Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Гепатит Е этиология, патогенез, клиника и лабораторная диагностика . 12-30 стр.
1.1.Этиология гепатита Е.
1.2. Патогенез гепатита Е.
1.3. Лабораторный диагноз ГЕ и серо-распространенность анти-ВГЕ .
ГЛАВА 2. Особенности эпидемиологии гепатита Е. 30-52 стр.
ГЛАВА 3. ВГЕ у животных. 52 - 60 стр.
ГЛАВА 4. Материалы и методы 60 - 63 стр.
ГЛАВА 5. Оценка методов выявления маркеров инфицирования вирусом гепатита Е (анти-ВГЕ и РНК ВГЕ) и обнаружение случаев завоза гепатита Е из эндемичных регионов мира по этой инфекции в Россию . 64 - 77 стр.
ГЛАВА 6. Определение частоты в различных группах населения . 78 - 89 стр.
6.1. Определение частоты выявления анти-ВГЕ в различных группах населения («здоровое» население Тывы и Армении; беременные женщины проживающие в г. Москве, Россия и г. Эль-Мансура и его окрестностях, Египет). 78 - 82 стр.
6.2. Определение частоты выявления анти-ВГЕ, среди солдат проходивших и не проходивших службу в Республике Афганистан 14-18 лет тому назад . 82 - 89 стр.
ГЛАВА 7. Частота выявления антител к вирусу гепатита Е у свиней и кур, обитающих на территориях неэндемичных по этой инфекции . 90-91 стр.
Обсуждение 91 -107 стр.
Выводы 107-108 стр.
Список литературы. 109 - 134 стр.
- Лабораторный диагноз ГЕ и серо-распространенность анти-ВГЕ
- Оценка методов выявления маркеров инфицирования вирусом гепатита Е (анти-ВГЕ и РНК ВГЕ) и обнаружение случаев завоза гепатита Е из эндемичных регионов мира по этой инфекции в Россию
- Определение частоты выявления анти-ВГЕ в различных группах населения («здоровое» население Тывы и Армении; беременные женщины проживающие в г. Москве, Россия и г. Эль-Мансура и его окрестностях, Египет).
- Определение частоты выявления анти-ВГЕ, среди солдат проходивших и не проходивших службу в Республике Афганистан 14-18 лет тому назад
Введение к работе
Вирус гепатита Е (ВГЕ) был идентифицирован М.С. Балаяном в 1983 году при проведении эксперимента по самозаражению себя материалом, полученным от больных с диагнозом гепатит «ни-А, ни-В».
Клинически гепатит Е (ГЕ) подобен гепатиту А. Вместе с тем считается, что ГЕ несколько чаще протекает тяжелей чем гепатит А. Летальность от гепатита Е достигает 1%. Характерной чертой гепатита Е считается высокая летальность (до 40 %) среди беременных женщинах, заразившихся гепатитом Е в третьем триместре беременности. Причина столь частого летального исхода среди беременных не выяснена (Myint Н. с соавт., 1985; Emerson S. с соавт., 2001; Purcell Н., 2003).
ГЕ широко распространен в странах тропического и субтропического пояса. Стойкие очаги ГЕ также находятся и на территории Средне-Азиатских республик бывшего СССР и в северных районах Китая. В этих районах регистрируются крупные эпидемические вспышкки ГЕ и многочисленные спорадические случаи заболевания. Территории, где отсутствует эпидемическая заболеваемость ГЕ, считаются неэндемичными. Территория Российской Федерации неэндемична по ГЕ (Балаян М.С, 1998; Шахгильдян И.В. 2001).
По данным Tandon B.N., с соавт. (1984); Skidmore S.J., с соавт. (1991) и
Johansson P.J., с соавт. (1991) известно, что инфекция вызываемая ВГЕ
завозится в страны Северной Америки и Европы из эндемичных районов мира.
Случаи ГЕ в окружении больного а также и тем более вспышки заболевания не
регистрируются. Вместе с тем, в последнее время появились сообщения, что у
населения неэндемичных по ГЕ территориях удается обнаружить антитела к
ВГЕ. Эпидемиологические исследования среди лиц с анти-ВГЕ
свидетельствует о том, что большинство таких лиц никогда не выезжали в эндемичные по ГЕ районы мира.
Разработка диагностических препаратов для выявления антител к ВГЕ
(класса IgM и IgG) определило прогресс в изучении эпидемиологии гепатита Е.
