Содержание к диссертации
Введение
Глава I Обзор литературы 10-49
1.1. Гликозаминогликаны, их строение и использование в медицинской практике
1.2. Хондроитинсульфат натрия. Методы его анализа 21-48
Выводы из главы 1 48-49
Глава II. Объекты исследования, используемое в работе оборудование и анализ требований фармакопеи к качеству хондроитин-сульфата натрия 50-65
2.1. Объекты исследования 50
2.2. Используемое оборудование и методики анализа 52
2.2.1. Используемое оборудование 52
2.2.2. Используемые методики анализа 54
2.3. Сравнительные требования фармакопейных статей к качеству хондроитинсульфата натрия 58
Выводы из главы II 65
Глава III. Оценка качества хондроитинсульфата натрия по внешнему виду и растворимости 66-69
Выводы из главы III 69
Глава IV. Подтверждение подлинности хондроитинсульфата натрия
4.1 .ИК-спектроскопия 70
4.2. Поляриметрия 80
4.3. Вискозиметрия 81
4.4. Гравиметрический метод (Определение серы) 88
4.5. Электрофорез 89
4.6. Качественные реакции 96
4.6.1. Уроновые кислоты 96
4.6.2. Натрий 97
Выводы из главы IV 97-98
Глава V. Показатели чистоты 99-111
5.1. Азотсодержащие примеси (белок, азот) 99
5.2. Сульфатная зола 102
5.3. Тяжелые металлы 102
5.4. рН растворов, Сульфаты, Хлориды 103
5.5. Прозрачность и цветность растворов 105
5.6. Потеря в массе при высушивании 107
5.7. Остаточные органические растворители 107
5.8. Посторонние примеси 110
Выводы из главы V 111
VI. Количественное определение хондроитинсульфата натрия 112-120
Выводы из главы VI 119-120
VII. ИК-спектроскопия НПВО в лекарственных формах на основе хондроитинсульфата натрия
Выводы из главы VII 127
Общие выводы 128-129
Список литературы
- Хондроитинсульфат натрия. Методы его анализа
- Используемое оборудование и методики анализа
- Гравиметрический метод (Определение серы)
- рН растворов, Сульфаты, Хлориды
Введение к работе
Актуальность исследования
Создание качественных, эффективных и безопасных лекарственных средств - основная задача фармации, и в условиях современного развития мировой экономики одним из направлений решения указанной задачи является гармонизация требований фармакопеи к качеству субстанций и лекарственных препаратов.
Хондроитинсульфат натрия (ХСН), представитель группы гликозами-ногликанов, широко используется для лечения различных видов остеоартроза и остеохондрозов позвоночника. Его источником являются, хрящевая ткань крупного рогатого^ скота (КРС), свиней, а также куриный и акулий хрящи. В медицинской практике ХСН применяют в виде таблеток, капсул, мазей, линиментов, растворов .и лиофилизированных форм. На территории Российской Федерации зарегистрировано около 65 наименований препаратов на его основе.
Монографии на XCHf включены в ведущие зарубежные фармакопеи (с 2002 г. в USP и с 2006 г. в Eur.Ph., Br.Ph.). В России с 1996-г. осуществляется выпуск ХСН из трахей КРС, контроль его качества проводился по ФС 42-3741-99, срок действия' которой истёк, и согласно частным НД фирм-производителей. Сравнительный анализ отечественных и зарубежных фармакопейных статей показал, что в них указаны разные источники получения ХСН, и они различаются по показателям качества, методикам анализа, нормам допустимых отклонений и нуждаются в гармонизации.
Таким образом, разработка фармакопейного стандарта качества на субстанцию ХСН, гармонизированного с требованиями зарубежных фармакопеи, является актуальной проблемой отечественной фармацевтической науки на современном этапе ее развития.
