нейро- и иммунотропную активность, относится к классу нейроиммуномодуляторов. Его психостимулирующее действие значительно более слабое, чем у фенамина и сиднокарба. Но он, в отличие от последних, существенно повышает физическую работоспособность в обычных и осложненных условиях. Кроме того, ладастену свойственна иммунокорректорная активность при вторичных иммунодефицитах.
В; противоположность сиднокарбу и фенамину ладастен не обладает наркоманическим потенциалом, не вызывает избыточной и истощающей активации симпатоадреналовой системы, не замедляет восстановление при профилактическом применении перед предстоящей деятельностью в осложненных условиях и не характеризуется прогипоксической активностью. Плюс ко всему препарат мало токсичен (LD50 5640 мг/кг) и практически не имеет побочных эффектов [22, 28, 29, 62, 65, 67, 69, 78, 89, 103, 111, 117].
По химическому строению ладастен представляет собой 1Ч-(адамант-2-ил)-Ы-(п-бромфенил)амин:
Брутто-формула: Ci6H2oBrN, молекулярная масса: 306,27. На первой стадии синтеза из адамантана получают адамантан-2-он при нагревании с концентрированной серной кислотой [80, 85]. + 3H20 + 2S02 + 2H2S04 (96%) адамантан адамантан-2-он
Ладастен получают по реакции Лейкарта кипячением смеси адамантан-2-она с п-броманилином в муравьиной кислоте [6]. Образующийся гидрохлорид ладастена переводят затем в основание.
+ НСООН неї, н2о п-броманилин адамантан-2-он
неї + CO, + н,о ладастена гидрохлорид
ладастена гидрохлорид ладастен
Полученная субстанция представляет собой полидисперсный кристаллический порошок, основная фракция которого (80%) - частицы с размером от 315 до 2000 мкм [52]. По внешнему виду это белый или белый с кремоватым оттенком кристаллический порошок, мало растворимый в спирте, легко растворимый в хлороформе и эфире, практически нерастворимый в воде. Порошок плавится в пределах 2С в интервале температур 105 - 111С. Ультрафиолетовый спектр его 0,001% хлороформного раствора в области от 220 до 360 нм имеет основной максимум поглощения при длине волны 260±2 нм [1, 6, 56].
Известно, что степень дисперсности влияет на биодоступность малорастворимых лекарственных веществ. Поэтому с целью повышения биологической доступности был приготовлен путем перекристаллизации полученной субстанции из изопропилового спирта мелкокристаллический порошок, который и получил название «ладастен» [76]. В связи с новым способом получения изменилось и качество субстанции, таким образом, возникла необходимость разработки нормативной документации на ладастен.
13 1.1.2. Фармакологические и физико-химические свойства производных адамантана
Как уже говорилось, ладастен — эточдроизводное адамантана. Сам же адамантан, или трицикло[3,3,1 ,13'7]декан, впервые получили С. Ланда и В. Махачек в 1933 году, выделив его из нефти, а в настоящее время существует несколько вариантов синтеза адамантана. Каркас этого соединения как бы спаян из трех циклогексановых колец, находящихся в конформации «кресло». Атомы углерода при этом расположены так же, как в кристаллической решетке алмаза (по-гречески «адамантос» - алмаз).
Это очень жесткая, но лишенная напряженности конструкция. При небольшой молекулярной массе адамантан имеет высокую температуру плавления (269С), но в тоже время летуч и отгоняется из нефти при 185 — 190 С. При охлаждении он кристаллизуется в виде октаэдров, обладающих камфорным запахом..
Адамантан - очень стабильное соединение, устойчивое к действию кислот, щелочей и окислителей. Он содержит два типа углеродных атомов: мостиковые (-CHj-) и узловые (-СН<). Адамантан легко бромируется по узловым атомам углерода; нитрование возможно по узловому атому углерода при высоких температуре и давлении; гидроксилирование по любому атому углерода осуществляют действием перуксусной кислоты при УФ-облучении; при окислении триоксидом хрома можно получить адамантан-2-он [14].
Адамантан обладает высокой липофильностью. С наличием объемного и высоколипофильного ядра у производных адамантана во многом связаны особенности их биологического действия. Этим определяется возможность
14 непосредственного взаимодействия молекул производных адамантана с биологическими мембранами, содержащими липидный слой, а также с гидрофобными фрагментами белков. Высокая липофильность и объемность структуры адамантанового ядра при его введении в молекулы биологически активных веществ значительно модифицирует их фармакологическое действие, а также приводит к улучшению проникновения фармакофорной части молекулы через биологическую мембрану.
Среди производных адамантана есть лекарственные препараты различного действия (см. табл. 1).
Кроме приведенных в таблице препаратов известны производные адамантана, обладающие психостимулирующим, адаптогенным, иммунотропным, противоопухолевым, антибактериальным и другим действием [12, 69, 102]. По внешнему виду в основном это белые или почти белые кристаллические порошки. В литературе описаны различные методы анализа адамантильных соединений.
1.1.3. Методы анализа производных адамантана
1.1.3.1. ИК-спектрофотометрия
ИК-спектроскопия относится к общим методам идентификации, применимым ко всем веществам. Этот метод позволяет установить четкие эмпирические закономерности, связывающие структуру вещества с параметрами спектра [30, 70]. Главным преимуществом РПС-спектроскопии является наивысшая из всех методов идентификации объективность. В фармацевтическом анализе инфракрасные спектры используются для определения подлинности и количественного анализа препаратов [31, 93].