При их конструировании применяют антигены полученные при помощи
рекомбинантной технологии и химическим синтезом. Данные о
продолжительности циркуляции анти-ВГЕ, представленных
иммуноглобулинами классов М и G, противоречивы. Имеются некоторые свидетельства, что антитела к вирусу гепатита Е не столь длительно присутствуют, как антитела к вирусу гепатита A (Purcell Н., 2003).
Исследования, посвященные выявлению антител к ВГЕ среди различных
групп населения России (М.С. Балаян, О.Е. Федорова, М.О. Фаворов, М.И.
Михайлов, С.Н. Кузин, 1992-2003), продемонстрировали, наличие серо-
позитивных лиц. Вместе с тем, нуждаются в уточнении данные о
территориальном их распространении в том числе у проживающих в Тыве и
Армении. Отсутствует информация о уровне выявления анти-ВГЕ среди среди
ветеранов Советской Армии, принимавших участие в боевых действиях в
Республике Афганистан (эндемичном регионе по ГЕ).
Одним из возможных объяснений наличия анти-ВГЕ у лиц, проживающих в неэндемичных по ГЕ регионах, может быть их возможное заражение от животных, у которых выявляются маркеры ВГЕ. Предположение что ВГЕ инфекция, может быть, зоонозом было впервые высказано М.С.Балаяном, а позже подкреплено данными по обнаружению ВГЕ и анти-ВГЕ у различных птиц и животных (куры, свиньи, кошки и др.). Маркеры инфицирования ВГЕ были выявлены у животных в различных странах (США, Китай, Индия, Голландия, Германия и др.). На территории России сведения о наличии маркеров инфицирования ВГЕ у животных крайне ограничены, что определяет важность проведения этих исследований.
Цель и задачи работы
Цель работы - определение широты распространения гепатита Е и оценка напряженности постинфекционного иммунитета среди населения неэндемичных (Россия) и эндемичных (Египет) по гепатиту Е регионах мира.
Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
Оценить коммерческие диагностические препараты (производства фирм: «Диагностические тест системы» Нижний Новгород и "Абботт") для выявления анти-ВГЕ (класса IgM и IgG) в иммуноферментном методе.
Изучить вероятность случаев завоза гепатита Е из эндемичных регионов мира по этой инфекции в Россию, на основании этиологической расшифровки «недифференцированных гепатитов».
Определить частоту обнаружения анти-ВГЕ в различных группах населения:
-у «здорового» населения Тывы и Армении.
-у беременных женщин проживающих в г. Москве (Россия) и г.Эль-Мансура (Египет)
Установить длительность сохранения антител к вирусу гепатита Е после перенесенной инфекции среди лиц, проживающих в неэндемичных регионах мира.
Определить частоту выявления антител к вирусу гепатита Е среди животных и птиц (свиней и кур), как возможных резервуаров вируса гепатита Е на территориях, неэндемичных по этой инфекции.
Научная новизна
1. Выявлены случаи завоза на территорию России гепатита Е из эндемичных регионов мира по этой инфекции. Проведена этиологическая расшифровка случаев гепатита Е (на основании выявления анти-ВГЕ классов IgM и IgG, а так же РНК ВГЕ) у пациентов, прибывших из Китая и Индии и
госпитализированных в 1-ю инфекционную больницу г. Москвы.
Впервые получены данные о частоте выявления анти-ВГЕ среди беременных женщин России (г. Москва) и Египта (дельта реки Нил). Анти-ВГЕ обнаружены в 1,2% и 61 % случаев соответственно. Анти-ВГЕ класса IgM в сыворотках крови беременных, которые содержали анти-ВГЕ класса Ig G, не были обнаружены.
Впервые определена частота выявления анти-ВГЕ среди жителей Республик Тыва (1,7%) и Армения (0,8%). Эти данные позволили отнести Республики Тыва и Армении к неэндемичным по гепатиту Е территориям мира.
Впервые установлено, что частота выявления анти-ВГЕ среди ветеранов Советской Армии, принимавших участие в боевых действиях в Республике Афганистан, существенно выше (29,97%), чем среди военнослужащих, проходивших в эти же годы военную службу в регионах СССР, неэндемичных по гепатиту Е (3.8%). Полученные данные свидетельствуют о принадлежности военнослужащих, проходивших службу в Республике Афганистан к группе риска инфицирования ВГЕ.
Опровергнуто предположение о коротком времени циркуляции анти-ВГЕ после перенесённого гепатита Е среди лиц, не проживающих в эндемичных регионах мира. Длительность сохранения постинфекционного иммунитета составила не менее 14 лет.
