Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Лекарственные растения, используемые для профилактики и лечения воспалительных заболеваний 11
1.2. Ботанические сведения об ортилии однобокой 20
1.2.1. Систематическое положение ортилии однобокой 20
1.2.2. Ареал ортилии однобокой 21
1.2.3. Экология ортилии однобокой 25
1.3. Применение ортилии однобокой в народной медицине 28
1.4. Фармакологическая активность извлечений из ортилии однобокой. 29
Глава 2. Материалы и методы исследования 32
Глава 3. Ботанико-фармакогностическая характеристика надземной части ортилии однобокой 37
3.1. Эколого-биологические особенности ортилии однобокой 37
3.1.1. Эколого-фитоценотическая характеристика ортилии однобокой в растительных сообществах Западного Забайкалья 37
3.1.2. Биологические особенности ортилии однобокой 42
3.1.3. Продуктивность ортилии однобокой и запасы ее сырья в природных популяциях Западного Забайкалья 59
3.2. Анатомическое строение и анатомо-диагностические признаки ортилии однобокой 69
3.2.1. Анатомическое строение и анатомо-диагностические признаки вегетативного побега ортилии однобокой. 69
3.2.2. Анатомическое строение генеративного побега ортилии однобокой 75
3.3. Товароведческий анализ сырья 80
Выводы к главе 3 81
Глава 4. Фотохимическое исследование надземной части ортилии однобокой 83
4.1. Исследование качественного состава 83
4.2. Количественное определение биологически активных веществ 98
4.3. Элементный состав ортилии однобокой 102
Выводы к главе 4 104
Глава 5. Количественное определение основных действующих веществ в надземной части ортилии однобокой 105
5.1. Разработка методики количественного определения суммарного содержания флавоноидов в надземной части ортилии однобокой 105
5.2. Методика количественного определения суммарного содержания флавоноидов в пересчете на ГСО рутина в надземной части ортилии однобокой 111
5.3. Изучение динамики накопления флавоноидов ортилии однобокой 114
5.3.1. Суммарное содержание флавоноидов и экстрактивных веществ в органах ортилии однобокой и динамика их накопления в течение вегетационного периода. 114
5.3.2. Динамика накопления флавоноидов в онтогенезе ортилии однобокой 117
5.3.3. Суммарное содержание флавоноидов в надземной части ортилии однобокой в зависимости от эколого фитоценотических условий 119
Выводы к главе 5 122
Глава 6. Разработка способа получения средства, обладающего противовоспалительной активностью и его стандартизация 124
6.1. Разработка способа получения сухого экстракта. 124
6.2. Разработка технологической схемы получения сухого экстракта из надземной части ортилии однобокой. 128
6.3. Изучение химического состава сухого экстракта ортилии однобокой 133
6.3.1. Качественный состав сухого экстракта ортилии однобокой 133
6.3.2. Определение некоторых биологически активных веществ методом ВЭЖХ. 140
6.3.2.1. Качественное и количественное определение фенолкарбоновых кислот методом высокоэффективной жидкостной хроматографии 140
6.3.2.2. Качественное и количественное определение флавоноидов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии 143
6.3.2.3. Определение содержания арбутина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии 145
6.4. Стандартизация сухого экстракта ортилии однобокой 147
6.5. Определение количественного содержания биологически активных веществ в сухом экстракте ортилии однобокой. 150
6.6. Разработка показателей качества и установление срока годности сухого экстракта . 151
Выводы к главе 6 153
Общие выводы 156
Список использованной литературы 160
- Лекарственные растения, используемые для профилактики и лечения воспалительных заболеваний
- Продуктивность ортилии однобокой и запасы ее сырья в природных популяциях Западного Забайкалья
- Количественное определение биологически активных веществ
- Разработка показателей качества и установление срока годности сухого экстракта
Введение к работе
Актуальность темы. Использование растений с лечебной целью известно с глубокой древности и, несмотря на прогресс в области синтеза лекарственных препаратов, растительные лекарственные средства продолжают занимать значительное место в современной медицине. Возрастающая популярность и эффективность препаратов растительного происхождения во многом объясняется тем, что содержащиеся в них биологически активные вещества воздействуют на организм комплексно, легко включаются в обменные процессы и практически не проявляют побочных эффектов при длительном применении.