Обычно снимают спектры в дисках калия бромида. Получаемый ИК-спектр сравнивают со стандартным спектром, приведенным в НТД, или со
Таблица 1 Лекарственные препараты - производные адамантана
Продолжение таблицы 1
Окончание таблицы 1
18 спектром вещества-стандарта, записываемого параллельно в тех же условиях [100]. Рисунки ПК-спектров поглощения многих лекарственных субстанций приведены в британской фармакопее и дополнениях к ней. Изданы атласы ИК-спектров различных химических соединений [11, 95, 156].
В анализе производных адамантана ИК-спектроскопию используют для определения подлинности субстанций ремантадина и гимантана, субстанций и лекарственных форм мемантина и мидантана.
1.1.3.2. УФ-спектрофотометрия
Спектрофотометрия остается по-прежнему самым широко используемым методом анализа. В настоящее время для всех лекарственных субстанций, имеющих характеристическое поглощение в ультрафиолетовой и видимой областях спектра, в разрабатываемых фармакопейных статьях необходимо вводить идентификацию с помощью электронных спектров: поглощения. Преимуществом спектрофотометрии является возможность совмещения идентификации с количественным определением, относительная простота и доступность, а также экспрессность [100].
Адамантан как насыщенный углеводород не поглощает электромагнитное излучение в УФ-области спектра. Поглощение производных адамантана обусловлено наличием у них функциональных групп. Так, УФ-спектр растворов кемантана имеет максимум поглощения 285±2 нм в воде, 290±2 нм в спирте и 293±2 нм в хлороформе, поэтому кемантан в таблетках предлагается идентифицировать по спектру водных растворов [85].
Идентификацию и количественное определение многокомпонентного препарата «бромитил», содержащего бромантан и бемитил, предложено также проводить спектрофотометрическим методом. УФ-спектр спиртового извлечения из таблеток имеет максимумы поглощения при 258±2 нм, что
19 соответствует поглощению бромантана, и при 285±2 нм и 292±2 нм, что соответствует поглощению бемитила [64].
1.1.3.3. ЯМР-спектроскопия
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса в последнее время все чаще используется для идентификации лекарственных субстанций. Метод описан в ведущих фармакопеях мира, в том числе в ГФ XI издания. В фармацевтическом анализе спектроскопия ЯМР находит применение в следующих областях: изучение строения лекарственных средств, их комплексов, метаболитов, продуктов реакции, идентификация, исследование стабильности, определение примесей и оптической чистоты, количественное определение лекарственных средств [41,46,48, 132, 140, 147, 154].
В анализе лекарств в настоящее время широко применяется ядерный магнитный резонанс на протонах — ПМР ( Н-ЯМР).
Информацию о строении химического соединения можно получить на основании следующих характеристик ЯМР-спектра: химических сдвигов (5, м.д. — миллионных долей), мультиплетности, констант спин-спинового взаимодействия (J, Гц) и интегральных площадей сигналов резонанса.
В качестве растворителей в методе протонного магнитного резонанса используют соединения, не содержащие протонов, или деитерированные соединения, в ПМР-спектрах которых появляется только один сигнал. Используют дейтерированную воду — D20, хлороформ — CDCb, диметилсульфоксид - C2D6OS, диметилсульфоксид — C2D6OS с добавлением дейтерированной трифторуксусной кислоты — CF3COOD.
Эталонами измерения химических, сдвигов для спектров ПМР в растворах органических растворителей обычно служит тетраметилсилан (СНз^і (ТМС), 5=0,00 м.д., в водных растворах можно использовать 2,2-
20 диметил-2-силапентан-5-сульфонат натрия, 5=0,015 м.д. [33, 39, 42, 43, 45, 54, 88].
Основные ограничения метода спектроскопии ЯМР — относительно низкая чувствительность определения, и сравнительно высокая стоимость приборов. Последнее, несмотря на высокую специфичность ЯМР, не позволяет широко применять данный метод для контроля качества отечественных препаратов [100].
В литературных источниках описано использование 'Н-ЯМР-спектроскопии при анализе 2-аминоадамантана, 1-аминоадамантана, ремантадина, кемантана и мемантина [47, 139].
1.1.3.4. Химические реакции определения подлинности
Химические реакции установления подлинности характеризуются, с одной стороны, простотой и быстротой, а с другой стороны, малой специфичностью, поэтому в настоящее время они рассматриваются только как дополнение к другим методам идентификации [100].
Химические свойства препаратов — производных адамантана определяются прежде всего наличием адамантильного радикала, а также присутствием различных заместителей. Из литературы [60] известна реакция окисления адамантана в присутствии концентрированной серной кислоты при нагревании с образованием адамантанона, которая сопровождается зеленой флуоресценцией продуктов окисления в ультрафиолетовом свете. Эта реакция используется для подтверждения подлинности некоторых лекарственных препаратов, содержащих адамантильный радикал, в частности димантана и бемантана, которые в этих условиях дают вишневую окраску и желто-зеленую флуоресценцию в УФ-свете.
Ряд других производных адамантана идентифицируют по различным функциональным группам. Так, для подтверждения подлинности
21 ремантадина проводят реакцию с нитропруссидом натрия в присутствии раствора карбоната натрия и ацетона (реакция на аминогруппу), результатом которой становится фиолетовая окраска раствора [106, 107].
Мидантан определяют по реакции с раствором 2-нитроиндандиона-1,3, в результате которой образуется нерастворимая желтая і соль нитроиндандионата, а также при кипячении с раствором натра едкого, в процессе чего отщепляющийся аммиак окрашивает в синий цвет влажную лакмусовую бумагу [104, 109].