Впервые в России установлено, что среди домашних животных и птиц (свиней и кур) частота выявления анти-ВГЕ соответственно составляет 20,7% и 18,3%, что подтверждает предположения о принадлежности гепатита Е к группе зоонозов.
Практическая значимость
Результаты апробации диагностического набора для выявления анти-ВГЕ классов IgM и IgG в иммуноферментном анализе производства
фирмы «Диагностические тест системы» Нижний Новгород свидетельствуют о его высокой чувствительности и специфичности. Данный набор сопоставим с характеристиками диагностического набора фирмы «Абботт». Полученные результаты обосновывают целесообразность использовать этот диагностический набор для научных исследований и в системе практического здравоохранения России и Египта.
Обнаружение завозных случаев гепатита Е в Россию определяет необходимость обследования на наличие этой инфекции лиц, приехавших из эндемичных регионов мира.
Результаты, полученные при определении частоты выявления анти-ВГЕ среди ветеранов Советской Армии, принимавших участие в боевых действиях в Республике Афганистан, свидетельствуют о частом их инфицировании ВГЕ, что необходимо учитывать при диспансерном наблюдении за этими пациентами.
Повышенный риск инфицирования гепатитом Е определяет необходимость изготовления вакцины против гепатита Е и обоснование тактики её применения в группах населения, посещающих эндемичные регионы (военнослужащие; туристы; лица, выезжающие на работу в эндемичные регионы).
Обнаружение анти-ВГЕ среди домашних животных свидетельствует о необходимости разработки программы изучения гепатита Е как зооноза, при сотрудничестве эпидемиологов и ветеринаров.
Внедрение результатов диссертационной работы в практику Результаты, полученные в ходе выполнения работы внедрены в практику работы:
Отдела вирусных гепатитов НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН при проведении работ по
и изучению гепатита Е;
1-й Клинической инфекционной больницы (гепатологический центр) при обследовании больных поступающих в стационар с диагнозом «гепатит не ясной этиологии»;
Кафедры Микробиологии, Иммунологии и Вирусологии; Медицинского факультета, Российского Университета Дружбы Народов ( РУДН ) при чтении лекций.
Апробация работы
Результаты работы доложены на заседании кафедры Микробиологии, Иммунологии и Вирусологии; Медицинского факультета, Российского Университета Дружбы Народов ( РУДН ); Всероссийского съезда инфекционистов г. Санкт-Петербург 2003 г; IV съезде научного общества гастроэнтерологов России (4 февраля 2004 г, г.Москва); Семинаре врачей инфекционистов города Москвы 10 февраля 2004; Российской конференции «Современные средства иммунодиагностики, иммуно- и экстренной профилактики актуальных инфекций». 22- 23 апреля 2004 г, г. Санкт-Петербург. Апробация диссертации состоялась 21 апреля 2004 г. на научной конференции отделов эпидемиологии и микробиологии ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН. Публикации По теме диссертации опубликовано 4 печатные работы Структура и объём диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 3-х глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и указателя литературы, состоящего из 174 работ отечественных и зарубежных авторов. Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста, включает 13 таблиц и 9 рисунков.
Лабораторный диагноз ГЕ и серо-распространенность анти-ВГЕ
Гепатит Е, предварительно известный как гепатит «ни А, ни В», инфекционное заболевание человека с клиническими и морфологическими характеристиками острого гепатита. Впервые предположение об этиологической самостоятельности ГЕ было высказано в 1980-х годах, после того как в сыворотках крови больных вовлеченных в крупные вспышки гепатита в Индии (Дели и провинция Кашемир - 1955-56 годы) не были выявлены серологические маркеры характерные для острых гепатитов В и А [157,161,82].
Вирус гепатита Е был впервые идентифицирован М.С. Балаяном в 1983 году в результате опыта по самозаражению фекальным материалом собранных от больных заразившихся фекально-оральным гепатитом «ни А, ни В» в Афганистане [18]. Дальнейшие опыты по заражению макак-резусов подтвердили этиологическую принадлежность выделенного вируса к гепатиту Е [18,28].
Оценка физическо-химических и биологических свойств ВГЕ (морфология вириона, наличие одноцепочечной РНК положительной полярности, состав вирусных белков, и другие характеристики) позволила временно классифицировать ВГЕ как представителя нового рода семейства Caliciviridae. Однако по мнению М.С. Балаяна, 1983 [18], организация и стратегия генома ВГЕ не позволяют отнести этот вирус к калицивирусам. Уникальность строения РНК ВГЕ по сравнению с другими вирусами, отсутствие гомологии с РНК представителей семейства Caliciviridae позволяет рассматривать ВГЕ как отдельного члена нового вирусного рода, который наиболее вероятно представит новое семейство вирусов [20]. Дальнейшее определение свойств ВГЕ и характеристика РНК ВГЕ подтвердило предположение о уникальности этого вируса [23]. Выявленные отличия ВГЕ от других представителей семейства Caliciviridae обобщены в таблице № 1.
