Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор 9
І.І.Ботаническая характеристика, химический состав черной смородины и применение в медицине 9
1.1.1 .Ботаническая характеристика 9
1.1.2.Химический состав плодов черной смородины 11
1.1.3.Химический состав листьев черной смородины 15
1.1.4.Применение черной смородины 17
1.1.4.1. Применение черной смородины в пищевой промышленности 17
1.1.4.2.Применение черной смородины в народной медицине 17
1.1.4.3.Применение черной смородины в официальной медицине... 18
1.1.5.Исследования по изучению черной смородины 20
1.2.Полифенольные соединения, их классификация и применение 23
1.2.1.Структура и классификация полифенольных соединений 23
1.2.2.Источники полифенолов 26
1.2.3.Фармакологическая активность полифенольных соединений 29
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 33
2.1.Объекты исследования и вспомогательные материалы 33
2.2.Средства измерений 34
2.3.Методы исследования 35
2.3.1. Определение выхода экстрактивных веществ 35
2.3.2.Изучение полифенольных соединений экстрактов листьев и жома плодов черной смородины методом спектрофотометрии 35
2.3.3.Идентификация полифенольных соединений сухих экстрактов листьев и жома плодов черной смородины методом тонкослойной хроматографии
2.3.4.Исследование полифенольных соединений сухих экстрактов листьев и жома плодов черной смородины методом ВЭЖХ 38
2.3.5.Определение количественного содержания хлорогеновой кислоты в сухих экстрактах листьев и жома плодов черной смородины методом ВЭЖХ 41
2.3.6.0пределение суммы полифенольных соединений в сухих экстрактах листьев и жома плодов черной смородины 42
2.3.7,Определение суммы антоцианов в сухом экстракте жома плодов черной смородины 43
2.3.8.0пределение количественного содержания флавоноидов в сухих экстрактах листьев и жома плодов черной смородины 45
2.3.9.0пределение антимикробной активности сухих экстрактов листьев и жома плодов черной смородины 47
2.3.10.Микробиологическая чистота сухих экстрактов листьев и жома плодов черной смородины 48
2.3.11.Определение антиоксидантной активности сухих экстрактов листьев и жома плодов черной смородины 48
ГЛАВА 3. Разработка методики получения полифенольных комплексов из листьев и жома плодов черной смородины 50
3.1.Определение оптимальных условий экстракции полифенольных комплексов из листьев и жома плодов черной смородины 50
3.2. Получение сухих экстрактов из листьев и жома плодов черной смородины 58
ГЛАВА 4. Фармакогностическое изучение листьев и жома плодов черной смородины 59
4.1 .Макроскопический анализ 59
4.2.Микроскопический анализ 61
4.3.Предварительный анализ полифенольных соединений сухих экстрактов
листьев и жома плодов черной смородины 63
4.3.1.Качественные реакции для установления полифенольных соединений 64
4.3.2.Изучение полифенольных соединений экстрактов листьев и жома плодов черной смородины методом спектрофотометрии 65
4.4.Идентификация полифенольных соединений сухих экстрактов листьев и жома плодов черной смородины методом тонкослойной хроматографии 69
4.5.Исследование полифенольных соединений сухих экстрактов листьев и жома плодов черной смородины методом ВЭЖХ 74
4.6,Определение количественного содержания хлорогеновой и галловой кислот в сухих экстрактах листьев и жома плодов черной смородины методом ВЭЖХ 80
4.7.Определение суммы полифенольных соединений в сухих экстрактах листьев и жома плодов черной смородины 83
4.8. Определение суммы антоцианов в сухом экстракте жома плодов черной смородины 85
4.9. Определение количественного содержания флавоноидов в сухих экстрактах листьев и жома плодов черной смородины 86
4.10.Определение антимикробной активности сухих экстрактов листьев и жома плодов черной смородины 89
4.11.Микробиологическая чистота сухих экстрактов листьев и жома плодов черной смородины 90
4.12. Определение антиоксидантной активности сухих экстрактов листьев и жома плодов черной смородины 91
Глава 5. Изучение полифенольных соединений листьев и жома плодов черной смородины методом вэжх 93
Глава 6. Получение лекарственной формы с экстрактом листьев черной смородины и разработка показателей качества 98