Кемантан предложено идентифицировать по кетогруппе: при взаимодействии с 2,4-динитрофенилгидразином в присутствии соляной кислоты образуется оранжевый осадок, который при добавлении раствора гидроксида натрия переходит в вишневый раствор [84].
Мемантин при взаимодействии с уксусным ангидридом и пиридином образует соль N-ацетилмемантина, которую определяют по температуре плавления (108-110С).
1.1.3.5. Хроматография в тонком слое сорбента
Сегодня ТСХ еще по-прежнему остается самым простым, надежным, эффективным и распространенным методом контроля примесей в лекарственных средствах. Преимуществом: ТСХ перед ВЭЖХ является то, что все вещества пробы находятся на хроматограмме. В ВЭЖХ и других колоночных вариантах хроматографии некоторые примеси могут не элюироваться и оставаться в условиях эксперимента на колонке, то есть не обнаруживаться. В связи с этим тест «хроматографическая чистота», полученный с помощью ТСХ, хотя и является полуколичественным, наряду с ВЭЖХ широко применяется для оценки чистоты и идентификации лекарственных средств [15, 16, 57, 87, 99, 100, 136, 148, 161].
В ТСХ-анализе в качестве адсорбентов для приготовления пластин используют: силикагель; силикагель, модифицированный алкильными и
22 другими группами; оксид магния; ионообменные смолы; полиамид, а также смеси этих и других сорбентов [3, 100].
По данным ряда авторов [112] наилучшее разделение органических веществ происходит в тонком слое силикагеля. Наиболее распространенными в фармацевтической практике являются пластины с закрепленным слоем на основе силикагеля. В России обычно используют следующие марки готовых пластин: «Silufol» (Чехия), «Сорбфил» (Россия), «Kieselgel» (Германия) -обычные и с флуоресцирующей при 254 и/или 365 нм подложкой [100].
Основной характеристикой растворителей, применяемых. в хроматографии в качестве подвижной фазы, является их элюирующая сила, которая обуславливается термодинамическими свойствами растворителей, а также характером и интенсивностью различных межмолекулярных взаимодействий растворителей и других компонентов системы [40]. Полярные соединения лучше разделяются в гидрофильных растворителях, в которых уменьшается их адсорбция вследствие возрастающей конкуренции подвижной фазы за поверхность сорбента. При выборе соответствующей системы растворителей учитывают также летучесть, вязкость, расслаиваемость, растворимость анализируемых веществ [18, 50].
Самой простой формой оценки элюирующей силы индивидуальных растворителей являются элюотропные ряды. Наиболее важный практически элюотропный ряд выглядит следующим образом: гексан (гептан) — бензол — хлороформ — этилацетат = ацетон — метанол — вода. Сильно ассоциированные жидкости (вода, ДМФА, ДМСО, диэтиламин), обладающие большой вязкостью, которая приводит к увеличению времени анализа, и большой элюирующей силой, применяются обычно только в виде небольших добавок к другим растворителям [100].
Для реализации разнотипных межмолекулярных связей и для получения селективных хроматографических систем предпочтительно использовать многокомпонентные системы растворителей [17, 51]. Бинарные подвижные фазы состоят обычно из разбавителя (например, гексана) и
23 активного (в элюирующем смысле) компонента. Наилучшая воспроизводимость величин Rf наблюдается при малых содержаниях активного компонента подвижной фазы. С этой точки зрения лучше всего бинарные смеси, содержащие предельные углеводороды, к примеру, гептан — этилацетат. Для разделения не очень сильно полярных соединений можно использовать бинарные смеси гексан — ацетон (или этилацетат), бензол — ацетон (или этилацетат), бензол — метанол с последующей оптимизацией их состава [100].
При анализе многокомпонентных препаратов наилучшим способом оптимизации является изменение селективности подвижной фазы при определенной элюирующей силе [51, 97, 101]. Снайдер предложил удобную эмпирическую схему классификации растворителей для хроматографии в соответствии с их полярностью и свойственными им специфическими химическими взаимодействиями. По значениям параметров селективности растворители делятся на восемь групп и графически изображаются в виде «треугольника селективности» [159].
При контроле специфических примесей обычно используют специфические проявители, при проверке хроматографической чистоты — неспецифические. К наиболее чувствительным и широко применяемым неспецифическим реактивам могут быть отнесены: УФ-свет с длиной волны 254 нм, пары йода, 1% спиртовой раствор хлорного железа с последующим подогревом, реактивы Драгендорфа, Вагнера, Ван-Урка, раствор калия бихромата, концентрированная серная кислота, раствор Р-нафтола и другие [61,101,116,138,142].
В анализе производных адамантана хроматография в тонком слое сорбента применяется для идентификации и определения примесей. Например, в субстанции ремантадина данным методом обнаруживают примеси, используя систему растворителей хлороформ - эфир (25:5). Пятна детектируют раствором нингидрина при нагревании: ремантадин проявляется на старте в виде фиолетового пятна [106,107].
Для хроматографического обнаружения примесей в мидантане применяют систему растворителей изопропиловый спирт — концентрированный раствор аммиака (14:4); детектирование проводят парами йода при нагревании [104, 109]. В работе Яшкина С.Н. [120] описаны методики разделения мидантана и его промежуточных продуктов синтеза (1-адамантанола, 1-нитроадамантана и 1-адамантилмочевины) методом ТСХ в указанной выше системе растворителей.