Известно, что практически все синтетические препараты, используемые при лечении заболеваний, в основе которых лежит воспалительная реакция, оказывают побочное действие и имеют противопоказания к применению [Бо-дяжина, 1990; Машковский, 1994]. В связи с этим поиск новых источников биологически активных веществ природного происхождения, обладающих высокой противовоспалительной активностью, является актуальной задачей медицинской и фармацевтической науки.
Одной из отправных точек такого поиска является использование опыта народной медицины, который содержит огромный фактический материал, являющийся надежным ориентиром для выбора новых перспективных видов лекарственного сырья. В качестве объекта исследования нами была выбрана ор-тилия однобокая - Orthilia secunda (L.) House (сем. Pyrolaceae - грушанковые), которая издавна использовалась в Сибири в качестве противовоспалительного, ранозаживляюшего, гемостатического, диуретического средства, широко применялась при лечении гинекологических заболеваний [Телятьєв, 1985]. В результате исследований, проведенных в Отделе биологически активных веществ Института общей и экспериментальной биологии СО РАН, установлено выраженное противовоспалительное и антиокислительное действие извлечений из данного растения [Ботоева, 2001; Николаев и др., 2002].
Выраженная фармакотерапевтическая эффективность, подтверждающая целесообразность применения ортилии однобокой в народной медицине, является предпосылкой для проведения фармакогностического исследования данного растения, которое предусматривает макро- и микроскопический анализ растения, выявление анатомо-диагностических признаков, изучение качественного и количественного содержания биологически активных веществ, стандартизацию сырья. Кроме того, неотъемлемой частью этих исследований является выявление ресурсной базы. Для разработки научных основ и определения путей рационального использования ресурсов этого перспективного лекарственного растения необходимо изучение его эколого-биологических особенностей (установление эколого-фитоценотической приуроченности, жизненной формы, способов размножения, выявление особенностей развития, условий достижения оптимального состояния и т.д.).
Наиболее перспективным направлением в области создания фитопрепаратов является производство сухих экстрактов, представляющих собой легко-
растворимый в воде или в водно-спиртовь
оммян удобный для дозирования
РОС НАЦИОНАЛЬНА .
БИБЛИОТЕКА I
С О»
комплекс биологически активных веществ со стабильными показателями качества.
В связи с вышеизложенным целью настоящих исследований стало бота-нико-фармакогностическое исследование ортилии однобокой, стандартизация сырья, разработка способа получения и стандартизация противовоспалительного средства, представляющего собой сухой экстракт.
Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:
- в рамках изучения ресурсной обеспеченности выявить эколого-
фитоценотическую приуроченность ортилии однобокой, изучить биологиче
ские особенности, выявить влияние эколого-фитоценотических факторов на
морфометрические параметры растения и продуктивность природных ценопо
пуляции;
выявить анатомо-диагностические признаки надземной части ортилии однобокой;
определить качественный состав и количественное содержание биологически активных веществ в надземной части и сухом экстракте ортилии однобокой;
установить локализацию биологически активных веществ в отдельных органах растения, изучить динамику их накопления по фенофазам, в онтогенезе растения, в зависимости от эколого-фитоценотических факторов и определить оптимальные условия сбора;
разработать способ получения средства, обладающего противовоспалительной и антиокислительной активностью;
разработать нормативную документацию на лекарственное сырье и сухой экстракт.
Научная новизна работы. Изучены эколого-биологические особенности ортилии однобокой в условиях Западного Забайкалья: получены данные по особенностям онтогенеза, на основании комплекса признаков установлены оп-тимумы организма и ценопопуляции вида. Определены показателя сырьевой продуктивности и запасы сырья данного вида. Установлены анатомо-диагностические признаки ортилии однобокой.
Установлено наличие в надземной части и сухом экстракте флавоноидов в виде флавоноловых агликонов (кверцетин и кемпферол) и их гликозидов, фе-нольных кислот (галловой, хлорогеновой и др.), гидролизуемых и конденсированных дубильных веществ, простых фенолов и их гликозидов, углеводов, аминокислот, органических кислот, тритерпеновых сапонинов, иридоидов, производных кумарина; кроме того, качественно и количественно определены 26 макро- и микроэлементов. Определено количественное содержание в надземной части и сухом экстракте дубильных веществ, аскорбиновой кислоты, органических кислот - яблочной, янтарной и лимонной, простых фенолов и их гликозидов.
