Содержание к диссертации
Введение
Глава 1.Обзор литературы 13
1.1. История и географическое распространение ЛЗН 13
1.1.1. Распространение и эпидемиологическая характеристика ВЗН на Африканском континент 13
1.1.2.Эпидемиологические особенности распространения ВЗН на территории США 15
1.1.3 .Проникновение вируса лихорадки Западного Нила в Европу и Россию 18
1.2. Таксономия и молекулярно-биологическая характеристика ВЗН 24
Глава 2. Материалы и методы 32
2.1. Методы эпидемиологического анализа 32
2.2. Штаммы вируса лихорадки Западного Нила, использованные в работе 33
2.3. Сбор, транспортировка, хранение и подготовка исследуемого материала 33
2.4. Молекулярно-биологические и иммунодиагностические методы 34
2.5. Компьютерный анализ секвенированных последовательностей 36
2.6. Используемые в работе компьютерные программы 36
Глава 3. Собственные исследования 38
3.1. Анализ вспышек лихорадки Западного Нила в Волгоградской области 38
3.1.1. Природно-климатические условия Волгоградского региона 38
3.1.2. Резервуар инфекции. Основные пути миграции 41
3.1.3 Основные переносчики ВЗН 49
3.1.4. Особенности клинического течения ЛЗН 51
3.1.5. Условия формирования природных очагов вируса ЛЗН 55
3.2. Пространственный эпидемиологический анализ территории Волгоградской области, отражающий степень риска заражением ЛЗН 75
3.3. Исследование полевого и клинического материала 83
3.3.1. Результаты исследования на наличие РНК ВЗН материала полученного от птиц 83
3.3.2. Данные мониторинга за возбудителем ЛЗН в основных переносчиках 83
3.3.3. Исследование клинического материала поступившего от больных, доноров и реконвалесцентов 84
3.4. Молекулярно-генетический анализ геномов ВЗН 87
3.4.1. Сравнительный анализ геномов с использованием специализированного программного обеспечения 88
3.4.2. Разработка олигонуклеотидных праймеров для идентификации всех генотипов ВЗН 94
3.4.3.Определение генотипической принадлежности вируса выделенного из анализируемых проб с использованием метода секвенирования 96
Заключение 99
Выводы 107
- Распространение и эпидемиологическая характеристика ВЗН на Африканском континент
- Таксономия и молекулярно-биологическая характеристика ВЗН
- Молекулярно-биологические и иммунодиагностические методы
- Пространственный эпидемиологический анализ территории Волгоградской области, отражающий степень риска заражением ЛЗН
Введение к работе
Актуальность проблемы. Арбовирусные инфекции в связи с их широким географическим распространением, видовым многообразием и тяжестью клинического течения привлекают к себе особое внимание здравоохранения и медицинской науки во всем мире.
Наиболее значимой арбовирусной инфекцией для Волгоградского региона является лихорадка Западного Нила, возбудителем которого является вирус Западного Нила. (Антонов В.А., с соавт., 2012; Батурин А.А., с соавт., 2012; Липницкий А.В., с соавт., 2011; Львов Д.К., с соавт., 2004). Природные климатические условия Волгоградского региона оказывают существенное влияние не только на численность основных переносчиков и их взаимодействие с возбудителем, но опосредованно, за счет температурного влияния на репликативные процессы и на сам вирус (Платонов А. Е., 2006; Липницкий А.В., с соавт., 2011 ). Большое количество крупных открытых водоемов, глубина которых в основном составляет от 1 до 1,5-2 метров, имеют свои экосистемные особенности. Такие условия наиболее благоприятны не только для массового выплода кровососущих насекомых, но и для гнездования большого количества видов птиц водного и околоводного комплексов (Чернобай В.Ф., 2004; Platonov A. E., еt al., 2008; Rosenthal J., еt al., 2008).
Подавляющее большинство из них зимуют именно на африканском континенте, с которого первично начал распространяться ВЗН. Около 100 тысяч птиц ежедневно пролетает через дельту Волги в период сезонной миграции (Батурин А.А., с соавт., 2012; Чернобай В.Ф., 2004). В связи с высокими темпами урбанизации происходит проникновение вируса в антропогенные биоценозы, что и является основным механизмом возникновения вспышек на территории Волгоградской области (Липницкий А.В., с соавт., 2011).