В анализе гимантана метод ТСХ предложен для определения подлинности действующего вещества в таблетках и для обнаружения примесей в субстанции и в таблетках. В качестве подвижной фазы следует использовать смесь растворителей 1,4-диоксан — метанол — концентрированный раствор аммиака (4:40:1); детектировать парами йода, а затем примесь адамантан-2-она определять раствором 2,4-динитрофенилгидразина [113].
Тонкослойную хроматографию кемантана предлагается проводить в системе растворителей гексан - диоксан (5:2). Примеси адамантан-2,6-диона и адамантан-2-она обнаруживают раствором 2,4-динитрофенилгидразина в спирте и соляной кислоте [85].
Действующие вещества таблеток «бромитил» (бромантан и бемитил) предложили идентифицировать с одновременным определением примесей методом ТСХ в системе растворителей хлороформ — ацетон — диэтиламин (20:2:0,2); детектирование проводят УФ-светом [64].
1.1.3.6. Газожидкостная хроматография
В настоящее время газовая хроматография во многом вытеснена ВЭЖХ, обладающей более универсальным характером, и применяется обычно только для контроля легколетучих органических веществ, которые по каким-либо причинам не могут быть проанализированы с помощью ВЭЖХ. Сегодня основным применением газовой хроматографии в контроле качества
25 лекарственных средств является определение содержания остаточных растворителей, где газовая хроматография находится вне конкуренции [100, 163].
Остаточные органические растворители — это растворители, которые используются на стадиях производства лекарственного средства и полностью не удаляются после завершения технологического процесса. Предельно допустимое содержание органических растворителей в лекарственных средствах зависит от степени их возможного риска для здоровья человека и окружающей среды.
По степени токсического воздействия на человека и окружающую среду органические растворители подразделяются на три класса: высокотоксичные (генотоксичные канцерогены), негенотоксичные и растворители низкой токсичности. К растворителям низкой токсичности относят ацетон, изопропиловый спирт, этанол и другие, их содержание до 0,5% не требует подтверждения. Для определения растворителей третьего класса допускается использование неспецифического метода, такого как «потеря в массе при высушивании». Если содержание растворителей этого класса в лекарственном средстве превышает 0,5%, то растворитель должен быть идентифицирован и определен количественно [133,141, 164].
В газовой хроматографии обычно используют сорбенты с нанесенной на них неподвижной жидкой фазой. Самым распространенным и устойчивым детектором является детектор по ионизации пламени [100]. Типовая методика определения остаточных органических растворителей в лекарственных средствах представлена в методических указаниях [73].
Газожидкостную хроматографию в анализе производных адамантана используют достаточно широко, в том числе для определения остаточных органических растворителей. Таким образом определяют изопропиловый спирт в субстанции ремантадина. Разделение проводят на газовом: хроматографе с пламенно-ионизационным детектором на колонке из нержавеющей стали 2 м х 3 мм, заполненной хроматоном N-AW-DMCS с
26 диаметром частиц 0,125 — 0,160 мм, с неподвижной жидкой фазой 5% ПЭГ-600, газ-носитель - азот со скоростью потока 30 мл/мин, температура испарителя - 170С, температура термостата колонки 60С. Содержание изопропанола определяют методом внутреннего стандарта, в качестве которого используют раствор н-бутанола в воде [110].
1.1.3.7. Высокоэффективная жидкостная хроматография
Высокоэффективная жидкостная хроматография в настоящее время является основным методом количественного определения в американской фармакопее, широко, применяется в британской, немецкой и других фармакопеях. Общие статьи по ВЭЖХ имеются во всех ведущих фармакопеях, в том числе в ГФ XI. Преимуществом ВЭЖХ является ее универсальность и объективность результатов, недостатком — необходимость использования стандартных образцов веществ-свидетелей [100].
ВЭЖХ применяется для идентификации, контроля примесей, количественного определения лекарственных средств [44, 83, 119, 126-128, 137, 158, 162]. Вариант распределительной хроматографии, в котором используют сорбент с привитыми неполярными группами, обычно силикагель, на поверхности которого привиты нормальные углеводородные цепочки с 8, 16 и 18 углеродными атомами, и полярный растворитель, например водный метанол, получил название обращенно-фазной ВЭЖХ. В настоящее время он является основным в ВЭЖХ [38, 96].
При анализе лекарственных средств методом ВЭЖХ применяются только готовые к употреблению и аттестованные производителем колонки. Широкое распространение колонок с сорбентом на основе силикагеля обусловлено тем, что при использовании данного сорбента, меняя элюенты, можно добиться кардинального изменения элюирования. Сорбент быстро приходит в равновесие с новыми растворителями, что позволяет переходить от одной методики к другой с использованием одной и той же колонки.
27 Кроме того, силикагель обладает большой устойчивостью к высокому давлению. Но ни один сорбент, как бы хорош он ни был по химии поверхности, технологии получения, не может быть использован для воспроизведения или решения любых методик и задач [96, 100, 149].
При подборе систем растворителей принимают во внимание как растворимость компонентов смеси, так и элюотропные ряды растворителей. В обращенно-фазной ВЭЖХ с увеличением полярности растворителя его элюирующая сила снижается. Поэтому элюенты для обращенно-фазной ВЭЖХ располагаются в элюотропный ряд в соответствии с увеличением элюирующей силы следующим образом: вода — метанол — ацетонитрил — 2— пропанол — тетрагидрофуран - хлороформ. Последние три: растворителя используются очень редко. Чем больше органического растворителя в элюенте типа вода — органический растворитель, тем больше элюирующая сила элюента, тем меньше удерживаемый объем вещества [96, 98].