Цель работы, основные задачи исследования
Целью настоящего исследования является разработка стандарта качества на субстанцию ХСН, гармонизированного с требованиями зарубежных
-7-фармакопей. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
провести сравнительный анализ уровня требований отечественных и зарубежных нормативных документов к качеству субстанций ХСН;
изучить требования фармакопеи и фактические данные по внешнему виду и растворимости ХСН;
изучить методы и методики анализа, используемые для подтверждения подлинности, определения чистоты и выбрать оптимальные;
провести сравнительный анализ фармакопейных методик количественного определения ХСН с помощью процедуры валидации;
изучить возможность использования ИК спектроскопии нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО) в анализе субстанций ХСН и его лекарственных форм.
Научная новизна исследования
Проведено изучение ХСН из разных источников - хрящевой ткани наземных животных и акул с учетом современных требований фармацевтической науки.
Впервые использована ИК-спектроскопия НПВО для идентификации разных типов гликозаминогликанов, в том числе ХСН из разных источников, а также ХСН в ряде его лекарственных форм. Изучены спектральные характеристики ХСН из хрящей КРС, свиней, птиц и акул в ближней ИК-области.
На основе анализа свойств ХСН было предложено для подтверждения его подлинности использовать комплекс методов: анализ функциональных групп и связанных сульфатов (ИК-спектроскопия), натрия (реакция с калия антимонатом), определение молекулярной массы (вискозиметрия), электро-форетической подвижности (электрофорез в геле), оптического вращения (по ляриметрия).
В проект ФС для характеристики чистоты субстанций ХСН введены новые показатели: свободные сульфаты и хлориды, содержание белка и примеси родственных соединений.
С помощью процедуры валидации установлено, что спектрофотомет-рическая методика количественного определения ХСН по методу Дише (ФС), и турбидиметрическая методика титрования раствором цетилпириди-ния хлорида (Br.Ph., Eur.Ph., USP) не являются гармонизированными.
Показана применимость отечественного государственного стандартного образца (ГСО) для количественного определения ХСН методом турбиди-метрического титрования.
Практическая значимость исследования
Показана возможность применения метода ИК-спектроскопии НПВО для подтверждения подлинности ХСН из различных источников и в его лекарственных формах — капсулах и лиофилизатах для приготовления растворов для внутримышечного введения. Разработанные на основе НПВО методики анализа ХСН являются экспрессными, объективными и экономичными по сравнению с используемой в настоящее время методикой ИК-спектроскопии пропускания в дисках калия бромида.
С помощью процедуры валидации проведён выбор метода количественного определения ХСН и установлена применимость отечественного стандартного образца для количественного определения методом турбиди-метрического титрования раствором цетилпиридиния хлорида.
На основании проведенных исследований составлен проект ФС «Хон-дроитинсульфат натрия» для ГФ XII изд., гармонизированный с требованиями зарубежных фармакопеи.
Положения, выносимые на защиту:
Результаты исследований ХСН из различных источников по внешнему виду и растворимости.
Выбор методик подтверждения подлинности ХСН.
Результаты исследований по использованию метода НПВО для подтверждения подлинности ХСН в субстанциях и в ряде лекарственных форм на его основе.
Результаты сравнения и выбора* методик определения чистоты субстанций ХСН, в том числе, результаты исследования примесей родственных гликозаминогликанов в субстанциях ХСН с помощью электрофоретических методов (электрофорез в агарозном геле, на плёнках из ацетата целлюлозы, капиллярный электрофорез) и определения содержания белка в образцах ХСН.
Результаты сравнения методик количественного определения ХСН с использованием процедуры валидации.
6. Результаты исследований применимости отечественного ГСО ХСН
для количественного определения методом турбидиметрического титрова
ния.
Апробация работы
Основные положения диссертации доложены на научной конференции ПГФА (Пятигорск, 2007 г.), научно-практической' конференции ФГУ «НЦЭСМП» «Современные методы стандартизации и<контроля качества лекарственных средств» (Москва, 2006г.), научной конференции'ИСКЛС ФГУ «НЦЭСМП» (Москва, 2006 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ, из них 1 - в журнале, рекомендованном ВАК.