Разработана спектрофотометрическая методика определения суммарного содержания флавоноидов в пересчете на рутин в надземной части ортилии однобокой и сухом экстракте, использованием которой изучена динамика нако-
пления этих веществ по фенофазам, в онтогенезе растения, в зависимости от эколого-фитоценотических факторов.
Разработан способ получения средства, обладающего противовоспалительной и антиокислительной активностью, установлены оптимальные параметры экстрагирования сырья и определены показатели качества средства.
Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований разработан способ получения средства, обладающего противовоспалительной и антиокислительной активностью (патент № 20021156666/14(06475), положительное решение о выдаче патента на изобретение от 25.11.2002 г.). Составлены проекты Фармакопейных Статей предприятия на сырье - надземную часть ортилии однобокой и на сухой экстракт из нее. Разработан лабораторный регламент на производство сухого экстракта.
Доклиническое изучение сухого экстракта ортилии однобокой, проведенное в лаборатории экспериментальной фармакологии Института общей и экспериментальной биологии СО РАН, показало, что данное средство не токсично и обладает выраженной противовоспалительной, антиоксидантной, мембрано-стабилизирующей, жаропонижающей, седативной, обезболивающей, антимикробной, спазмолитической, диуретической и гонадотропной активностью. Полученные данные обусловливают перспективность клинического исследования сухого экстракта ортилии однобокой в целях использования при терапии гинекологических заболеваний.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на: II Всероссийской научной конференции "Агроэкология и устойчивое развитие регионов" (Красноярск, 2000), Международной научной конференции «Флора, растительность и растительные ресурсы Забайкалья» (Чита, 2000), V11I и XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2001, 2002), II Международном Тихоокеанском конгрессе «Традиционная медицина: научные и практические аспекты» (Владивосток, 2001), Всероссийской научной конференции «Биологически активные добавки и здоровое питание» (Улан-Удэ, 2001), научно-практической конференции «Биологически активные добавки и перспективы их применения в здравоохранении» (Улан-Удэ, 2001), Южно-Сибирской международной конференции «Экология Южной Сибири» (Абакан, 2001), научно-практических конференциях профессорско-преподавательского состава и аспирантов ИрГСХА (2003,2004,2005).
Связь задач исследования с проблемным планом научного совета по фармакологии и фармации. Настоящая работа выполнена в Отделе биологически активных веществ в соответствии с программой и планом научно-исследовательских работ Института общей и экспериментальной биологии СО РАН по теме "Создание информационного банка данных по тибетской медицине и разработка новых лекарственных препаратов" (№ гос. регистрации 01.9.40003183).
На зашиту выносятся:
результаты фармакогностического и фитохимического исследования ортилии однобокой;
разработанный способ получения средства, обладающего противовоспали-
тельной и антиокислительной активностью;
предлагаемые методы стандартизации сырья и сухого экстракта;
обоснование возможности и перспективности использования ресурсов ор-тилии однобокой, полученное в результате изучения эколого-биологических и биохимических особенностей вида в природе.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 179 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, четырех глав экспериментальной части, общих выводов и приложений, списка литературы, включающего 246 источников, в том числе 61 на иностранных языках. Иллюстративный материал представлен 48 рисунками и 35 таблицами.
Лекарственные растения, используемые для профилактики и лечения воспалительных заболеваний
Применение лекарственных растений и препаратов из них для лечения и профилактики различных заболеваний с каждым годом занимает все большее место в клинической медицине. В настоящее время изучено около 6000 видов растений, многие из которых являются потенциальными источниками для получения новых лекарственных препаратов. Возрастающая популярность и эффективность препаратов растительного происхождения во многом объясняется тем, что содержащиеся в них биологически активные вещества воздействуют на организм комплексно, легко включаются в обменные процессы и практически не проявляют побочных эффектов при длительном применении.