Молекулярно-биологические исследования различных изолятов вируса гепатита Е, клонирование РНК ВГЕ, проведенное в различных странах мира, так же подтвердили положение о уникальном положении ВГЕ [124,138]. Так, степень гомологии между изолятами вируса, выявленными в Юго-Восточной Азии, составила 94% и более, в то время как сходство с изолятами из других регионов мира не превышало 77%, такая гетерогенность превышает уровень, позволяющий объединять изоляты в один вирусный род [24].
Накопление фактических данных и сопоставление с вирусами других вирусных семейств позволило Fry с соавторами [53], высказать предположение, что ВГЕ возможно отнести к семейству Togaviridae. В то же время, Koonin с соавторами [85] считают, что ВГЕ может в дальнейшем составить большую уникальную группу в пределах альфа-вирусов. Вместе с тем, к настоящему времени большинство исследователей отмечают, что ВГЕ не классифицирован, но организация его генома более походит на вирусы Caliciviridae, однако некоторые исследователи подчеркивают его близость к семейству Togaviridae [138,116,45]. Морфология ВГЕ и организация структуры РНК ВГЕ и генотипы ВГЕ.
Электронно-микроскопическое исследование ВГЕ продемонстрировало, что это безоболочечная частица кубической симметрии, размером 27-34 нм [22]. ВГЕ содержит одноцепочечную РНК положительной полярности размером в 7.5 КБ.
В РНК ВГЕ выделяют 3 открытые рамки считывания (ОРС). ОРС-1 состоит из 5079 нуклеотидов (нт) кодируя неструктурные белки, участвующие в вирусной репликации. Эта рамка считывания содержат мотивы, кодирующие вирусные метил-трансферазу, папаин-подобную цистеиновую протеазу, хеликазу и РНК зависимую РНК-полимеразу (РЗРП). Кроме того, ОРС- 1 содержит два региона обозначенных как Y и X области, чья функция окончательно не установлена [138].
ОРС-2 включает в себя 1980 нт и кодирует вирусный капсидный белок. Этот белок очевидно синтезируется в эндоплазматической сети как белок в 71 кДа, и затем транспортируется на поверхность клетки [73]. ОРС-3 состоит из 369 нт, изучение молекулярной биологии ВГЕ позволило установить, что белок кодированный ОРСЗ может быть способен к соединению с гепатоцитами [168].
Изучение различных изолятов ВГЕ, полученных в различных регионах мира, позволило выделить основные четыре генотипа вируса [62]: Первый генотип: Индия, Бирма, Непал, Вьетнам, Китай, Пакистан и Египет. Второй генотип: Мексика и, возможно, Нигерия.
Третий генотип: Соединенных Штаты Америки, Италия, Греция, Новая Зеландия. Четвертый генотип: Китай
Применение современных методов определения последовательностей РНК ВГЕ позволило получить новые данные о гетерогенности популяции ВГЕ. Особый интерес представляют работы по изучению штаммов вируса полученных от лиц, проживающих в неэндемичных регионах по ГЕ.
Так, например, исследование проведенное в Японии позволили выявить новый вариант вируса обозначенный - JRA1 у 7 больных со спорадическим гепатитом Е (шесть пациентов не путешествовали и не были за границей, а один совершил поездку на Гаваи). Сравнение по 326 нуклетидам в ОРС-1 позволило установить, что 1, 2 и 3 изоляты близки к генотипам I, III, и IV, соответственно. Изолят вируса, выделенный от пациента, совершившего путешествие, оказался близок к изолятам США (89% - 91% гомологии нуклеотидный последовательности). Однако этот изолят был еще более близок к другому японскому изоляту (95 %-97 % гомологии), что позволяет предлагать незавозной характер инфекции в данном случае. В дальнейшем было продимонстрировано наличие еще одного варианта ВГЕ обозначенного как НЕ-JA10.
Оценка методов выявления маркеров инфицирования вирусом гепатита Е (анти-ВГЕ и РНК ВГЕ) и обнаружение случаев завоза гепатита Е из эндемичных регионов мира по этой инфекции в Россию
В свете приведенных выше данных очевидным становится вопрос - способен ли ВГЕ свиней вызывать инфекцию человека, или же речь идет о близкородственных вирусах свиней и человека, не способных к межвидовому инфицированию?.