Связь исследований с проблемным планом'фармацевтических наук. Диссертация выполнена в соответствии с комплексной темой ИКЛС ФГУ «НЦЭСМП» «Разработка принципов и методов контроля* различных групп биотехнологических препаратов».
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста (без приложения), состоит из введения, обзора литературы, 7 глав экспериментальной части, общих выводов, списка литературы, приложения. Диссертационная работа проиллюстрирована 10 таблицами, 1 схемой и 44 рисунками. Список литературы включает 178 источник, в том числе 44 отечественных и 134 на иностранном языке.
Хондроитинсульфат натрия. Методы его анализа
Хондроитинсульфат, природный высокомолекулярный полисахарид, является естественным компонентом хряща и играет биологически активную роль во многих процессах метаболизма его различных структур. Его роль заключается в выполнении опорной функции костной и хрящевой ткани. Он замедляет резорбцию костной ткани, снижает потерю кальция, улучшает фосфорно-кальциевый обмен в хрящевой ткани, ускоряет процессы ее восстановления, тормозит процессы разрушения хрящевой и соединительной ткани. ХС ингибирует ферменты, вызывающие поражение хрящевой ткани, стимулирует синтез ГАГ, увеличивает продуцирование внутрисуставной жидкости [14, 15, 17, 25, 48, 50, 120]. Его введение лабораторным животным в низких дозах приводит к уменьшению признаков воспаления в суставах, подавлению синтеза антител к коллагену типа II, а в высоких дозах (1000 мг/кг) — к подавлению деструкции хряща [120]. Отмечено его влияние (ин-гибирование) на активность металлопротеиназ [134], вызывающих деградацию хрящевой ткани (Схема 1). При приёме ХС увеличивается подвижность пораженных суставов и уменьшается болезненность. Помимо этого существуют данные, что экзогенное введение ХС ингибирует образование IgE, и, таким образом, позволяет уменьшить аллергический ответ организма [132].
В силу перечисленных свойств экзогенное поступление ХСН позволяет уменьшать деструктивные процессы в хряще и основными показаниями к применению лекарственных средств на основе ХСН являются дегенератив ные заболевания суставов и позвоночника [1, 2, 17, 34, 50, 100, 103, 112, 135, 151, 164].
Биодоступность при пероральном введении для ХСН по разным данным составляет от 8 до 13 % [17, 45-46, 65-66, 88, 121, 124, 136, 160, 161]. Обладая высокой тропностью к хрящу, ХСН накапливается, в основном, в хрящевой ткани (максимальная концентрация в суставном хряще достигается через 48 час), синовиальная оболочка не является препятствием для его проникновения в полость сустава. Выводится ХСН почками в течение 24 час. Время полувыведения Т1/2 составляет порядка 310 мин [17, 65-66]. ХСН не токсичен [89].
Линейная цепь ХСН построена, в основном, из чередующихся остатков P-D-глюкуроновой кислоты и 2-ацетамидо-2-дезокси-Б-галактозамина, которые попарно соединены Р-1,3-гликозидными связями и образуют дисахарид-ные фрагменты, связанные Р -1,4-гликозидными связями (рис.3). Одна поли-сахаридная цепь ХС содержит около 40 повторяющихся дисахаридных единиц [25].
В организме человека встречаются, главным образом, два изомера ХС: ХС-4-сульфат и ХС-6-сульфат. Они построены одинаковым образом, отличие касается только положения сульфатной группы в молекуле N-ацетилгалактозаминаі ХС типа А содержит, преимущественно, ХС-4-сульфат, а ХС типа С — в основном, ХС-б-сульфат. Описаны также ХС типа Д иЕ[140].