Эти факты обеспечивают не только благоприятную среду для размножения и накопления возбудителя ЛЗН, но и его постоянную экспансию на территории Волгоградской области и близлежащих регионов Поволжья. Примером этому могут послужить периодические вспышки ЛЗН, начиная с 1999 года, с характерной клинической картиной, преобладанием менингеальной симптоматики и высокой летальностью (около 10 %), что характерно именно для 1 генотипа вируса ЗН. В 2007- 2010 годах произошла смена генотипов, и подавляющее большинство зарегистрированных клинических случаев ЛЗН были обусловлены уже 2-м геновариантом вируса (Антонов В.А., с соавт., 2012;). На территории Волгоградской области второй генотип, обнаруженный в 2007 году, до 2010 года вызывал лишь единичные случаи заболевания. Помимо Волгоградской области в 2010 году больные с диагнозом ЛЗН зарегистрированы еще в 9 субъектах РФ (Путинцева Е.В., с соавт., 2011). По данным Референс-центра по мониторингу за возбудителем лихорадки Западного Нила, созданного по приказу Роспотребнадзора от 17.03.2008 г. № 88 на базе ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора», в 2010-2012 гг. экспансия ВЗН охватила новые территории 21 субъекта Российской Федерации.
Вышеизложенное свидетельствует об актуальности проблемы, что обусловило выбор целей и задач данного исследования.
Цель работы - выявить эпидемиологические особенности проявлений ЛЗН на основе пространственного анализа территории Волгоградской области с оценкой ее эпидемического потенциала и информации о молекулярно-эпидемиологических характеристиках региональных изолятов ВЗН.
Основные задачи исследования:
1. Провести ретроспективный анализ вспышек ЛЗН на территории Волгоградской области с учетом основных условий, повлиявших на рост заболеваемости.
2. На основе совокупных данных лабораторных исследованийоценить инфицированность комаров, перелетных и синантропных птиц вирусом ЗН.
3. Провести картографический анализ территории Волгоградской области на основе заболеваемости населения ЛЗН с использованием ГИС-технологий
4. Определить генотипическую принадлежность изолятов ВЗН, циркулирующих на территории Волгоградской области, на основе сравнительного анализа РНК, выделенной из клинического материала, с доступными на интернет ресурсах полноразмерными последовательностями ВЗН.
5. Изучить определяющие факторы способствующие формированию константных природных очагов ЛЗН в Волгоградской области, с последующей пространственной визуализацией данных.
6. Создать Интернет-ресурс с интегрированной системой информирования и адаптации населения Волгоградской области в условиях формирования очага ЛЗН.
Научная новизна работы
Впервые проведен кластерный анализ 390 полноразмерных геномов ВЗН, доступных на интернет ресурсе , и определены генотипы изолятов, циркулирующих на территории Волгоградской области. Секвенированы и депонированы в генетической базе данных GenBank нуклеотидные последовательности, полученные с использованием разработанных секвенационных праймеров, детектирующих фрагменты кодирующих последовательностей prot C, prot E, NS3 и NS5 генома ВЗН всех генотипических вариантов.
Предложено обоснование возможности формирования природного очага лихорадки Западного Нила на территории Волгоградской области и впервые сформирован алгоритм молекулярно-эпидемиологического мониторинга в целях оптимизации эпидемиологического надзора за ЛЗН.
Выявлены основные эпидемиологические характеристики заболевания ЛЗН, и особенности её клинического течения в пределах Волгоградской области в период с 1999-2011 гг..
На основе пространственного анализа основные районы Волгоградской области разделены на стандартные участки, отражающие эпидемиологическую степень риска возникновения заболеваемости ЛЗН. С использованием технологий геоинформационных систем определены условные границы и приблизительная площадь очагов ЛЗН на территории Волгоградской области, позволяющие локализовать зоны проведения противоэпидемических мероприятий.
В результате исследования, проведенного в рамках гранта РГНФ № 11-16-34-011 а/В, впервые создана информационная система социально-медицинской адаптации и информирования населения в условиях формирования очага ЛЗН на территории Волгоградской области.
Теоретическая и практическая значимость работы
Сформирована современная аналитическая система, позволяющая осуществлять мониторинг зон риска заболевания ЛЗН и основных мест концентрации популяций дикоживущих видов птиц, определять диапазон проведения противоэпидемических мероприятий и прогнозировать эпидемическую обстановку по ЛЗН на территории Волгоградской области. Данная система предусматривает применение молекулярно- генетических методов и ГИС-технологий и может быть использована в практике работы Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Роспотребнадзор) с целью оптимизации прогнозирования и профилактики заболеваемости ЛЗН на других эндемичных территориях страны.