Эксперименты Meng X.J. с соавт., 1998 [102], по межвидовому инфицированию ВГЕ продемонстрировали, что свиньи не восприимчивы к заражению по меньшей мере двумя человеческими вариантами ВГЕ - Sar-55 и Мех-14. В то же время экспериментальное заражение макак-резусов, шимпанзе и людей-добровольцев свиным ВГЕ было успешным.
Та же группа исследователей установила, что распространеность ВГЕ среди свиней не связана с распространенностью ВГЕ в человеческой популяции -частота выявления анти-ВГЕ среди свиней в странах, эндемичных и неэндемичных по ВГЕ была одинаково высокой [103].
Wang Y.C. с соавторами [159] проанализировали распространенность ВГЕ среди домашних животных (свиней, крупного рогатого скота, коз) в Китае. Частота выявления анти-ВГЕ среди свиней составила 78,8%, среди крупного рогатого скота - 6,3%, среди коз не было отмечено ни одного случая выявления этого маркера. Пять из 263 свиных сывороток были положительны по РНК ВГЕ, и четыре из этих пяти были также позитивны по анти-ВГЕ. Анализ амплифицированных фрагментов генома ВГЕ показал, что степень сходства последовательностей между собой составляет 83%-93 %, а гомология относительно генотипов ВГЕ 1, 2, 3, и 4 - 74-79%, 73-74 %, 73-78 %, и 83-99 %, соответственно. Таким образом, описанные изоляты свиного вируса были наиболее близки к генотипу 4 ВГЕ человека, в том числе к изолятам, полученным от китайских пациентов с острым гепатитом, что подтверждает предположение о то, что спорадический гепатит Е в Китае является зоонозном. Wu J.C. с соавторами [162] также подтвердили, что на Тайване большинство изолятов ВГЕ, выделенных от свиней относятся к генотипу 4, за исключением трех случаев завезенного из США ВГЕ генотипа 3, выявленного у импортированных из этой страны свиней. Та же группа авторов провела определение распространенности ВГЕ среди поросят разных возрастных групп -методом ОТ-ПЦР определяли РНК ВГЕ среди животных в возрасте менее 2 месяцев, 2 месяца , 2-4 и 5-6 месяцев. Частота выявления РНК ВГЕ составила соответственно 0%, 4,5%, 1,2% и 1,8%. Таким образом, по-видимому, инфицирование свиней ВГЕ происходит в первые месяцы жизни. Huang F.F. с соавторами [66], опираясь на открытие изолятов свиного ВГЕ, генетически близких ВГЕ человека, предлагают рассматривать гепатит Е как зооноз, относя при этом некоторые индустриальные страны, в том числе США, к эндемичным по ВГЕ регионам. По данным этих авторов, 54% протестированных в ОТ-ПЦР с универсальными праймерами свиней в США были позитивны по РНК ВГЕ. Анализ амплифицированного фрагмента ОРС2 для 27 изолятов из разных регионов страны позволил установить, что степень сходства изолятов между собой составляет 88-100%, а с прототипным изолятом свиного ВГЕ - 89-98%, при этом анализируемые изоляты образуют единый кластер с двумя изолятами ВГЕ человека. Приводя эти данные и относя ГЕ к зоонозам, Huang F.F. с соавторами [66] поднимают вопрос о безопасности продуктов питания. В пользу взгляда на ГЕ как на зооноз говорят и данные 1п-Soo Choi с соавторами [69], по восприимчивости приматов к свиному ВГЕ и генетическому анализу фрагментов ОРС2 ВГЕ, изолированного от свиней в Корее. При частоте выявления РНК ВГЕ 2,3% все изоляты были отнесены к генотипу 3 и были сходными как со свиными, так и с человеческими изолятами из США и Японии. Те же авторы приводят данные по частоте выявления анти-ВГЕ среди свиней и в человеческой популяции в Корее - 15% и 18%, соответственно. По-видимому, субклинические формы ВГЕ-инфекции преобладают как среди свиней, так и у человека, делая вклад в распространение вируса [69]. Свидетельством в пользу восприимчивости человека к свиному ВГЕ являются данные приведенные Yasuyuki Yazaki с соавторами [166]. Среди 10 пациентов, заболевших острым ГЕ в 2001-2002 гг. на Хоккайдо (Япония), 9 за 2-8 недели до начала болезни употребляли в пищу свиную печень. Образцы свиной печени, продающейся в магазинах на Хоккайдо, были протестированы в ОТ-ПЦР на РНК ВГЕ. Частота выявления вирусной РНК составила 1,9% (7 из 363 образцов). Все 7 выявленных изолятов принадлежали генотипам 3 и 4. Один из этих изолятов на 100% был гомологичен варианту ВГЕ, полученному от одного больного ГЕ с Хокайдо. Два других изолята на 98,5-100% были сходны с ВГЕ, изолированным от другого пациента с этого же острова. Таким образом, употребление неадекватно приготовленной свиной печени может приводить к инфицированию человека ВГЕ. Однако существуют свидетельства, не подтверждающие способность свиного ВГЕ передаваться человеку. По данным Arankalle V.A. с соавторами [8], в Индии, стране эндемичной по ГЕ, в человеческой популяции и среди свиней циркулируют разные генотипы вируса - все изоляты ВГЕ человека относятся к генотипу 1, тогда как все свиные изоляты относятся к генотипу 4. Такое распределение генотипов ВГЕ в Индии указывает на отсутствие межвидового инфицирования и разительно отличается от сообщений из США и Тайваня, где человеческие и свиные изоляты ВГЕ относятся к одному и тому же генотипу, 3 и 4, соответственно.