6.1 .Разработка рецептуры геля с полифенольным комплексом листьев черной смородины 98
6.2.Технология получения геля с полифенольным комплексом листьев черной смородины 100
6.3.Разработка характеристик показателей качества геля с сухим экстрактом листьев черной смородины 101
6.3.1.Определение внешнего вида, однородности, цвета, запаха и вкуса 101
6.3.2,Определение водородного показателя (рН) геля 101
6.3.3.Микробиологическая чистота геля с сухим экстрактом листьев черной смородины 102
6.3. Стандартизация геля с сухим экстрактом листьев черной смородины 103
6.4.Изучение стабильности геля при хранении и определение срока его годности 103
6.5.Сравнительный анализ состава полифенольных веществ в сухом экстракте листьев черной смородины и геле на его основе методом ВЭЖХ 105
Выводы 108
Список литературы
- Применение черной смородины в пищевой промышленности
- Определение выхода экстрактивных веществ
- Получение сухих экстрактов из листьев и жома плодов черной смородины
- Определение количественного содержания флавоноидов в сухих экстрактах листьев и жома плодов черной смородины
Введение к работе
Актуальность темы. Развитие современной медицины позволяет предотвращать и излечивать многие болезни. В то же время значительно возросло количество хронических заболеваний, заметно увеличилась частота аллергических и токсических явлений, связанных с применением аллопатических средств. В поисках новых эффективных и безопасных препаратов клиницисты и фармакологи обращаются к лекарственным растениям.
Вызвавший удивление «Французский феномен» заставил ученых обратить внимание на полифенольные соединения растений. Многообразные по своей структуре полифенолы оказывают разнонаправленное фармакологическое действие на организм человека. На сегодняшний день доказаны их антиоксидантные, противовоспалительные, адаптогенные, капилляроукрепляющие свойства.
Всеобщая заинтересованность и возможность широкого применения полифенольных соединений обусловливает актуальность поиска их новых недорогих и доступных сырьевых источников. Перспективной в этом плане является черная смородина.
Богатые флавоноидами, витаминами, минеральными веществами плоды и листья черной смородины издавна применяют в народной медицине в свежем виде и для приготовления настоев, отваров при лечении цинги, простуды, ревматизма, подагры, заболеваний печени, почек и мочевыводящих органов, гипертензии. Тем не менее до настоящего времени данные виды сырья не признаны лекарственными и не включены в Государственную Фармакопею, что можно объяснить недостаточностью исследований химического состава и биологической активности, отсутствием методов стандартизации. Комплексное изучение листьев и жома плодов черной смородины и экстрактов на их основе позволит обосновать возможность применения данного сырья в качестве нового источника полифенольных комплексов, расширяя базу лекарственных растений, и поэтому является актуальным.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является фитохимическое изучение листьев и жома плодов черной смородины и стандартизация, получаемых на их основе экстрактов и лекарственного средства, содержащих полифенольные комплексы.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
-
Провести фармакогностический анализ листьев и жома плодов черной смородины как нового вида лекарственного растительного сырья – источника полифенольных соединений;
-
Разработать методику получения полифенольных комплексов из листьев и жома плодов черной смородины;
-
Исследовать химический состав листьев и жома плодов черной смородины и экстрактов на их основе;
-
Разработать методику стандартизации, показатели качества и их нормы для листьев и жома плодов черной смородины, экстрактов из них, а также создать нормативную документацию на новые виды лекарственного растительного сырья;
-
Изучить антиоксидантную и антимикробную активность сухих экстрактов;
-
Провести разработку состава, технологии получения и показателей качества лекарственной формы – геля – на основе сухого экстракта листьев черной смородины.