Одним из основных направлений современной фармацевтической науки является фармакопіостическое исследование новых видов растений с целью выявления перспективных источников биологически активных веществ и расширения ассортимента лекарственных растительных средств, используемых для профилактики и лечения широко распространенных заболеваний, в том числе и тех, в основе которых лежит воспалительный процесс.
Актуальной проблемой современной медицины является, в частности, предупреждение и лечение гинекологических воспалительных заболеваний, что определяется их высокой частотой, склонностью к длительному течению, развитием полисистемных расстройств, а также существенным отрицательным влиянием на репродуктивную функцию и трудоспособность женщин [168, 170]. Успешная терапия воспалительных заболеваний органов репродуктивной системы женщин имеет значение не только в восстановлении функций половой системы, но и в устранении сопутствующих нарушений эндокринной, нервной и других систем организма. Несвоевременное и неадекватное лечение этих заболеваний приводит к хронизации процесса и является причиной бесплодия, внематочных беременностей, тазовых болей, причиняющих страдания и даже инвалидизирующих женщин в возрасте социальной активности [3, 47, 61, 62,129, 168, 170].
В структуре гинекологических заболеваний воспалительные заболевания занимают первое место во всем мире [122, 129, 130] и составляют 35-60% от числа всех заболеваний [22, 79, 102]. Воспалительные процессы матки и ее придатков характеризуются частым, в 45-70% случаев, переходом в хроническое рецидивирующее [25]. Следует отметить, что наибольший удельный вес в структуре воспалительных заболеваний половых органов имеют поражения придатков матки (от 67.6 до 98.8%), реже встречаются эндометриты (1—1.9%) [4, 122, 169]. Чаще наблюдается сочетание воспалительных заболеваний матки и ее придатков [4, 23, 122].
С позиций современной патофизиологии воспалительные заболевания органов репродуктивной системы рассматривают как полисистемные заболевания с расстройствами половой, иммунной, нервной, эндокринной и других систем [4,25,109,171,172].
Воспалительные заболевания органов репродуктивной системы являются полиэтиологичными заболеваниями, вызывающими тяжелые нарушения системы гомеостаза и паренхиматозных органов [22, 24, 102]. Частота и серьезные последствия данных заболеваний заставляют проводить дальнейшие поиски эффективных методов их лечения.
Современная противовоспалительная терапия носит комплексный характер и направлена на профилактику и коррекцию воспалительного процесса, а также на повышение защитных сил организма. К основным медикаментозным средствам, применяющимся при воспалительных заболеваниях, относятся антибактериальные, болеутоляющие, седативные, десенсибилизирующие, дезин-токсикационные препараты, а также иммуномодуляторы и витамины [23, 24, 175].
Антибактериальные препараты выбирают в соответствии с чувствительностью к ним возбудителя заболевания. Чаще всего применяют антибиотики и сульфаниламиды, используются и производные нитрофурана, хлорофиллипт, дноксиднн [22, 24, 71, 79, 122]. Однако наличие в арсенале лекарственных средств большого выбора антибиотиков широкого спектра действия не привело к окончательному решению этой проблемы. Все используемые в настоящее время антибиотики оказывают побочное действие [61, 62, 102]. Течение воспалительных заболеваний может быть отягощено проявлением суперинфекции (аутоинфекция условно-патогенными микробами) и дисбактериоза, представляющими собой феномен отрицательного побочного действия лекарств данной группы [12, 84, 122, 129]. Антибиотики служат причиной возникновения лекарственной аллергии, способствуют формированию стертых и затяжных форм, угнетают защитные силы организма [4, 23, 24, 175].
Часто применяют и нестероидные противовоспалительные средства (НВПС). Их механизм действия заключается в ограничении экссудативных появлений воспалительного процесса и инактивации медиаторов воспаления (простагландинов, гистамина, кининов, комплемента и т.д.); аналитическом эффекте (не уступающим наркотическим аналгетикам) и антиагрегационном действии в отношении тромбоцитов. НВПС также ингибируют трансформацию лимфоцитов, вызываемую различными антигенами; оказывают десенсибилизирующее и антипиретическое, а также антиоксидантное действие [84, 94]. Однако и НВПС имеют ряд побочных эффектов - это ульцерогенное, антиагрегаци-онное действия [22, 24, 94], гематологические нарушения (лейкопения, панци-топения, тромбоцитопения, апластическая анемия) [4]. У 10-30% больных возникает бронхоспазм (аспириновая астма), нарушение функций почек, энцефалопатия, некроз печени [25, 62, 84, 102,109].