Проведен молекулярно–генетический анализ изолятов ВЗН, циркулирующих на территории области, установлена их генетическая принадлежность и возможные механизмы проникновения вируса, выявлены особенности клинических проявлений заболевания в зависимости от генотипа вируса.
Созданный информационный ресурс в первую очередь, касающийся проблем диагностики и профилактики лихорадки Западного Нила, используется в рамках функционирования Референс-центра по мониторингу за возбудителем ЛЗН.
Полученные результаты диссертационной работы включены в проект санитарно-эпидемиологических правил «Профилактика лихорадки Западного Нила», лекционный материал для врачей, лаборантов учреждений санитарно- эпидемиологического профиля клинических диагностических лабораторий, биологов, эпидемиологов и курсов усовершенствования по вопросам специфической индикации и лабораторной диагностики особо опасных заболеваний, проводимых на базе ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора». Кроме того, материалы настоящей работы используются при чтении лекций и проведении практических занятий для студентов медико- биологического факультета Волгоградского государственного медицинского университета.
Основные положения выносимы на защиту:
-
Смена генотипа ВЗН, смещение клинической картины заболевания в сторону более легкого течения и экспансия вируса на новые территории являются имманентными эпидемиологическими особенностями проявления возбудителя ЛЗН в Волгоградской области на современном этапе.
-
Для оптимизации системы эпидемиологического надзора необходимо расширение объектов исследования и сроков проведения мониторинга за ВЗН, что позволит оценить уровень инфицированности основных переносчиков, промежуточных хозяев и населения региона, усовершенствовать качество лабораторной диагностики и противоэпидемических мероприятий.
-
Пространственный анализ территории Волгоградской области позволяет районировать ее с учетом степени эпидемиологического риска заболеваемости ЛЗН и определять условные границы очагов возбудителя.
-
Генотипическая принадлежность штаммов ВЗН, циркулирующих в Волгоградском регионе, неоднородна, что не исключает эпидемической активности нескольких геновариантов возбудителя ЛЗН.
-
Климатические условия Волгоградской области, обилие узлов концентрации перелетных птиц и основных переносчиков способствуют формированию константных природных очагов ВЗН и расширению территорий, на которых регистрируется заболеваемость и выявляются маркеры циркуляции вируса.
Апробация работы. Основные результаты диссертации представлены на 69-й открытой научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальнойи клинической медицины» 27-30 апреля 2011 года; III Ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням - Москва, 28-30 марта 2011 года; научно-практической конференции молодых ученых и специалистов г. Волгограда 24 апреля 2012 года; Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора «Фундаментальные и прикладные аспекты анализа риска здоровью населения» г. Пермь, 16-18 мая 2012 года; Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы болезней, общих для человека и животных», г. Ставрополь, 23-24 мая 2012 года; Заседании Волгоградского регионального отделения всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов 21 июня 2013 года.
Основное содержание диссертации выполнено в рамка НИР38-1-09 «Совершенствование санитарной охраны территории Российской Федерации на основе реализации стратегии ВОЗ по применению Международных медико-санитарных правил (2005 г.) до 2013 г. и концепция Федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации»» (2009.01-2013.12); 055-1-11 «Совершенствование системы эпидемиологического мониторинга за опасными и природно-очаговыми инфекциями в Волгоградской области» (2011.01 – 2015.12); 4.1 Отраслевая научно-исследовательская программа «Научные исследования и разработки с целью обеспечения санитарно- эпидемиологического благополучия и снижения инфекционной заболеваемости в Российской Федерации» (2011.01-2015.12); 063-4.10-11 «Совершенствование эпидемиологического надзора в природных очагах арбовирусных инфекций на территории Нижнего Поволжья» (2011.01 – 2015.12).
Публикации. Материалы диссертации представлены в 10 научных работах, в том числе 6 – в рецензируемых периодических изданиях, рекомендованных ВАК для защиты докторских и кандидатских диссертаций.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 134 листах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, 3-х разделов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 155 источников, в том числе 45 отечественных и 110 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 7 таблицами и 33 рисунками, содержит приложение в виде таблицы на 8 истах.