Ling Lu с соавторами [94] провели определение нуклеотидной последовательности полноразмерного генома ВГЕ, изолированного из фекалий экспериментально зараженных человеческим ВГЕ поросят во время вспышки эпидемии гепатита ни-А ни-В в Киргизии [19]. Генетический анализ последовательности полного генома позволил отнести этот изолят к генотипу 3 ВГЕ, к которому принадлежат многие описаннные изоляты свиного ВГЕ, тогда как генотипирование вируса, изолированного из архивированных фекалий пациентов, собранных во время той вспышки (хотя и из соседней деревни), позволило установить, что человеческий вирус относился к генотипу 1. По-видимому, изолированный в данной работе свиной ВГЕ имел эндогенное происхождение, и не был связан с экспериментальным инфицированием человеческим ВГЕ.
Следует отметить, что не только среди свиней циркулирует вирус, близкий к ВГЕ человека. Haqshenas G. с соавторами [63] идентифицировали новый вирус, обозначенный как птичий ВГЕ, в США у цыплят с синдромом гепато-спленомегалии. Они показали, что птичий ВГЕ генетически связан со свиным и человеческим ВГЕ и капсидный белок этого вируса, кодируемый ОРС2, обладает перекрестной антигенной реактивностью с аналогичными белками свиного и человеческого ВГЕ, а также австралийского вируса гепато-спленомегалии цыплят. Таким образом, все эти вирусы обладают некоторыми общими антигенными эпитопами в капсидном белке, что имеет важное значение для таксономии и диагностики ВГЕ.
Определение частоты выявления анти-ВГЕ в различных группах населения («здоровое» население Тывы и Армении; беременные женщины проживающие в г. Москве, Россия и г. Эль-Мансура и его окрестностях, Египет).
Для исключение вирусных гепатитов А, В и С было проведено исследование сывороток крови на наличие маркеров острого гепатита A (IgM анти-ВГА), В (HBsAg, IgM анти-ВГВ) и С (анти-ВГС, РНК ВГС). Проведенное тестирование дало отрицательный результат на наличие маракеров этих инфекций.
Этиологическая причастность ВГЕ к возникновению данного острого гепатита у пациента С.Х. была доказана при помощи обнаружения маркеров инфицирования вируса ГЕ в сыворотках крови и образцах фекалий (анти-ВГЕ классов IgG и IgM, РНК ВГЕ). При тестировании образцов фекалий больного, собранных на 21-ый день от начала заболевания, в реакции амплификации на наличие РНК ВГЕ зарегистрирован положительный результат обнаружения РНК-ВГЕ.
Определении антител к ВГЕ классов IgG и IgM в сыворотках крови больного собранные на 21-ый и на 35-ый день от начала заболевания также показало наличие этих маркеров вируса ГЕ. Таким образом, на основании клинико-эпидемиологических данных, биохимических исследований, отсутствия маркеров инфицирования вирусов гепатитов А, В и С, а также наличия специфических серологических маркеров инфекции ГЕ (антител к ВГЕ классов IgG и IgM) и обнаружения РНК ВГЕ был поставлен диагноз «гепатит Е».