Таким образом, практически все используемые в настоящее время при лечении воспалительных заболеваний препараты оказывают побочное действие и, следовательно, имеют противопоказания к применению. Поэтому, несмотря на то, что современный арсенал противовоспалительных препаратов достаточно обширен, проблема изыскания новых высокоэффективных, безвредных, дешевых и удобных в применении лекарственных средств остается весьма актуальной. В этом плане особого внимания заслуживают лекарственные средства растительного происхождения, как средства, более близкие организму человека, чем синтетические, легко включающиеся в обменные процессы и практически не имеющие побочных эффектов и противопоказаний [6, 38, 92, 104]. ВОЗ рекомендует расширить поиск и внедрение местных лекарственных растений, так как они малотоксичны, обладают высокой биологической активностью, оказывают тонизирующий, укрепляющий эффект, регулируют обмен веществ и функцию пищеварительных органов [99, 107, 116]. Они оказывают многостороннее действие благодаря наличию в них различных групп биологически активных веществ [92].
Следует отметить, что содержание целого ряда биологически активных веществ в лекарственных растительных средствах, несомненно, обусловливает противовоспалительное действие на патологические процессы в поврежденных органах и тканях [9, 40]. Из различных групп биологически активных веществ значительный интерес представляют соединения фенольной природы, так как они способны иншбировать свободнорадикальное окисление липидов, оказывать мембраностабилизирующее действие [9, 10, 11, 18, 32, 42, 138; 163]. Помимо фенольных соединений, противовоспалительный эффект данных средств обеспечивают и другие природные соединения - органические кислоты, аминокислоты, полисахариды [135, 184], витамины, алкалоиды, эфирные масла [33, 35], кумарины [40], сапонины [107], иридоиды [153, 162].
Фитопрепараты с успехом используются в комплексе лечебных мероприятий, включающих применение антибиотиков, сульфаниламидов, физиотерапии, лечебных грязей, аутогемотерапии, иммуномодулирующих препаратов, общеукрепляющих процедур [30, 65].
В Государственную Фармакопею XI [46] включено 83 вида лекарственных растений, и лишь для некоторых из них известна противовоспалительная активность.
Продуктивность ортилии однобокой и запасы ее сырья в природных популяциях Западного Забайкалья
Изучение сырьевой продуктивности ортилии однобокой в природных популяциях Западного Забайкалья проводили в 2002 году в период цветения. Так как у ортилии однобокой в качестве сырья используется надземная часть, то величина сырьевой продуктивности практически равна надземной фитомассе. Сырьевую продуктивность выражали в г/м .
Данные по биологической продуктивности ортилии однобокой в исследованных сообществах показывают, что величины сырьевой фитомассы, образуемые ценопопуляциями данного вида варьируют в зависимости от условий местообитания в пределах от 7.9 до 14.4 г/м . Так, в ценопопуляций Горячинск-2 (сосняк рододендроново-брусничный) отмечены наибольшие показатели фитомассы и численности, самые низкие показатели продуктивности наблюдаются в ценопопуляций Верхняя Березовка-2 (березняк разнотравный) (табл. 2).
В разных ценопопуляциях у особей и парциалей ортилии однобокой наблюдались колебания значений и морфометрических параметров, определяющих биологическую продуктивность популяций (табл. 3,4).
Изменение параметров организма и ценопопуляцни происходит при воздействии различных экологических факторов, в связи с чем возникает необходимость оценки состояния вида в сообществе и определения оптимального состояния (оптимума) ценопопуляцни и составляющих ее элементов [57, 58, 112, 115,174,182,196].