Распространение и эпидемиологическая характеристика ВЗН на Африканском континент
Вирус лихорадки Западного Нила впервые выделен в 1937 году в Уганде, при массовом обследовании на носительство вируса желтой лихорадки от больной с лихорадочным состоянием, сопровождавшимся сонливостью. Через три месяца в крови у нее были обнаружены антитела к вирусу лихорадки Западного Нила. Позднее был выделен штамм вируса ЗН В956. Поскольку заболевание характеризовалось общелихорадочными симптомами, оно получило название лихорадки Западного Нила [140, 141]. После выделения возбудителя ЛЗН в самостоятельный вид [106] в странах Африки до начала 1950 года наблюдалась в основном спорадическая заболеваемость, не пересекающая границ тропических и субтропических эндемичных регионов. 1950-е годы дали толчок и для развития изучения экологии и эпидемиологии возбудителя ЛЗН. Детальное исследование вируса и связанных с ним форм заболевания, проводившиеся во время вспышек в Израиле и Египте в период между 1950 и 1954 [57, 80]при интенсивном изучении человеческой сыворотки крови показали высокий уровень антител к ВЗН среди взрослого населения этих стран [91, 109]. Последующее исследование населения Уганды, Кении, Конго и Судана также выявили высокие уровни антител к ВЗН [94]. Возбудитель неоднократно был обнаружен в Южноафриканской республике в 1958г., 2000 и 2001г.г. в сыворотках крови человека, на Мадагаскаре в 1978г. выделен от попугая (Coracopsis vasa), в Центральноафриканской республике в 1982г., в Сенегале в 1990г. выделен от комаров (Mimomyia lacustris). Было выявлено наличия антител у населения, особенно в Южной Африке, Мозамбике, Намибии и Ботсване. В Южной Африке ВЗН передается, главным образом, между птицами и комарами по средствам энзоотического цикла [95, 101]. Предполагается, что в Африке существует большое количество эндемичных регионов, с высокой распространенностью возбудителя ЛЗН в объектах внешней среды, животных, птицах, комарах и клещах. Израильские вспышки были спорадическими, но с наличием тяжелых форм заболевания. Различными исследователями было сделано предположение, что вирус эндемичен в этом регионе, и что развитие заболеваемости обусловлено внедрением вируса в организм не иммунной прослойки населения [81, 135].
С момента открытия вируса ЛЗН и на протяжении нескольких десятилетий, до последнего времени, на африканском континенте преимущественно наблюдалась спорадическая заболеваемость людей, не выходящая за пределы тропических и субтропических эндемичных очагов. В качестве исключения можно рассмотреть только вспышку Западно-Нильской лихорадки произошедшую в ЮАР в 1974, в результате которой было подтверждено около 3 000 случаев заражения [127].
Наличие высокого уровня серопозитивности к ЛЗН в некоторых африканских странах [91, 94, 109], по сравнению с Европой дает возможность предположить, что Африка является эндемичной областью в отношении цикла передачи вируса между комарами и птицами, в то время как циркуляция ВЗН в Европе является временным и сезонным, в результате чего и возникают спорадические случаи заболевания и эпидемии. Это означает, что генетический прародитель ВЗН, вероятно, развивавшийся в Африке, был ввезен в Европу, скорее всего, с перелетными птицами [78]. Повторные выделения ВЗН, сделанные в Израиле, показали наличие нескольких генотипов возбудителя. Причем 1 генотип имеет широчайшее распространение и фигурирует во многих эпидемиях в Европе и Америке [54, 62, 63], за исключением тенденций последних лет.
Таким образом, африканский континент можно рассматривать не только как родину ЛЗН, с наличием большого количества природных и антропогенных очагов, но и как основной пункт распределения вируса за счет огромного числа перелетных птиц, ежегодно прибывающих туда на зимовку, наличия множества переносчиков. Это способствует распространению вируса во всех географических регионах и формированию новых самостоятельных очагов ЛЗН, в свою очередь, постоянно подкрепляемых за счет инфицированных птиц и различных механизмов циркуляции и накопления вируса в естественной среде его обитания.
Первый известный случай инфицирования человека вирусом ЗН в Западном полушарии был отмечен в августе 1999 года. Из 62 лабораторно подтвержденных случаев заболевания человека на 8 октября 1999 года, 70% произошло в радиусе 10 км с центром в северной части Нью-Йорка, районе Квинс [67]. Совпадающая во времени и пространстве со случаями заражения человека была отмечена значительная гибель птиц, в частности американских ворон (Corvus brachyrhynchos) [47]. Cмертность птиц была отмечена вокруг зоопарка Бронкса в середине августа [67], примерно в 8 км к северу от эпицентра заболеваемости людей. Несколько тысяч ворон и других видов птиц, как предполагается, умерли от инфицирования вирусом Западного Нила, в основном на территории и в округе города Нью-Йорка. Вместе с дикими птицами наблюдалась смертность коллекционных видов птиц в зоопарках Бронкса и Квинса (в том числе чилийского фламинго [Phoenicopterus chilensis], баклана Бугенвилля [Phalacrocorax bougainvillei], лысых орлов [Haliaeetus leucocephalus], черной воробьиной сороки [Pica pica], бронзовых крылатых уток [Аnas specularis], гималайских моналов (фазанов) [Lophophorus impeyanus], серобрюхого трагопана [Tragopan blythi] и снежных сов [Nyctea scandia]) [143]. Пространственное и временное сопоставление инфицирования птиц и человека привели многих эпидемиологов к выводу, что птицы выступают в качестве главного источника инфекции, возможно, заражаемого орнитофильными комарами, которые, в свою очередь, накапливают вирус внутри своего организма и осуществляют заражение человека [47, 88].