В жидкостной хроматографии влияние подвижной фазы, на селективность чрезвычайно велико. Изменением состава подвижной фазы очень часто легко добиться той же селективности, что и за счет применения нового дорогостоящего привито-фазного сорбента. Часто незначительное изменение состава подвижной фазы дает возможность оптимизировать процесс, улучшить форму пиков, разрешение отдельных компонентов и даже изменить механизм разделения.
В практической работе индивидуальные растворители применяются < редко, так как использование смесей растворителей резко расширяет возможности жидкостной хроматографии [96, 134]. Как правило, используют смеси вода - ацетонитрил или (реже) вода — - метанол и вода: -тетрагидрофуран, с модифицирующими добавками (или без них) буферных; или ион-парных реагентов (соли фосфорной, серной или уксусной кислот, перхлорат лития, соли алкилсульфоновых кислот и алкиламмония и др.), при этом рН подвижной фазы находится в пределах 2 — 8 [100, 115].
В России распространены отечественные хроматографы марки «Милихром», которые, однако, ненадежны в работе. Самым распространенным детектором является спектрофотометрический.
ВЭЖХ для производных адамантана в ряде случаев имеет ограниченное применение из-за невозможности использования УФ-детектора и необходимости взаимодействия с реагентами, позволяющими детектировать производные адамантана.
В частности, такие реагенты используются при количественном определения мемантина гидрохлорида в таблетках методом ВЭЖХ (Merz+Co. GmbH & Co.). Определение производится на ВЭЖХ-хроматографе 600 Е с аутосемплером WISP 712, Waters с помощью метода внутреннего стандарта, в качестве которого применяется амантадина гидрохлорид. Разделение проводят на колонке с обращенной фазой LiChrospher 60RP-select В с диаметром частиц 5 мкм, элюентом является смесь растворителей: фосфатный буферный раствор (рН 2,5) - метанол (45:55). На выходе из колонки разделенные фракции аминов (амантадина, мемантина) обрабатывают раствором тетрабората натрия, о-фталевого альдегида и 3-меркаптопропионовой кислоты в воде. В результате взаимодействия образуется флюоресцирующий комплекс. Детектируют с применением флюориметрического детектора, длина волны максимума флюоресценции образующегося флюорофора ХЕт = 450 нм при возбуждении лучами с длиной волны Хех = 340 нм [35].
В другом источнике [135] описано разделение 1-аминокислот и амантадина (мидантана) методом ВЭЖХ с градиентным элюированием на колонке MicroSpher 3 С18 ChromSep 50 х 4,6 mm с обращенной фазой. В качестве подвижной фазы при градиентном элюировании используют ацетонитрил, метанол, ацетатно-аммиачный буфер. Перед введением пробы в хроматограф образцы 1-аминокислот и 1-аминоадамантана обрабатывают FLEC-реактивом (раствор 9(Г-хлорформиат)этилфлуорена в ацетоне).
29 1.1.3.8. Титриметрические методы анализа
Титриметрия является главным прямым методом анализа при контроле качества лекарственных средств.. Наиболее важный ее раздел — неводное титрование, которое, в частности, широко используется для количественного анализа препаратов, содержащих аминогруппу. В качестве растворителя для указанных соединений чаще всего применяют безводную уксусную кислоту. Условия титрования значительно улучшаются при добавлении уксусного ангидрида, увеличивающего кислотность и диэлектрическую проницаемость среды и связывающего примеси воды. К этим так называемым ионизирующим растворителям часто добавляют апротонные растворители, такие как бензол, диоксан, гексан и др., с целью подавления сольватации продукта нейтрализации, что способствует более четкому установлению конца титрования.
Для анализа лекарственных форм (в том числе таблеток) кислотно-основное титрование в неводных средах используется мало, так как многие наполнители таблеток реагируют с титрантом — хлорной кислотой, искажая результаты определения, а многократное извлечение действующего вещества органическими растворителями приводит к. значительному снижению точности определения [21, 34, 63, 82, 100].
Количественное определение производных адамантана проводят обычно титриметрическим методом, чаще всего методом неводного титрования. Производные адамантана, содержащие в своей структуре аминогруппу, обладают слабыми основными свойствами, поэтому их растворяют в кислых растворителях, таких как ледяная уксусная кислота и муравьиная кислота.
Так, ремантадин титруют в среде муравьиной кислоты и уксусного ангидрида, используя в качестве титранта 0,1 М хлорную кислоту, индикатор - кристаллический фиолетовый. Данным способом проводят количественное определение субстанции и таблеток ремантадина. Точно так же предложено определять количественно мидантан и гимантан в таблетках и субстанциях. Кроме того, для субстанций ремантадина, мидантана и мемантина можно применять потенциометрическое титрование в ледяной уксусной кислоте с ацетатом окисной ртути [104, 106, 107, 109, ИЗ, 124, 163].
При анализе капсул и сиропа амантадина гидрохлорида действующее вещество перед титрованием экстрагируют гексаном из водного раствора, подщелоченного гидроксидом натрия. Затем добавляют ледяную уксусную кислоту и титруют потенциометрически хлорной кислотой. Амантадина сульфат для инфузий предварительно переводят в основание, экстрагируют хлороформом и титруют в среде уксусного ангидрида и ледяной уксусной кислоты, индикатором является кристаллический фиолетовый [122,123].