К ХС относили и ДС (так называемый ХС типа В). Он тоже содержит сульфогруппу у С-4 молекулы N-ацетилгалактозамина, но в отличие от ХС типа А имеет остатки a-L-идуроновой кислоты (лишь в малых количествах D-глюкуроновую кислоту). К действию гиалуронидаз (тестикулярной и бактериальной) он резистентен. В этом еще одно его отличие от ХС, поэтому его нельзя рассматривать в качестве истинного ХС.
ХС относится к гетерополисахаридам, т.к. содержит дисахаридные единицы с разным количеством и положением сульфатных группировок. Ос -новные изомеры ХС-4 и ХС-6 сами гетерогенны по, структуре. Внутри их цепей часто присутствуют дисахаридные субъединицы, в которых сульфатная группа либо отсутствует совсем, либо занимает несвойственное для данного ГАГ положение при 2, 4 или 6 атомах углерода (рис.4); молекула диса-харида может быть гиперсульфатирована сразу в двух или трех положениях [60,87,91,117].
Эта биохимическая вариабельность строения позволяет данным молекулам иметь различную молекулярную массу и плотность заряда на своей поверхности, что и определяет многочисленные свойства ХС [48, 61, 63, 120, 137, 158].
Сульфатные группы молекул ХС вносят определенный вклад в терапевтический эффект при дегенеративных изменениях суставов. Исследования влияния низких концентраций сульфата на синтез ГАГ в надколенном хряще крысы in vivo и in vitro показали, что уменьшение концентрации сульфата приводило к уменьшению синтеза ГАГ в надколенном хряще [14, 54, 96, 99].
ХС обычно встречаются только в связанном с белками виде и входят в состав протеогликанов. Протеогликаны - это группа углевод-белковых биополимеров, в которых преобладает доля углеводного компонента [90, 123]. Свойства протеогликанов, главным образом, определяются полисахаридны ми составляющими. Основным типом связей между полисахаридной и полипептидной цепями служит О-гликозидная связь. В состав протеогликанов входят ХС, ГС, ДС и КС. Гепарин в тканях организма не связан с белком.
Мономер протеогликана хряща [18] состоит из 50-60 цепей и 100 цепей ХС, которые ковалентно связаны с коровым (сердцевинным) белком. Мономеры протеогликана несут большой отрицательный заряд и являются основными блоками для построения как минимум двух видов белково-полисахаридных комплексов хрящевого матрикса.
Используемое оборудование и методики анализа
Методика проведения электрофореза на плёнках из ацетата целлюлозы: Испытуемый раствор. 150 мг субстанции помещают в мерную колбу вместимостью 5 мл, растворяют в воде, доводят водой до метки и перемешивают.
Стандартный раствор. 150 мг стандартного образца хондроитинсуль-фата натрия помещают в мерную колбу вместимостью 5 мл, растворяют в воде, доводят водой до метки и перемешивают. ? г і О\1 М буферный раствор барияацетата, рНг 5,0. 25,54; F бария ацетата растворяют в 900 мл воды. Доводят рН до 5,0 с.помощью ледяной уксусной кислоты и доводят объём раствора водой до 1000 мл.
Заполняли камеры для электрофореза 0,1 М буферным раствором бария ацетата, рН 5,0. Замачивали ацетатно-целлюлозные плёнки (5-6 см х 10-12 см) в 0,1 М буферном растворе бария ацетата; рН 5,0 в течение 10 минут до равномерного пропитывания, затем промокали между двумя листами фильтровальной бумаги. Вблизи катода наносили по 0,5 мкл испытуемого и стандартного растворов на более светлую сторону плёнки. Прикладывали напряжение 250 вольт (электрический ток 7 мА на старте) в течение 2 часов.
Окрашивание пленок проводили 0,1 % раствором толуидинового синего в уксусной кислоте в течение 5 минут, затем пленки просветляли 5 % раствором, уксусной кислоты до обесцвечивания фона. Документировали результаты в течение 30 мин после завершения процедуры.