Научная новизна. Впервые изучены листья и жом плодов черной смородины как перспективные источники полифенольных комплексов, на основании анатомо-морфологического исследования установлены диагностические признаки, а также разработаны показатели качества и их нормы для лекарственного сырья.
Установлены оптимальные условия извлечения полифенольных соединений из растительного сырья с учетом концентрации экстрагента, продолжительности экстрагирования, соотношения сырье-экстрагент, позволившие разработать технологию получения сухих экстрактов на основе листьев и жома плодов черной смородины.
С помощью хроматографии в тонком слое сорбента и ВЭЖХ охарактеризован качественный состав полифенольного комплекса листьев и жома плодов черной смородины и их сухих экстрактов. Методом абсолютной калибровки дана количественная оценка содержания доминирующих веществ в анализируемых объектах.
Подобраны условия и проведено количественное определение содержания полифенольных соединений, суммы флавоноидов и антоцианов в растительном сырье и сухих экстрактах. Предложена методика стандартизации сырья и экстрактов на основе данных исследований.
Изучена антиоксидантная и антимикробная активность сухих экстрактов.
Разработан состав, технология получения и показатели качества лекарственной формы – геля – на основе сухого экстракта листьев черной смородины. Изучена стабильность данного средства при хранении.
Практическая значимость работы
Установлены показатели подлинности, качества и их нормы для листьев и жома плодов черной смородины, экстрактов из них, которые описаны в созданной нормативной документации на новые виды лекарственного растительного сырья.
Результаты диссертационной работы использованы в проекте «Методического руководства по контролю качества экстрактов из лекарственного растительного сырья, используемых в качестве лекарственных средств и для создания препаратов на их основе» (в Ташкентском фармацевтическом институте).
Приоритет проведенных исследований подчеркивается полученным патентом №2361600 от 20.07.2009 г. на изобретение «Средство для лечения заболеваний пародонта».
Основные положения, выносимые на защиту:
-
результаты фармакогностического изучения листьев и жома плодов черной смородины;
-
результаты исследований по установлению оптимальных технологических условий получения сухих экстрактов из листьев и жома плодов черной смородины;
-
результаты качественного и количественного анализа полифенольных компонентов и данные по стандартизации листьев и жома плодов черной смородины и получаемых из них сухих экстрактов;
-
результаты по разработке состава и показателей качества лекарственной формы на основе сухого экстракта листьев черной смородины.
Апробация работы. Основные положения и результаты исследования были представлены на IV Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов» (2-5 июня 2007 г.), Всероссийской научно-методической конференции молодых ученых «Актуальные проблемы садоводства в России и пути их решения» (2-5 июля 2007 г.), 8-ом международном конгрессе «Здоровье и образование в ХХI веке; концепции заболеваний цивилизации» (14-17 ноября 2007 г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, из них 2 в печатных изданиях, рекомендованных ВАК; получен патент.
Связь темы диссертации с проблемным планом работ ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова: диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова по теме: «Новые знания и подходы в оценке качества и сертификации биологически активных соединений синтетического и природного происхождения, лекарственных препаратов, изделий медицинской техники (технологические и экологические аспекты)», номер государственной регистрации 01.200.118796.
Объем и структура диссертации
Диссертационная работа изложена на 125 страницах машинописного текста, иллюстрирована 38 таблицами, 30 рисунками и состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания материалов и методов исследования (глава 2), собственных исследований (главы 3-6), выводов, списка литературы и приложения. Список использованной литературы включает 153 источника, в том числе 57 иностранных.
Применение черной смородины в пищевой промышленности
Отечественные работы последних лет по изучению черной смородины посвящены выявлению новых перспективных сортов и гибридов, применимых для промышленного возделывания и характеризующихся высокой зимостойкостью, урожайностью, устойчивостью к заболеваниям, крупноплодностью, высоким содержанием биологически активных веществ, в частности витамина С, Сахаров, пектиновых веществ. Установили, что наибольшей пищевой и биологической ценностью обладают свежезамороженные ягоды черной смородины, поскольку сохраняют больше антиоксидантов. Предложили использовать сушеные ягоды и листья для купажирования черного и зеленого байхового чая [37].