Оптимум организма у растений выражается максимальной его мощностью, которая гарантирует выживание в условиях конкуренции, обеспечивает высокую устойчивость и репродуктивную способность. Для оценки мощности можно использовать различные размерные морфометрические показатели - высоту, число побегов и листьев, размеры листовой пластинки и т.д. При определении оптимального состояния организма и ценопопуляций можно использовать такой критерий, как равновесное сочетание различных признаков [174]. Весь диапазон наблюдаемых значений был нами разделен на три равных градации, которые соответствовали трем баллам; балл 1 присваивался, если параметр попадал в нижнюю градацию, балл 3 - в верхнюю. При определении оптимума по совокупности признаков используют среднюю оценку в баллах; об оптимальности организма и ценопопуляций судят не только по максимальному значению среднего балла, но и по уравновешенному сочетанию признаков, величина которых попадает в средний интервал наблюдаемых значений.
Для определения оптимума особей и парциалей ортилии однобокой вир-гинилыюго и генеративного возрастного состояния оценивались такие морфо-метрические параметры, как высота побега, количество листьев одного побега, площадь листовой пластинки, отношение длины соцветия к высоте побега, количество цветков. Результаты оценки оптимума ортилии однобокой представлены в таблицах 3 и 4. Поскольку при сравнении у виргинильных и генеративных растений наблюдается схожее распределение показателей (табл. 3, 4), мы сочли возможным их совмещение и при использовании трехбалльной шкалы оценки оптимума организма у ортилии однобокой ценопопуляций можно расположить в порядке уменьшения среднего балла следующим образом: В. Бере-зовка-2 — Омулевая гора = В. Березовка-3 = Максимиха — Горячинск-2 — Го-рячинск-1 — Большой Куналей — Петуховка — В. Березовка-1 — Горячинск-3 = Уро.
Максимальную мощность, выражающуюся в большей высоте побегов, числе листьев и максимальных размерах листовой пластинки и соцветия, имеют парциальные побеги ортилии однобокой, составляющие ценопопуляцию В. Бе-резовка-2 (березняк разнотравный). Для дерново-лесных карбонатных почв данного местообитания характерно высокое содержание гумуса и подвижных, т. е. усвояемых форм фосфора и калия (табл. 1 и прил. 1), что способствует, по-видимому, максимальному развитию побегов.
Наибольшие значения параметров генеративной сферы - числа цветков в сочетании со средними показателями размера листовой пластинки и числа листьев наблюдаются у растений ценопопуляции В.Березовка-3 (сосняк редкопокровный). Дерново-лесные суглинистые почвы данного местообитания характеризуются высокой обеспеченностью элементами питания - гумусом, калием и фосфором (табл. 1 и прил. 1); кроме того, в данном местообитании наблюдается достаточная освещенность (сомкнутость крон составляет 0.3) и слабая выраженность травяного покрова (табл. 1).
Хорошие условия освещенности (сомкнутость крон - 0.3) и минерального питания в ценопопуляции Омулевая гора при недостаточном увлажнении и слабо выраженном травостое благоприятно сказываются на величине таких показателей, как высота побега, число листьев и цветков. Следует отметить, что почвы всех изученных местообитаний имеют высокую степень обеспеченности подвижными формами калия. Поскольку одной из основных функций этого элемента в растениях является повышение способности протоплазмы клеток удерживать воду, это может в какой-то мере определять, с учетом и такого фактора, как микотрофность ортилии, возможность успешного произрастания и развития растения в условиях недостаточного увлажнения.
В ценопопуляции Горячинск-2 (сосняк рододендроново-брусничный на дерново-лесных супесчаных почвах) отмечается наиболее уравновешенное сочетание признаков и это местообитание, характеризующееся достаточной обеспеченностью почв элементами питания и высокой степенью освещенности (опушка леса) можно считать приближающимся к оптимуму организма по совокупности нескольких признаков.
Отношение популяций к условиям произрастания имеет два аспекта: внешний, определяемый связями с ценозом и внутренний, определяемый существованием популяции как видовой категории [174]. Оценка первого аспекта существования зависит от вещественно-энергетического вклада в обменные процессы ценоза и связана с величиной фитомассы, создаваемой популяцией.