Методика проведения электрофореза в агарозном геле: Испытуемый, стандартный растворы и ОД М раствор бария ацетата-, рН 5,0 готовили, как описано выше. М буферный раствор бария ацетата, рН 5,0. 255,4 г бария ацетата растворяют в 900 мл воды. Доводят рН:до 5,0 с помощью ледяной уксусной кислоты и доводят объём раствора водой до 1000 мл..
Окрашивающий раствор. 1,0 г толуидинового синего и 2,0 г натрия хлорида растворяют в 1000 мл раствора 0,0 Г М хлористоводородной кислоты. Фильтруют.
ОД г агарозы (для электрофореза) растворяли в 20 мл 0,1 М буферного раствора бария ацетата, рН 5,0, нагревали на водяной бане до набухания, перемешивали. Полученную смесь в горячем виде выливали в форму размером 10x10 мм для получения, слоя агарозы около 3 мм и оставляли стоять в горизонтальном положении. Высушивали гель в течение 30 мин. Помещали по 400 мл 1 М буферного раствора бария ацетата, рН 5,0 в каждую камеру для электрофореза: Наносили по 1 мюг каждого раствора в канавки агарозного геля. На охлажденный столик прибора для электрофореза наносили несколько капель 50 % раствора глицерина И помещали пластину с гелем в середину столика.
Для приготовления агарозных мостков один конец фильтровальной бумаги (размером 5x1,5 см) помещали в раствор электролита, другой конец — на пластину с агарозой, смоченной раствором электролита. Пропускали электрический ток 75 mA/гель при разности потенциалов 100-150 (максимум 300-400 В) в течение 20 мин. Помещали гель в-смесь, состоящую из 10 объемов абсолютного спирта и 90 объемов 0,1 М буферного-раствора бария ацетата, рН 5,0 на 2 мин. Затем проводили электрофорез в течение 1 часа в тех же условиях. Помещали гель в смесь, состоящую из 30 объемов абсолютного спирта и 70 объемов 0,1 М буферного раствора бария ацетата, рН 5,0 на 2 мин. Проводили электрофорез в течение 1 часа в тех же условиях.
Окрашивание геля проводили 0,1 % раствором толуидинового синего в 0,01 М растворе хлористоводородной кислоты в течение 10 мин. Обесцвечивали гель в течение 15 мин в токе воды, затем в дистиллированной воде. Давали гелю высохнуть в течение 30 мин. Условия проведения исследований методом капиллярного электрофореза: Внутренний диаметр кварцевого капилляра 50,0 мкм; Длина капилляра - 64,5 см; Эффективная длина капилляра - 56,0 см; Полярность - отрицательная; Приложенное напряжение 30 кВ или 20 кВ; Время ввода— 10 сек или 20 сек при давлении 50 мбар; Длина волны детектирования 192 нм; Температура — 30 С; 36 мМ фосфатный буфер (рН 3,5); Исходные концентрации растворов - 10 мг/мл; Время разделения - 30 или 40 мин. Методика определения содержания серы (гравиметрический метод).
Предварительно проводили гидролиз субстанции в 6 М растворе хлористоводородной кислоты в кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 2 час, после охлаждения раствор фильтровали, промывали горячей водой до установления рН 6,0 в промывной жидкости. Фильтрат нагревали, смешивали с подогретым до 95 С 0,1 М раствором бария хлорида и отстаивали в течение 18-20 часов. Выпавший осадок бария сульфата собирали на фильтре с синей полосой, высушивали, сжигали в тигле, прокаливали в муфельной печи при температуре 600-700 С до постоянной массы и определяли остаток после прокаливания.