Многочисленные экспериментальные работы по изучению фитохимического состава и проявляемой биологической активности плодов черной смородины, а также фармакологического действия, оказываемого на организм животных и человека, принадлежат зарубежным исследователям.
Обширные исследования плодов черной смородины, а также соков и вин на их основе, проведены финскими учеными. Например, M.J. Anttonen и R.O. Karjalainen (2006) свою работу посвятили изучению качественного состава феноловых кислот, флавоноидов, в том числе и антоцианов, установили их количественное содержание. Также определили титруемую кислотность и сумму полифенолов.
R. Puupponen-Pimia с соавторами (2001), изучая химический состав многих ягод, в том числе и черной смородины, определили количественное содержание антоцианов, флавонолов, флаван-3-олов, суммы полифенольных соединений, при этом доказали способность экстракта смородины ингибировать рост грамм-отрицательных бактерий. Высокую активность экстракт проявил в отношении Е. coli и Salmonella enterica.
По мнению ряда авторов антиокислительная способность плодов черной смородины довольно высока в сравнении с другими ягодами и состоит в тесной зависимости от содержания полифенолов [115, 130]. При этом другие исследователи концентрацию витамина С рассматривают как основной показатель возможной антиоксидантной активности [142].
Коллектив японских ученых доказал противовирусное действие экстракта из плодов дикой черной смородины в отношении вируса гриппа А и В [100]. Т. Suzutani с коллегами (2003) продолжил исследование активности экстракта из черной смородины в отношении герпес-вируса. Российские авторы А.Г. Бачинский и А.Н. Децина (1998) исследовали антимикробную активность спиртовых настоек листьев черной смородины и возможность их использования в качестве биоцидных добавок в косметическом производстве.
Особый интерес вызывают полученные М.Е. Olsson с соавторами (2004) данные о способности экстракта черной смородины in vitro ингибировать пролиферацию клеток рака груди, рака толстой кишки. При этом авторами установлено, что экстракты с высоким содержанием витамина С более активно тормозят пролиферацию раковых клеток.
На протяжении долгих лет черная смородина является популярной и востребованной ягодной культурой в России и во всем мире. Производство плодов смородины и крыжовника составляет порядка 601 тыс. тонн и сосредоточено в Европе, Австралии, Новой Зеландии, Северной Азии. Более 1/3 производства находится на территории РФ (214 тыс. тонн) [40].
Интерес потребителей и ученых к данной культуре сохраняется, и смородина остается популярным, перспективным лекарственным сырьем. Значительное количество исследований плодов черной смородины доказывают многообразность и богатство химического состава и разнонаправленность оказываемого фармакологического действия. Терапевтический эффект смородины присутствует и проявляется при лечении простудных заболеваний, гриппа, ревматизма, подагры, заболеваний печени, почек и мочевыводящих органов, гипертензии, повышенной ломкости капилляров, кровоточивости десен, экземы. Плоды и листья в виде БАД находят применение и в профилактике заболеваний, обогащая рацион питания человека биологически активными веществами.
В то же время арсенал лекарственных средств и добавок, в качестве действующего компонента содержащих черную смородину, очень скуден.
В Государственной Фармакопее одиннадцатого издания отсутствуют статьи на листья и плоды черной смородины, в настоящее время в нее включена только частная статья на настойку матричную гомеопатическую. Качество производимых препаратов, содержащих смородину, не регламентируется ни Государственным Реестром, ни Государственной Фармакопеей. Для оценки качества сырья, в частности, плодов, производители руководствуются только ГОСТом 21450-75 пищевой промышленности "Плоды черной смородины". Можно заключить, что исключение черной смородины из отечественных Фармакопеи было необоснованным и существует потребность в разработке нормативно-технической документации.