Второй аспект существования связан с поддержанием уровня численности и генетического разнообразия, свойственного данному виду; наиболее подходящими параметрами для оценки данного аспекта являются уровень численности и степень обеспеченности популяции молодыми растениями. При оценке оптимального состояния ценопопуляций ортилии однобокой мы использовали равновесное сочетание таких признаков, как побеговая фито-масса ценопопуляций, численность побегов, степень обеспеченности популяции молодыми растениями и др. Результаты оценки оптимума ценопопуляций ортилии однобокой представлены в таблице 5.
Согласно полученным результатам, при оценке ценопопуляций по совокупности признаков с использованием шкалы по уменьшению среднего балла местообитания располагаются следующим образом: Горячинск-2— Макснмиха — В. Березовка-1 — В. Березовка-3 = Большой Куналей = Горячинск-1 — Омулевая гора = В. Березовка-2 = Горячинск-3 — Петуховка -1 — Уро.
Количественное определение биологически активных веществ
Для некоторых групп БАВ, обнаруженных в ортилии однобокой: дубильных веществ, простых фенолов, аскорбиновой и органических кислот было проведено определение количественного содержания.
Дубильные вещества
При проведении количественного анализа дубильных веществ были использованы два метода количественного определения: перманганатометриче ский (метод Левенталя) [45] и трилонометрический (комплексонометрический) [13, 166]. Результаты количественного определения дубильных веществ в над земной части ортилии однобокой представлены в таблице 7
Различия в результатах определения объясняются тем, что при использовании перманганатометрического метода сопутствующие вещества (флавонои-ды, фенолокислоты, простые фенолы) завышают результаты определения [15].
Комплексонометрический метод, используемый нами для определения дубильных веществ, основанный на способности осаждения танидов солями тяжелых металлов, является более точным, избирательным и предпочтительным [13, 166]. Сущность метода заключается в осаждении дубильных веществ аммиачным раствором цинка, выделении осадка центрифугированием, разрушением комплекса цинк-дубильные вещества кислотой с последующим титрованием выделившихся катионов цинка раствором трилона Б в присутствии индикатора ксиленолового оранжевого.
Таким образом, при использовании данного метода установлено, что содержание дубильных веществ в надземной части ортилии однобокой, собранной в фазу бутонизации и цветения, довольно значительно и составляет 12.62 ± 0.56 % (среднее из пяти измерений).
Аскорбиновая кислота
Количественное определение содержания аскорбиновой кислоты в надземной части ортилии однобокой проводилось с использованием методики ГФ XI [46], основанной на способности аскорбиновой кислоты восстанавливать 2,6-дихлорфенолиндофенолят натрия. Содержание аскорбиновой кислоты в надземной части растения (фаза бутонизации и цветения) составляет 0.05 ± 0.002 %.
Органические кислоты
Определение количественного содержания органических кислот проводилось в образцах надземной части ортилии однобокой, собранных в разные фазы вегетации.
Установлено, что в надземной части растения органические кислоты находятся преимущественно в свободном состоянии (до 89% от общего содержания).
Выявлена динамика накопления органических кислот и их форм в течение года пр основным фазам вегетации (табл. 8). Содержание связанных форм органических кислот увеличивается к периоду зимнего покоя до 1.15%. Эта особенность, вероятно, связана со способностью органических кислот нейтра 100 лизовать поступающий извне избыток катионов щелочных и щелочноземельных металлов, что приводит к накоплению их в связанной форме цитратов, ок-салатов, тартратов [135]. Содержание свободных кислот за период апреля по сентябрь почти неизменно - в пределах 4.46 — 4.63 %, к концу ноября оно несколько снижается - до 4.29 %.
Изучены особенности накопления индивидуальных органических кислот ортилии однобокой в течение года и получены следующие данные: содержание янтарной кислоты повышается в фазу бутонизации-цветения (июнь-июль) (до 0.67%) и снижается к концу фазы плодоношения - началу периода зимнего покоя (осень) (до 0.40%), содержание лимонной кислоты резко повышается к осени (до 2%), содержание яблочной кислоты остается постоянным (около 1%) (табл. 9). Преобладающей органической кислотой является лимонная (около 40% от общего содержания). Необходимо отметить, что при проведенном ранее микроскопическом исследовании органов ортилии однобокой выявлено нали 101 чиє в паренхимных клетках многочисленных друз кристаллов, и, учитывая вышеизложенные данные, вероятнее всего эти кристаллические образования являются цитратами.