Гравиметрический метод (Определение серы)
Как уже отмечено в главе 1, ХСН-4 и ХСН-6 состоят из эквимолярных количеств D-глюкуроновой кислоты, ІчТ-ацетил-Б-галактозамина. Структуры их дисахаридных единиц различаются только по положению сульфатных остатков. Субстанция ХСН может также содержать в своем составе не только моносульфатированные дисахаридные единицы, но и несульфатированные и дисульфатированные. Что касается других типов гликозаминогликанов, гепарин содержит в молекуле большее количество сульфатных группировок по сравнению с ХСН, а гиалуроновая кислота является несульфатированным ГАГ. Вследствие этого, количество связанных с молекулой ХСН сульфатов, также является его специфической характеристикой.
В ФС и в зарегистрированных НД на ХСН (ОАО «Синтез», г.Курган, Россия; «Синтекс С.А.», Аргентина; «Нью Зеланд Фармасьютикалз Лтд», Новая Зеландия; «Биоиберика С.А.», Испания) предложено нормировать содержание серы в субстанции ( не более 7,5 %). Для определения серы используют гравиметрический метод, основанный на осаждении сульфат-ионов в виде сульфата бария после разрушения органического вещества.
Во всех испытуемых образцах определённое нами содержание серы укладывалось в нормы, указанные в нормативных документах, и составляло для ХСН: из хрящей акулы - 6,6; из трахей КРС - 5,5-6,5; из хряща свиньи - 5,7; из куриного хряща - 5,1.
Более высокое содержание связанных сульфатов в ХСН из акульего хряща согласуется с данными литературы, что в своем составе он содержит около 10 % дисульфатированных дисахаридных единиц [63].
ХСН содержит в своём составе карбоксильные и сульфатные группировки, поэтому он несёт на своей поверхности отрицательный заряд, что даёт возможность использовать методы электрофореза для подтверждения его подлинности, оценки гомогенности субстанции и обнаружения родственных соединений. Как было показано в главе 1 дисахаридные единицы разных ГАГ сульфатированы- в разной степени и отличаются по количеству заряженных групп на молекулу, поэтому они будут различаться и по электрофоретиче-ской подвижности.
Следует отметить, что ширина электрофоретической зоны может служить мерой гетерогенности субстанции.
В зарубежных фармакопеях при проведении электрофореза используются различные системы, как уже было отмечено в главе 2.3. Электрофорез проводят на пластинках из ацетата целлюлозы (USP) или в агарозном геле (Br.Ph, Eur.Ph.). Идентификацию проводят по отношению к стандартному образцу ХСН, обладающему сходной подвижностью в электрическом поле.
Основная полоса на электрофореграмме раствора препарата должна соответствовать по положению основной полосе на электрофореграмме стандартного раствора ХСН.
Нами исследованы образцы ХСН в обеих системах, описанных в фармакопеях. В обоих случаях при электрофоретическом исследовании все исследуемые образцы ХСН имели одинаковую подвижность: пятна на электрофо-реграммах находились на одном уровне (рис. 23 и 24).
В агарозном геле исследование проведено в двух различных системах растворителей: в 1 М бария ацетатном буфере, рН 5 (Br.Ph, Eur.Ph.) и ацетат-но-литиевом буферном растворе (рН 3,0): В первом случае дополнительно в ходе электрофореза проводилось осаждение мигрирующих ГАГ различными концентрациями спирта. В фармакопеях используется готовый гель и отсутствовало значение его концентрации.
При проведении электрофореза в условиях, описанных в Br.Ph, Eur.Ph., концентрация геля (0,5 %) была выбрана, исходя из литературных данных.. Экспериментально установлено, что для лучшего разделения ГАГ следует увеличить время проведения электрофореза (рис. 23). Вместо указанного в Br.Ph. и Eur.Ph. времени проведения второго и третьего этапа (20 мин) электрофорез проводили каждый раз в течение часа. Остальные условия проведения электрофореза (концентрации используемых растворов, величины приложенного напряжения и сила тока на старте) не менялись.
рН растворов, Сульфаты, Хлориды
Сравнительный анализ фармакопеи показал, что существуют две методики количественного определения ХСН.