Таким образом перспективным направлением является изучение полифенол ьного комплекса и фармакологической активности листьев и жома плодов черной смородины с целью введения данных видов в разряд лекарственного растительного сырья и создания новых препаратов на их основе. 1.2.Полифенольные соединения, их классификация и применение
Синтез всех полифенольных соединений, кроме флавоноидов, начинается с единого биосинтетического соединения - шикимовой кислоты, поэтому данный механизм образования фенолов получил название шикиматный путь. При образовании флавоноидов одно ароматическое кольцо (А) синтезируется из ацетил - СоА и малонил - СоА поликетидным (ацетато-малонатным) путем, а другое кольцо (кольцо В) и его боковая Сз-цепь образуются из фенилаланина [26, 33, 81, 148]. Наиболее распространена классификация фенольных соединений по углеродному скелету, предложенная Т. Гудвином и Э. Мерсером (1986) и позже дополненная М.Н. Запрометовым (1993). Данные ученые выделяют следующие группы фенольных соединений: 1) простые или простейшие — соединения Сб- ряда; Представителями простых соединений Сб- ряда являются фенол и его производные — пирокатехин, резорцин, гидрохинон, арбутин, флорин. 2) гидроксибензойные кислоты и их производные - соединения Сб С,-ряда; К данной группе полифенолов относятся /?-оксибензойная и гентизиновая кислоты, обнаруженные у 97 % исследованных растений [9], а также галловая, салициловая, гентизиновая, о-пирокатеховая, сиреневая, р-резорциловая кислоты. 3) гидроксикоричные кислоты и их производные, кумарины — соединения Сб - Сз- ряда;
Определение выхода экстрактивных веществ
Для стандартизации геля с сухим экстрактом листьев черной смородины предложено использовать два показателя — количественное содержание полифенольных соединений в пересчете на галловую кислоту и содержание хлорогеновой кислоты. Выбор данных показателей для стандартизации геля обусловлен высоким содержанием полифенольных веществ, доминирующим соединением которых является хлорогеновая кислота, широким спектром их фармакологического действия, экспрессностью и доступностью проведения количественного определения.
В ходе количественного определения содержание полифенольных соединений в пересчете на галловую кислоту составило 0,070 % и содержание хлорогеновой кислоты 0,0335 %.
Под влиянием времени изменяется стабильность, физико-химические и органолептические свойства лекарственных форм. Следовательно важной характеристикой препарата является срок годности, в течение которого сохраняется качество и терапевтический эффект лекарственного средства.
Определение срока годности геля проводили методом ускоренного старения при повышенной температуре, руководствуясь Временной инструкцией И-42-2-82 от 1983 г. Суть метода заключается в выдерживании исследуемого образца при температуре, превышающей необходимую температуру хранения хотя бы на 10 С [18].
Образцы препарата выдерживали в термостате при 40 С в течение 45 дней. Параллельно изучали стабильность геля при комнатной температуре (20±2 С).
Качество геля в процессе хранения при повышенной и комнатной температуре оценивали по показателям: внешний вид, цвет, запах, вкус, водородный показатель (рН), содержание полифенольных веществ в пересчете на галловую кислоту, содержание хлорогеновой кислоты и микробиологическую чистоту. Срок годности геля при необходимой температуре хранения рассчитывали по формуле: С-СэксхЛ(№с )/10,где С — срок годности геля, сутки; Сэкс - экспериментальный срок годности, сутки; иже-арум _ коэффициент соответствия для разности температур при хранении в экспериментальных и обычных условиях, 2; t экс. - экспериментальная температура, С; t хр. - температура при хранении в обычных условиях, С. Определенный срок годности составил 180 суток при 20 С. Результаты исследования стабильности геля (табл. 38) показали, что после хранения качество препарата существенно не изменилось. Гель не поменял органолептические свойства - внешний вид, цвет и запах, не расслоился, легко намазывается и распределяется на деснах, показатель рН изменился незначительно - на 0,1, при этом соответствует установленным требованиям. Содержание полифенольных веществ и хлорогеновой кислоты снизилось незначительно. На основании полученных результатов сделали заключение, что в течение рассчитанного срока годности гель остается стабильным, содержание входящего в его состав комплекса полифенольных веществ снижается незначительно.