Кемантан количественно можно определить по реакции с гидроксиламина гидрохлоридом в присутствии дифенилгуанидина. Последний используют для связывания хлористоводородной кислоты гидроксиламина. Количество кемантана определяют, оттитровывая не вступивший в реакцию гидроксиламин спиртовым раствором хлорной кислоты с индикатором бромфеноловым синим [7, 85].
1.2. Производные сиднонимина. Сиднокарб
1.2.1. Фармакологические и физико-химические свойства сиднокарба и других производных сиднонимина
Сиднокарб — оригинальный отечественный стимулятор ЦНС. Сегодня это основной психостимулятор, используемый в нашей медицинской практике. Его применяют при лечении астенических и неврастенических расстройств, сопровождающихся вялостью, заторможенностью, апатией, сонливостью, пониженной работоспособностью, и при астении, обусловленной применением нейролептических средств. Сиднокарб повышает психическую активность, ясность сознания, яркость восприятия,
31 психическую работоспособность, препятствует сонливости и засыпанию. В связи с этим у здоровых людей применение сиднокарба возможно при необходимости выполнить какую-нибудь работу в сжатые сроки для устранения чувства утомления и сонливости, хотя после этого необходим достаточный отдых, так как ощущение утомления устраняется за счет использования энергетических резервов. Выпускается препарат в виде таблеток по 0,005; 0,01 и 0,025г [2, 5, 58, 118, 129].
Сиднокарб по классификации является производным сиднона или сиднонимина, которые представляют собой биполярные пятичленные гетероциклические соединения с общими формулами [94, 121]: R1\ 3 N ^5 С: R2
3 q 4 N^ \5 ± С: N^ / сидноны сиднонимины
Производные указанных соединений обладают различным фармакологическим действием: антибактериальным, противогрибковым, иммуностимулирующим, противоопухолевым, противовоспалительным, анальгетическим, жаропонижающим [143, 145, 153, 155, 157]. Лекарственные препараты — производные сиднонимина, разрешенные для медицинского применения в России, представлены в таблице 2.
Сиднокарб впервые был синтезирован во ВНИХФИ [5]. Схема его синтеза приведена ниже. Синтез сиднокарба осуществляют, исходя из Р-фенилизопропиламина (I). При взаимодействии I с формалином и ацетонциангидрином в присутствии поташа получают р-фенилизопропиламиноацетонитрил, который выделяют в виде гидрохлорида
Таблица 2 Лекарственные препараты — производные сиднонимина
33 Схема синтеза сиднокарба:
СН3 сн2—сн-I і.сн2о, (CH3)2COHCN 2. НС1
СН3 -СН2—СН N СН2 н неї CN NaNO,
СНо—СН N- NO CN -СН2-III C6H5NCO
СН, СН N СН "'s N С NH- сиднокарб (II). С помощью нитрита натрия и спиртового раствора хлористого водорода II циклизуют до 3-(|3-фенилизопропил)сиднонимина гидрохлорида (сиднофен - III). Сиднофен ацилируют с помощью фенилизоцианата в изопропаноле в присутствии ацетата натрия и получают сиднокарб.
Брутто-формула сиднокарба: СівНі^Ог, молекулярная масса: 322,37. Сиднокарб легко растворим в хлороформе, диоксане и ацетоне, умеренно растворим в 95% спирте, практически нерастворим в воде. Ультрафиолетовый спектр 0,001% раствора препарата в 95% спирте в области от 220 до 350 нм имеет максимумы поглощения при 255±2 нм и 340±2 нм. Субстанция сиднокарба плавится в интервале температур 132 — 138С с разложением.
34 -г 1.2.2. Методы анализа сиднокарба
Методы анализа и нормы качества сиднокарба описаны в ФС 42-1623-99. Идентифицируют сиднокарб по УФ-спектру, а также по результатам двух химических реакций: 1) порошок нагревают до кипения с 30% раствором едкого натра, в выделяющихся парах аммиака влажная лакмусовая бумага синеет; 2) порошок растворяют при нагревании в 95% спирте и нагревают с 30% раствором едкого натра до кипения. После охлаждения три капли верхнего слоя отбирают в пробирку, прибавляют концентрированную соляную кислоту до появления белого осадка, затем три капли реактива Грисса и нагревают; появляется ярко-малиновое окрашивание (реакция на нитриты после разложения сиднокарба).
Для обнаружения посторонних примесей анализируемый образец сиднокарба хроматографируют в тонком слое сорбента в системе растворителей хлороформ — ацетон (6:1); детектируют зоны адсорбции сиднокарба и его возможных примесей в ультрафиолетовом свете.
Количественно сиднокарб определяют методом неводного титрования, растворяя препарат в уксусном ангидриде; титрантом является хлорная кислота, индикатором — кристаллический фиолетовый. Количественное определение таблеток осуществляют спектрофотометрическим методом; сиднокарб извлекают из лекарственной формы 95% спиртом при нагревании, в качестве стандарта используют спиртовой раствор РСО сиднокарба, раствор сравнения - этанол 95% [105, 108].
В работе Дерибезовой О.В. [36] предлагается идентифицировать сиднокарб в субстанции, таблетках и извлечении из биологического материала по реакции образования азокрасителя из диазотированного продукта кислотного гидролиза сиднокарба с использованием в качестве азокомпонентов производных роданина: З-Р-карбоксиэтилроданина, 3-а,|3-дикарбоксиэтилроданина и З-а/у-дикарбоксипропилроданина. В той же работе предложено обнаруживать сиднокарб с помощью цветных реакций,
35 основанных на взаимодействии продукта его кислотного гидролиза с различными реагентами: фосфорномолибденовой кислотой, бихроматом калия, хлорной известью, п-диметиламинобензальдегидом, сульфаниловой кислотой.