Методика 1 ГФС"). Около 0,05 г (точная навеска) препарата помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в воде, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. 0,15 мл полученного раствора переносят в пробирку вместимостью 10 мл с притертой пробкой, прибавляют 0,85 мл воды, смешивают с 6 мл серной кислоты концентрированной, охлаждают в бане с ледяной водой. Пробирки помещают на кипящую водяную баню. Точно через 20 мин раствор охлаждают до комнатной температуры в бане с холодной водой, прибавляют 0,2 мл 0,1 % спиртового раствора карбазо-ла и перемешивают. Через 2 ч измеряют оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре в кювете с толщиной слоя 10 мм при длине волны 530 нм, используя в качестве раствора сравнения контрольный раствор.
Параллельно проводят измерение раствора ГСО ХСН, полученного аналогичным образом. Для приготовления контрольного раствора в пробирку с притертой пробкой помещают 1 мл воды и 6 мл кислоты серной концентрированной, охлаждают. Далее проводят определение как описано выше.
Для приготовления раствора СО ХСН около 0,050 г (точная навеска) ГСО ХСН (ФС 42-0180-06) помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в небольшом объеме воды, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают.
Методика 1 основана на кислотном гидролизе ХСН и последующем спектрофотометрическом определении его по уроновым кислотам (метод Дише), входящим в состав дисахаридной единицы ХСН, по отношению к со -113-держанию уроновых кислот в ГСОХСН, принимаемом за 100 % [ГФ"Х1 изд.].
Методика 2 ("Eur.Ph. и Вг.РЮ. Около 0,050 г (точная навеска) высушенного до постоянной массы образца помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в воде и доводят объем раствора до метки. В коническую колбу вместимостью 50 мл помещают 20 мл раствора и титруют 0,4 % раствором цетилпиридиния хлорида при интенсивном перемешивании до образования крупных белых хлопьев (при этом раствор становится прозрачным).
Параллельно проводят титрование раствора СО ХСН (1 мг/мл). В качестве СО использовался FCO ХСН, указанный в методике 1.
Для приготовления 0,4 % раствор цетилпиридиния хлорида 4,0? г цетилпиридиния хлорида моногидрата (Merck 840008, Fluka 52349 или аналогичного качества) помещают в мерную колбу на 1000мл, добавляют 600 мл воды, перемешивают и доводят объём до метки водой.
Методика 2, турбидиметрическое титрование; основана на способности ХСН образовывать с ЦПХ нерастворимую в воде ионную пару.
Предварительное исследование методики 2 показало, что на результат анализа влияет скорость титрования, особенно в области более низких концентраций ХСН: при уменьшении скорости титрования (не выше 0,4 мл/мин) образуются более крупные конгломераты, которые легче регистрировать. Данный подход позволил уменьшить относительную ошибку определения с 4 % до 2 %.
Возможными причинами возникновения систематической ошибки в методике 2 также могут являться недостаточная точность взвешивания вследствие высокой гигроскопичности ХСН при приготовлении исходных растворов. Чтобы оценить вероятность возникновения систематической ошибки, связанной с взвешиванием, было проведено титрование растворов ХСН, полученных с использованием увеличенных вдвое навесок. Установлено, что тенденция завышения результатов при более низких концентрациях сохраняется и в этих условиях. Уменьшения относительной.ошибки определения достичь не удалось.
Краситель метиленовый синий, включенный в Eur.Ph. и Br.Ph. для улучшения визуализации образующихся хлопьев, нами не использовался, так как существенной разницы в результатах с использованием и без использования красителя не отмечено.
Для решения вопроса включения методики количественного определения в проект ФС необходимо установить, являются ли они гармонизированными.
Для сравнения методик был использован методологический подход, в основе которого лежит процедура валидации аналитических методик [3, 37, 154]. С этой целью был проведен трёхуровневый эксперимент по три опыта на каждом уровне. Диапазон измерений был выбран, исходя из варьирования навески вещества (табл. 9).