Наименование показателя Характеристики и нормы После производства через 45 суток Внешний вид, однородность Однородная масса,не содержит комков,механическихвключений, легконаносится иравномернораспределяется надеснах в полости рта Однородная масса,не содержит комков,механическихвключений, легконаносится иравномернораспределяется надеснах в полости рта Цвет Светло-коричневый Светло-коричневый Запах и вкус Мятный Мятный Водородный показатель (рН) 5,94 5,86 Содержаниеполифенольныхвеществ 0,070% 0,067% Содержаниехлорогеновойкислоты 0,0335% 0,0321% Микробиологическая чистота Присутствие аэробныхбактерий, непревышающее нормыобщей статьи ГФ XI,грибы и патогенныемикроорганизмы необнаружены Присутствие аэробных бактерий,не превышающеенормы общей статьиГФ XI, грибы ипатогенныемикроорганизмы необнаружены
В ходе изучения химического состава листьев черной смородины, а также экстракта на их основе, установили, что доминирующими соединениями полифенольной природы являются гидроксикоричные и гидроксибензойные кислоты, содержание которых может служить показателем качества экстракта и лекарственной формы — геле на его основе.
Результаты проведенного анализа методом ВЭЖХ показали (рис. 29 и 30), что в экстракте листьев черной смородины и в геле на его основе обнаружены идентичные полифенольные соединения, принадлежащие к группе гидроксикоричных и гидроксибензойных кислот, а именно - хлорогеновая и галловая кислоты.
При сравнительном анализе полученных хроматограмм экстракта и геля, представленных на рис. 29 и 30, установили совпадения пиков основных соединений и времени выхода, которое находилось в одном диапазоне цифровых значений.
Остальные полифенольные соединения экстракта при анализе геля обнаружить не удалось, поскольку их содержание и в исходном продукте — экстракте листьев - было незначительным.
По итогам сравнительного анализа экстракта листьев черной смородины и геля на его основе, можно сделать вывод, что гель содержит полифенольные соединения, присущие экстракту для его получения, это свидетельствует об их сохранности и указывает на рациональность выбранной технологии производства геля.
Таким образом разработанная лекарственная форма — гель с сухим экстрактом листьев черной смородины расширяет арсенал средств для лечения заболеваний пародонта, является эффективным и безопасным, обладает высокими противовоспалительными, ранозаживляющими и антимикробными свойствами. Средство насыщает зубы минеральными компонентами, помогает снизить микробную нагрузку на ткани пародонта.
Получение сухих экстрактов из листьев и жома плодов черной смородины
Изучение полифенольных компонентов листьев и жома плодов черной смородины и полученных сухих экстрактов из них продолжили качественным анализом, с целью выявления основных групп полифенольных веществ в исследуемых фитопрепаратах.
Идентификация флавоноидов была проведена по методике ГФ XI (вып.2 п.52). Для этого около 0,05 г сухого экстракта листьев и жома плодов черной смородины растворяли в 100 мл 95 % этилового спирта (исследуемый раствор). К 1 мл исследуемого раствора прибавляли 2 мл 2 % раствора алюминия хлорида в 95 % этаноле и 7 мл 95 % этилового спирта. Раствор окрашивался в желто-зеленый цвет, что является доказательством присутствия флавоноидов в анализируемых экстрактах.
Идентификация фенолокислот была осуществлена с помощью хроматографии на бумаге в системе растворителей н-бутанол — уксусная кислота - вода в соотношении 4:1:2. Для этого по 0,01 г сухого экстракта листьев и жома плодов черной смородины помещали в пробирки, добавляли по 1 мл 70 % этанола, перемешивали до растворения (исследуемые растворы). На бумагу марки "Filtrak" FN 2 наносили по 5 мкл исследуемых растворов, высушивали, хроматографировали восходящим способом. После высушивания хроматограмму осматривали в видимом и ультрафиолетовом свете. В ультрафиолетовом свете фенолокислоты имеют различную флюоресценцию: кофейная и хлорогеновая кислоты - голубую; феруловая — голубо-фиолетовую. После обработки хроматограммы 1 % раствором хлорида железа (III) в метаноле кофейная кислота приобретает серо-зеленую, хлорогеновая — зеленую, феруловая - коричневую окраску.