Простые фенолы
Для проведения количественного анализа простых фенолов мы сочли возможным использование методики количественного определения арбутина в листьях толокнянки [46], так как она основывается на йодометрическом титровании гидрохинона, полученного в результате гидролиза очищенного от сопутствующих веществ (других фенольных соединений) водного извлечения. Содержание простых фенолов в надземной части ортилии однобокой (фаза бутонизации и цветения) составило 6.88 ± 0.33 % (среднее из пяти измерений).
Разработка показателей качества и установление срока годности сухого экстракта
Для характеристики полученного сухого экстракта были предложены следующие показатели качества: описание внешнего вида, подлинность, растворимость, потеря в массе при высушивании, микробиологическую чистоту, содержание тяжелых металлов, содержание суммы флавоноидов в пересчете на ГСО рутина. Показатели качества регламентируются проектом ФСП. Разработ 152 ка показателей качества проводилась на 5 сериях сухого экстракта, полученного в лабораторных условиях.
Сухой экстракт получают из надземной части ортилии однобокой.
Описание. Аморфный порошок от коричневого до коричнево-черного цвета с приятным запахом и горьковатым вкусом. Гигроскопичен. Комкуется.
Подлинность.
1) 0.02 г экстракта растворяют в 5 мл горячей воды, прибавляют 0.5 мл кислоты хлористоводородной концентрированной, 0.02 г порошка металлического магния или магниевой стружки и нагревают в течение 3 минут на кипящей водяной бане. Раствор окрашивается в красно-кирпичный цвет.
2) 0.1 г экстракта растворяют в 30 мл 70 % этанола, нагревают на кипящей водяной бане в течение 15 минут, фильтруют. 0.003 мл полученного извлечения наносят на линию старта микропипеткой и проводят хроматографированне в системе растворителей 12, а затем в системе растворителей 11. При обработке хроматограмм 2 % раствором алюминия хлористого в водно-спиртовом извлечении должно обнаруживаться не менее 9 пятен с желтой флюоресценцией в УФ-свете.
3) 0.1 г экстракта подвергают кислотному гидролизу (гидролиз осуществляют 5 % кислотой хлористоводородной в 70 % спирте этиловом на кипящей водяной бане), 0.003 мл полученного извлечения наносят на линию старта микропипеткой и проводят хроматографированне восходящим способом в системе растворителей н-бутанол : уксусная кислота : вода (4 : 1 : 2) (1 напрвление) , а затем в системе растворителя 15 % уксусная кислота (2 направление). При просматривании хроматограммы в УФ-свете до и после обработки 2 % раствором алюминия хлорида обнаруживаются кемпферол - Rf=0.80 (1), Rf=0.08 (2); кверцетин - Rf=0.65 (1), Rf=0.08. (2) (в сравнении с аутентичными образцами).
Потеря в массе при высушивании. Около 0.5 г (точная навеска) препарата сушат при температуре от 85 до 90 С до постоянной массы. Потеря в массе при высушивании соответствует требованиям ГФ XI и не должна превышать 5%. Определение потери в массе при высушивании проводили также на деривато 153 графе ОД-102 (фирма MOM Hungary). Установлено, что основное удаление влаги начинается при температуре 52 С, а при температуре 130 С происходит разложение экстракта.
Микробиологическая чистота. Препарат должен выдерживать требования, указанные в ГФ IX, вып.2, С. 193; изменения № 1 от 12.12.1996 г., категория 3 Д.
Тяжелые металлы. Не более 0.01 % (ГФ IX, вып.2, С. 161)
Количественное определение. В основу количественного определения суммы флавоноидов в сухом экстракте ортилии однобокой положен метод дифференциальной спектрофотометрии (см. п. 6.4.). Данная методика воспроизводима и характеризуется отсутствием систематической ошибки.
Проведено изучение сроков годности на 5 сериях экстракта ортилии однобокой по показателям, регламентируемым проектом ФСП, при хранении в обычных условиях (в сухом, защищенном от света месте) с контролем этих показателей через каждые 6 месяцев (табл. 35).Таким образом, на основании полученных данных установлен предварительный срок годности сухого экстракта - 2 года.