Идентифицировать и определить количественно сиднокарб в субстанции, таблетках и вытяжках из биологического материала можно с помощью метода ВЭЖХ. Условия определения разработаны для отечественного хроматографа «Милихром-4». Анализ проводится на колонках КАХ-4, заполненных обращенно-фазным сорбентом Сепарон С is, элюирование осуществляют смесью ацетонитрила и фосфатного буфера с рН 7,0 (1:1). Скорость потока элюента — 100 мкл/мин, обнаружение сиднокарба проводится с помощью УФ-детектора при длине волны 272 нм [36].
Кроме того, количественное определение сиднокарба можно проводить фотометрическим методом, основанным на реакции получения азокрасителя с 3-а,у-дикарбоксипропилроданином. Оптическая плотность измеряется на фотоэлектроколориметре при светофильтре с Адфф = 490±10 нм или спектрофотометре при длине волны 495 нм [36].
Таким образом, при разработке методик анализа субстанции ладастена можно опираться на имеющиеся литературные данные по анализу других лекарственных препаратов — производных адамантана, для которых применяются в основном следующие аналитические методы: спектральные (ИК- и УФ-спектрофотометрия, ЯМР-спектроскопия), хроматографические (ТСХ, ВЭЖХ на обращенно-фазных колонках, ГЖХ), титриметрические (преимущественно неводное титрование) и химические реакции идентификации (как на адамантановый фрагмент, так и на функциональные заместители).
Способы анализа сиднокарба, представленные в литературном обзоре, могут служить наряду с разрабатываемыми нами методиками аналитического контроля ладастена основой при разработке методик анализа действующих веществ в препарате «локсидан», содержащем ладастен и сиднокарб.
class1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Свойства и методы анализа
производных адамантана и сиднонимина class1
link1 Производные адамантана. Ладастен title1
Работа по синтезу и изучению фармакологических свойств производных адамантана проводится в НИИ Фармакологии РАМН с 1966 года. Здесь были синтезированы и фармакологически исследованы производные адамантана, замещенные по мостиковому положению углерода, и проведен скрининг адамантансодержащих соединений с целью отбора веществ с низкой токсичностью и селективным действием на иммунную и нервную системы организма. В ходе исследований установлено, что введение в качестве заместителя у азота 2-аминоадамантана ароматического кольца при минимальном расстоянии между ними повышает стимулирующие свойства вещества. Поэтому был синтезирован и фармакологически изучен ряд ароматических производных 2-аминоадамантана, родоначальником которых стал №(2-адамантил)анилин. Это соединение проявило, однако, высокую токсичность. Последующее введение галогена в п-положение ароматического ядра: Ы-(2-адамантил)анилина увеличило его фармакологическую активность, а именно стимулирующее действие на физическую работоспособность [1, 68, 91].
Так фундаментальные исследования привели к созданию нового лекарственного средства из группы производных адамантана, обладающего психостимулирующими, анксиолитическими и иммуностимулирующими свойствами - бромантана [1, 6, 27, 68, 78, 81, 91, 92]. Дальнейшее изучение показало, что бромантан как крупнокристаллическое и малорастворимое вещество имеет недостаточную биодоступность. С целью ее повышения была изменена технология получения препарата. Мелкокристаллическая субстанция, которую получают по новой технологии, обеспечивает достоверное повышение физической работоспособности, в то время как эффект крупнокристаллического вещества, приготовленного прежним способом, проявляется лишь в тенденции повышения работоспособности [76]. Впоследствии были проведены дополнительные фармакологические исследования, расширены показания к применению, и препарат получил название «ладастен».
Обладая психостимулирующими, транквилизирующими,
иммуностимулирующими свойствами и положительным влиянием на когнитивные функции, ладастен может применяться для лечения астенических состояний и в случае необходимости повышения операторской и физической работоспособности, особенно в экстремальных условиях. При этом он не имеет недостатков известных психостимуляторов фенилалкиламиновой структуры и их аналогов [1, 6, 27, 56, 68, 69, 76, 78, 81, 91,92,103].
Ладастен, сочетая в себе нейро- и иммунотропную активность, относится к классу нейроиммуномодуляторов. Его психостимулирующее действие значительно более слабое, чем у фенамина и сиднокарба. Но он, в отличие от последних, существенно повышает физическую работоспособность в обычных и осложненных условиях. Кроме того, ладастену свойственна иммунокорректорная активность при вторичных иммунодефицитах.
Объекты и методы исследований
Технология получения таблеток разработана в лаборатории готовых лекарственных форм опытно-технологического отдела НИИ Фармакологии (заведующий лабораторией — доктор фармацевтических наук К.В. Алексеев). Таблетки получены методом прямого прессования. Для проведения исследований с целью составления проекта ФСП в лаборатории ГЛФ были изготовлены пять серий локсидана: 11202, 21202, 31202, 41202 и 51202.
Изучение физико-химических свойств ладастена, разработку методик анализа субстанции ладастена и таблеток локсидана, установление их срока годности и норм качества проводили в аналитической группе опытно-технологического отдела института Фармакологии (руководитель аналитической группы — ведущий научный сотрудник, кандидат фармацевтических наук О.Б. Степаненко).
В наших исследованиях применялись различные методы анализа.
Метод спектрофотометрии в УФ-области был использован для изучения физико-химических свойств ладастена и разработки методики его идентификации, а также для разработки методик идентификации, количественного определения, теста «растворение» и определения однородности дозирования таблеток локсидана. Количественный спектрофотометрический анализ локсидана проводили на спектрофотометре СФ-46 (Россия), УФ-спектры ладастена сняты на спектрофотометре Specord UV VIS (Германия).