Идентификация антоцианов. Около 0,05 г экстракта жома плодов черной смородины растворяли в 5 мл 70 % этилового спирта, затем к исследуемому раствору прибавляли: 10 % спиртовой раствор натрия гидроксида. Доказательством присутствия антоцианов в исследуемом растворе стало интенсивное синее окрашивание, при стоянии переходящее в оливково-зеленое. 10 % раствор ацетата свинца, в результате реакции в пробирке выпадал синий аморфный осадок, свидетельствующий о наличии антоцианов в исследуемом растворе.
Идентификация дубильных веществ. Для анализа по 0,05 г экстракта листьев и жома плодов черной смородины растворяли в 5 мл деионизированной воды, к полученным растворам прибавляли по 1 мл 1 % раствора желатина в 10 % растворе натрия хлорида. Выпадавший хлопьевидный осадок свидетельствовал о присутствии дубильных веществ в анализируемых экстрактах [20].
На основании результатов, полученных при проведении качественных реакций (табл. 18), сделали вывод о наличии в листьях черной смородины и их сухом экстракте флавоноидов, феноловых кислот и дубильных веществ; в жоме плодов черной смородины и сухом экстракте на их основе доказали наличие флавоноидов, антоцианов, феноловых кислот и дубильных веществ.
Согласно данным, полученным при анализе экстрактов методом прямой спектрофотометрии, раствор сухого экстракта листьев черной смородины имеет максимум в спектре поглощения при длине волны 269 нм, а раствор сухого экстракта жома плодов — при 282 нм.
Результаты прямого спектрофотометрического анализа сухих экстрактов листьев и жома плодов черной смородины в УФ области спектра Наименование Максимумпоглощения,нм Возможно присутствие Сухой экстракт листьев 210 269333 полифенолов из группы флавоноидов, фенолокислот,дубильных веществ Сухой экстракт жома плодов 205282 338 полифенолов из группы фенолокислот, дубильных веществ, катехинов, флавонолов
Проанализировав спектры поглощения исследуемых растворов сухих экстрактов черной смородины и растворов РСО флавоноидов и фенолокислот, установили, что в спектрах поглощения растворов данных экстрактов имеется максимум поглощения в интервале длин волн 265-290 нм, что характерно для полифенольных соединений из группы гидроксибензойных (галловой) и гидроксикоричных (кофейной, хлорогеновой) кислот, флавоноидов (рутина, кверцетина, катехина и др.).
Определение количественного содержания флавоноидов в сухих экстрактах листьев и жома плодов черной смородины
Методика экстракции. Воздушно-сухое измельченное сырье — листья и жом плодов черной смородины — экстрагировали в соотношении сырье : экстрагент =1:5 при постоянном перемешивании и подогреве (40 С) в течение 2 часов. После охлаждения смесь фильтровали через бумажный фильтр. Полученную вытяжку 48 часов отстаивали в прохладном месте при +8 С, затем фильтровали.
Технологический процесс получения сухих экстрактов продолжался упариванием жидких экстрактов на роторно-вакуумном испарителе при 40 С [5, 79, 96]. Полученный густой экстракт подвергали лиофильной сушке на установке ТГ-15 (Германия). Первой стадией процесса стала заморозка на полках до —25 С, затем следовала сушка при вакууме (100 мкн) и температуре 36 С в течение 24 часов.
Полученные сухие экстракты листьев и жома плодов черной смородины представляли собой порошки желто-коричневого и темно-коричневого цвета соответственно, с приятным запахом и вяжущим вкусом, хорошо растворимые в воде и этиловом спирте.