Пациент Ч.А., (История болезни № 8322, 1-ая инфекционная больница, г. Москва), 54 года, коренной житель г. Москвы, гражданин России, инженер строитель. С 25.03.03. по 14.04.03 находился в служебной командировке в Южном Китае
История болезни: заболевание имело острое начало. Больной 26.04.03. почувствовал общую слабость, зарегистрировано повышение температуры до 37,3 и появление тупых болей в верхних отделах живота. Отмечено потемнение мочи, желтушность кожных покровов и склер - 9.05.03. 12.05.03 по скорой помощи доставлен в ИКБ № 1 и госпитализирован в 16 отделение на 14-ый день болезни, 3-ий день желтухи с диагнозом - «Острый вирусный гепатит не уточненной этиологии средней тяжести течения».
В начале заболевания выявлялись общие неспецифические признаки острого гепатита, описанные выше, которые сочетались с повышением активности сывороточных трансфераз: АЛТ до 2800 мкмоль/мин.л. и ACT до 1600 мкмоль/ мин.л. (при норме 40 мкмоль/мин.л.). Максимальное повышение показателей общего билирубина достигало до 220 мкмоль/л. (при норме 20 мкмоль/л) и щелочной фосфотазы до 340 мкмоль/мин.л.. (при норме 100 мкмоль/л.мин) также наблюдалось на 16 день болезни. В дальнейшем происходило постепенное уменьшение активности трансаминаз и концентрации билирубина. К концу четвертой недели после начала заболевания все вышеперечисленные биохимические показатели крови достигли нормальных значений. Динамика изменения показателей активности сывороточных трансаминаз, концентрации билирубина и щелочной фосфотазы у пациента Ч.А. представлена на рисунке №3.
Также, как и при первом случае, для исключение вирусных гепатитов А, В и С было проведено исследование сывороток крови на наличие маркеров острого гепатита A (IgM анти-ВГА), В (HBsAg, IgM анти-ВГВ) и С (анти-ВГС, РНК ВГС). Проведенное тестирование дало отрицательный результат на наличие мракеров этих инфекций.
Определение маркеров инфицирования вирусом гепатита Е (IgG анти-ВГЕ и IgM анти-ВГЕ.) проведено в образцах сывороток крови, взятых на 8-й неделе от начала заболевания. Тестирование проведено методом ИФА с использованием коммерческих диагностикумов фирмы «Диагностические препараты» показало наличие анти-ВГЕ класса IgG при отрицательной реакции на наличие IgM анти-ВГЕ. Обнаружение анти-ВГЕ позволило расценить данное заболевание как гепатит Е.
На основании клинико-эпидемиологических данных, биохимических исследований, отсутствия маркеров инфицирования вирусами гепатитов А, В и С, а также наличие специфического серологического маркера предыдущего инфицирования ВГЕ (обнаружение антител к ВГЕ класса IgG), был поставлен диагноз «гепатит Е».
Таким образом, проведенные исследования по обнаружению случаев гепатита Е продемонстрировали наличие завозных случаев «Гепатита Е» на территорию России, продемонстрировали возможность завоза ГЕ из эндемичных регионов в неэндемичный..
Определение частоты выявления анти-ВГЕ, среди солдат проходивших и не проходивших службу в Республике Афганистан 14-18 лет тому назад
При разработке иммуноферментную тест-системы, фирма «Абботт», один из лидеров современной диагностической промышленности, использовала антигены ВГЕ полученные по рекомбинантной технологии в клетках E.coli. Полученные белки были слиты с С-концевым фрагментом белка, информация о котором находится в - ОРС 2 (327 ак - SG-3) и полноразмерной копией белка, кодированного ОРС 3 ВГЕ штамма Бирма [164]. Диагностическая система фирмы «Абботт» была признана одной из перспективных тест-систем применяемых в лабораторной диагностике гепатита Е.
Исходя из этого, тест система фирмы «Абботт» была избранна нами в качестве системы сравнения. При выполнении диссертационной работы проведено сравнение диагностических тест-систем для выявления анти-ВГЕ изготовленных фирмами «Абботт» и «Диагностические тест системы» (Нижний Новгород). Полученные результаты свидетельствовали о высокой чувствительности и специфичности этих двух тест систем для определения антител к вирусу ГЕ класса Ig-G.
Анализ частоты обнаружения антител к ВГЕ в образцах сывороток крови собранных в динамике от добровольца, заразившего себя гепатитом Е, показал более высокую чувствительность тест-систем фирмы «Диагностические тест системы» (Нижний Новгород) по сравнению с диагностическим препаратом фирмы «Абботт». Так например, при тестировании образцов крови взятого у добровольца на 6 месяце от начала заболевания показатели оптической плотности (OD) ферментативной реакции при определении анти-ВГЕ с набором «Диагностические тест системы» были выше (2,169) по сравнению с величинами OD образцов полученными с препаратом фирмы «Абботт» (0,992). Кроме того, отличалась также и расчетная величина показателя «cut-off» (отсекающая величина) для этих диагностических наборов, которая соответственно составляла 0,245 и 0,331.