Спектроскопия в ИК-области была использована нами для изучения физико-химических свойств ладастена и разработки методики определения его подлинности. Инфракрасные спектры ладастена сняты на двухлучевом ИК-спектрометре Perkin-Elmer 580 (Швеция).
ПМР-спектроскопию мы применили для изучения физико-химических свойств ладастена и разработки методики его идентификации. Спектр ПМР ладастена был снят на ПМР-спектрометре Вгаскег АС-250 (Германия) с использованием стандартного Брукеровского пакета микропрограмм. Все спектры (ИК, УФ, ПМР) сняты в группе физико-химических методов исследования (руководитель группы — кандидат химических наук В.Г. Винокуров). Выражаем благодарность В.П. Лезиной, В.Г. Винокурову, B.C. Троицкой за снятие спектров.
Физико-химические свойства ладастена
Нами были изучены УФ-спектры ладастена. Так как ладастен практически нерастворим в воде, были сняты его спектры в хлороформе, этаноле, водных растворах хлористоводородной кислоты и смеси водных растворов хлористоводородной кислоты и этанола.
В растворах, не содержащих хлористоводородную кислоту, УФ-спектр ладастена имеет максимум поглощения около 260 нм и широкую полосу слабой интенсивности с максимумом около 312 нм (см. рис. 3 и табл. 8). Было выяснено, что величина оптической плотности 0,001% хлороформных растворов ладастена в максимуме поглощения 260 нм плохо воспроизводится от опыта к опыту. При использовании в качестве растворителя этанола 95% получали хорошо воспроизводимые значения оптической плотности растворов, кроме того, интенсивность поглощения ладастена при 260 нм в этаноле значительно выше, чем в хлороформе (см. табл. 8).
Нами определено, что в водных растворах хлористоводородной кислоты ладастен не поглощает электромагнитное излучение при длине волны 260 нм, зато имеет максимум поглощения при 223 нм, что объясняется его переходом в солевую форму.
class3 РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ АНАЛИЗА И УСТАНОВЛЕНИЕ
НОРМ КАЧЕСТВА ТАБЛЕТОК «ЛОКСИДАН» class3
Разработка методик определения подлинности и обнаружения примесей в таблетках локсидана с помощью метода ТСХ
Для определения подлинности ладастена и сиднокарба в локсидане и одновременного обнаружения посторонних примесей нами предложен метод тонкослойной хроматографии с идентификацией по свидетелям.
Так как ладастен и сиднокарб легко растворимы в ацетоне, то для экстрагирования действующих веществ из растертой таблеточной массы и нанесения проб на хроматографическую пластинку был выбран указанный растворитель.
Для обнаружения зон адсорбции ладастена, сиднокарба и их возможных примесей мы использовали УФ-свет с длиной волны 254 нм. Данным способом можно определить до 0,05 мкг ладастена и 0,03 мкг сиднокарба, что говорит о высокой чувствительности этого способа обнаружения.
Мы изучили хроматографическое поведение сиднокарба и ладастена в тонком слое сорбента в системах растворителей, используемых в анализе полупродуктов синтеза ладастена (гексан — диоксан 5:1, гексан — диоксан 3:1, гексан — диоксан 1:1, гексан — диоксан — диэтиламин 9:3:1, гексан — ацетон 15:1, гексан - ацетон 6:1, толуол), а также в анализе сиднокарба (хлороформ - ацетон 6:1). В толуоле и в системах растворителей с большим содержанием гексана сиднокарб остается на старте или перемещается немного выше линии старта. Это связано с тем, что сиднокарб практически нерастворим в гексане и толуоле. В системе хлороформ - ацетон (6:1) Rf сиднокарба составил 0,32, aRf ладастена-0,70; в системе гексан - диоксан (1:1) Rf сиднокарба —0,35, а Rf ладастена - 0,74. Как видно, обе эти системы подходят для анализа смеси сиднокарба и ладастена и являются практически равнозначными. Для хроматографирования локсидана мы выбрали систему растворителей хлороформ — ацетон (6:1), так как в системе гексан — диоксан (1:1) Rf ладастена превышает значение 0,7, что не является желательным в тонкослойной хроматографии. При анализе смеси из 100 мкг сиднокарба и 100 мкг ладастена в выбранной системе растворителей коэффициент г составил 4,1, то есть можно говорить о полном разделении веществ на хроматограмме.
Для проверки пригодности хроматографической системы предлагаем следующий тест: значение Rs пятна сиднокарба относительно пятна ладастена на хроматограмме растворов РСО ладастена и сиднокарба должно быть равным 0,46 ± 0,03.
Полностью методика ТСХ-анализа приведена в проекте ФСП на локсидан (см. приложение 3). Типичная хроматограмма локсидана в ультрафиолетовом свете представлена на рис. 7.
Разработанную методику хроматографического анализа мы использовали для обнаружения примесей в локсидане (серии 11202 — 51202). С целью полуколичественной оценки содержания примесей наносили на пластинку шкалу рабочего стандартного образца сиднокарба в количествах 0,05, 0,1; 0,2 и 0,3 мкг. При хроматографировании таблеток в пробе, содержащей 100 мкг ладастена и 100 мкг сиднокарба, примеси не обнаруживались, поэтому мы сделали вывод об отсутствии примесей во всех анализируемых сериях или об их содержании в количестве менее 0,05%.