Согласно требованиям статьи "Экстракты" ГФ в полученных сухих экстрактах определяли влагу и содержание тяжелых металлов (табл. 16). Определение осуществляли по методикам, изложенным в ГФ XI издания.
Результаты определения влаги и тяжёлых металлов в сухих экстрактах листьев и жома плодов черной смородины Наименование экстракта Содержание влаги,% Содержание тяжелых металлов,% Сухой экстракт листьев 2,34+0,03 менее 0,01 Сухой экстракт жома плодов 3,09±0,03 менее 0,01 К тому же согласно требованиям фармакопейной статьи "Экстракты" необходимо провести стандартизацию полученных экстрактов из листьев и жома плодов черной смородины по показателю "количественное содержание действующих веществ". Установление основной группы полифенольных веществ, разработка методики определения их количественного содержания и является задачей данного исследования.
Несмотря на широкое применение листьев и плодов черной смородины в народной и официальной медицине как поливитаминного сырья, в настоящее время в ГФ XI издания отсутствуют частные или временные статьи на лист и жом черной смородины, получаемый после отжима сока из плодов. При этом качество плодов черной смородины регламентируется только ГОСТом 21450-75. В связи с этим, важным этапом изучения данного сырья является разработка нормативно-технической документации.
С целью разработки характеристик подлинности сырья и контроля его качества провели макроскопическое изучение листьев и жома плодов черной смородины, а также определили основные числовые показатели [75].
Описали внешние признаки листьев и жома плодов черной смородины: Цельное сырье. Листья цельные или частично измельченные, простые, черешковые, крупные, длиной до 8 см и шириной до 6 см, трех-пятилопастные, края грубопильчатые с изогнутыми к вершине зубцами. Поверхность голая, морщинистая; снизу по всей пластинке листа заметны железки. Черешки листьев длиной 4-5 см, округлые или полукруглые в сечении, с бороздкой на верхней стороне черешка. Цвет листьев и черешков — зеленый. Запах ароматный. Измельченное сырье. Кусочки листьев различной формы, проходящие сквозь сито с отверстиями диаметром 7 мм. Цвет зеленый. Запах ароматный.
Жом плодов черной смородины является порошком буро-красного цвета, проходящим сквозь сито с диаметром отверстий 3 мм. Запах своеобразный, сладковатый. Вкус кисло-сладкий.
Поскольку при заготовке жома плодов в него попадают некоторые фрагменты других частей растения (веточек, плодоножек) целесообразно нормировать количество данных примесей. При этом для второго вида сырья необходимо установить допустимые значения пожелтевших и побуревших листьев.
Частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 3 мм 1,83 3,00 - Частиц, не проходящих сквозь сито с отверстиямидиаметром 3 мм - - 2,79 3,00 В ходе проведенного анализа изучили морфологические особенности листьев и жома плодов черной смородины, как источника полифенольных соединений. К тому же определили основные числовые значения - влажность, зола общая, зола, нерастворимая в 10 % растворе хлористоводородной кислоты, другие части растения, пожелтевшие листья, содержание частиц, не проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 3 мм (для жома плодов) и содержание частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 3 мм (для листьев). Установили нормы числовых показателей.
Руководствуясь методиками ГФ XI издания по проведению микроскопического исследования листьев, изучали анатомическое строение листьев черной смородины с последующим фотографированием.
При рассмотрении под микроскопом видна поверхность верхнего эпидермиса, которая представлена многоугольными, сильноизвилистыми клетками, с утолщенными стенками. Сквозь эпидермис просматривается палисадная паренхима (рис. 4). По краям лопастей встречаются крупные водяные устьица.
Клетки нижнего эпидермиса более маленькие, тонкостенные и менее извилистые (рис. 5). Хорошо видны одноклеточные волоски, расположенные в основном по жилкам, имеются щитковидные железки, заполненные маслом. На нижней стороне листа много устьиц, окруженных 4-6 клетками эпидермиса (аномоцитный тип) (рис. 6). В жилках под эпидермисом находится слой паренхимы, клетки которой заполнены друзами, образующие цепочки.