Параллельное тестирование сывороток крови полученных от больных гепатитом Е и «здорового» населения так же продемонстрировало преимущество тест- системы фирмы «Диагностические тест системы» (Нижний Новгород). Подтверждением высоких диагностических качеств данного набора для выявления анти-ВГЕ методом ИФА служит факт выбора этой системы сотрудниками CDC (Centre for disease Control, США) для проведения своих исследований по гепатиту Е.
При изготовлении набора для определения анти-ВГЕ («Диагностические тест системы», Нижний Новгород) применены рекомбинантные антигены ВГЕ, аналоги линейных и конформационных эпитопов, кодированных открытой рамки считывания 2 и 3 РНК ВГЕ штаммов Бирма и Марокко. Исследования по оценки чувствительности различных тест систем включающие и набор фирмы («Диагностические тест системы, Нижний Новгород») подтверждают наши данные о высокой чувствительности и специфичности последнего набора [51]. Кроме того наше заключение согласуется с выводами сделанными Goldsmith R. с соавт., 1992 [56] и Yarbough P.O. с соавт., 1999) [165] о преимуществах эпитопов избранных при конструировании наборов для выявления анти-ВГЕ, применяемых в препарате, выпускаемом фирмой «Диагностические тест системы».
Вопрос о возможном завозе гепатита Е из энднемичных регионов мира в неэндемичные по этой инфекции регионы обсуждается в научной литературе и, в настоящее время не вызывает сомнений.. Подтверждением этого являются данные полученные Andenaes S. с соавт., 2000 [7]. Авторы провели исследование по определению частоты выявления антител против ВГА и ВГЕ среди сотрудников Скандинавский авиакомпании совершающих (опытная группа) и не совершающих (группа сравнения) рейсы в страны мира эндемичные по этим инфекциям. Так, частота выявления анти-ВГА среди этих групп была одинаковой и составляла менее 5% в каждой из них. Анализ результатов выявления анти-ВГЕ показал, что частота обнаружения антител к вирусу ГЕ в опытной группе была выше, чем в группе сравнения и составила соответственно 3,4% и 1,2%. На основании полученных данных авторы пришли к заключению, что гепатит Е может рассматриваться в качестве профессионального заболевания персонала авиалиний совершающих полеты в регионы мира эндемичные по гепатиту Е.
При проведении литературного поиска, нам не удалось обнаружить научных публикаций посвященных описанию случаев гепатита Е завезенных из эндемичных по гепатиту Е регионов мира в Москву, то есть в город расположенный на неэндемичной по гепатиту Е территории. В ходе выполнения нашего исследования удалось ответить на вопрос, возможно ли завести Г-Е инфекцию из эндемичных регионах по этой инфекции в Россию?
В представленной работе описаны 2 случая заболевания гепатита Е, зарегистрированные в Клинической инфекционной больнице № 1 г. Москвы в 2002 и 2003 году.
Пациент С.Х., 36 лет, менеджер индийской фирмы, житель Индии, прибыл в Москву 16.08.02 г. Заболевание началось остро 10.09.02 г. К 15 дню болезни активность сывороточных трансаминаз достигла: для АЛТ и ACT соответственно 2101 мкмоль/мин.л. и 1870 мкмоль/минл. ( норма 40 мкмоль/мин.л.). Величина общего билирубина 310 мкмоль/л. (норма 20 мкмоль/л) и активность щелочной фосфотазы - 152 мкмоль/мин.л. (норма 100 мкмоль/мин.л.). В конце четвертой недели после начала заболевания все вышеперечисленные биохимические показатели достигли нормальных значений.
Исследование сывороток крови на наличие маркеров острого гепатита А (IgM анти-ВГА), В (HBsAg, IgM анти-ВГВ) и С (анти-ВГС, РНК ВГС) дало отрицательный результат. Диагноз «гепатит Е» был подтвержден обнаружением в образцах фекалий пациента РНК ВГЕ, выявленной при помощи диагностического набора для ПЦР производства отечественной фирмы «Гаджи», а также обнаружением анти-ВГЕ на 21 и 35-й день от начала болезни при помощи коммерческих диагностических наборов для ИФА, выпускаемых фирмой «Диагностические препараты», Нижний Новгород.