Таксономия и молекулярно-биологическая характеристика ВЗН
В исследовании были анализированы кровь, моча и ликвор больных людей с клиническим диагнозом лихорадка Западного Нила, кровь здоровых доноров и реконвалесцентов, перенесших нейроинвазивную форму инфекции, аутопсийный материал от умерших больных ЛЗН, а также полевой материал (кровь лошадей и суспензии органов птиц, суспензии комаров и клещей). Для анализа использовали пробы, полученные Референс-центром в период 2010-2012 г.г.
Сбор и подготовку проб выполняли в соответствии с СП 1.3.1285–03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)», МУ 4.2.2039-05 «Техника сбора и транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории», МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности», МУ 3.1.3.2600-10 «Мероприятия по борьбе с лихорадкой Западного Нила на территории Российской Федерации», МУ 3.1.1027-01 «Сбор, учет и подготовка к лабораторному исследованию кровососущих членистоногих - переносчиков возбудителей природно-очаговых инфекций».
Молекулярно-биологические и иммунодиагностические методы Выделение РНК из плазмы крови проводили методом нуклеосорбции на силикагеле с гуанидинизотиоцианатом коммерческими наборами реагентов «РИБО-сорб» и «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия). Для экстракции РНК из проб органов и полевого материала использовали коммерческий набор «Рибо-золь-С» (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия) с последующим применением набора «РИБО-преп». Для более эффективного выделения РНК из больших объемов материала (1,5 и 5 мл) применяли набор «Магно-сорб» (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия).
Для проведения обратной транскрипции были использованы комплекты реагентов «РЕВЕРТА-L» (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия). ПЦР проводили с помощью амплификационной тест-системы «АмплиСенс WNV-FL» (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия). Кроме того, в работе были использованы экспериментальная тест-система – «Набор реагентов для выявления РНК вируса Западного Нила методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции с электрофоретическим учетом результатов (ГенНил – РЭФ)», производства ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб», а также набор амплификационных и секвенационных праймеров, фланкирующих фрагменты генома - 5 UTR, prot C, prot E, NS3, NS5 ВЗН, разработанный во ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора. Учёт продуктов амплификации производили методом электрофореза в 3% агарозном геле [23]. Результаты оценивали по наличию или отсутствию в геле после электрофореза фрагментов ДНК необходимого размера. Размер амплифицированных фрагментов ДНК подтверждали по их положению по отношению к маркерным фрагментам (100 - 1000 п.н. DNA Ladder, ЦНИИ Эпидемиологии, Москва). Для документирования полученных результатов гелевые пластинки сканировали с помощью системы получения изображений «GelDoc XR» («BioRad», США).
Очистку специфических ампликонов проводили стандартными методами [23]. Измерение концентрации специфических продуктов амплификации производили с помощью прибора Qubit 2.0 («Invitrogen», Австрия), используя комплект реагентов Qubit Assays.
Для постановки реакции секвенирования использовали набор BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США). Для очистки продуктов реакции терминирования использовался комплект BigDye XTerminator Purification Kit (Applied Biosystems, США). Определение последовательностей нуклеотидов проводилось с помощью автоматического секвенатора ABI Prism 3130 (Applied Biosystems, США). Продукты секвенирования были представлены в виде текстовых и графических файлов программы ABI Sequensis Analysis 5.2 for Windows (Applied Biosystems, США).
Для проведения иммунодиагностических исследований применяли тест-системы «Векто-НИЛ-IgG», «ВектоНИЛ-IgG-авидность» (ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск), «Anti-West Nile Virus ELISA (IgM)», «Anti-West Nile Virus ELISA (IgG)», «Avidity Anti-West Nile Virus (IgG) ELISA» («Euroimmun AG», Германия) и «3Н-IgM» («Биосервис», г. Боровск). Расчет % индекса авидности (ИА) IgG осуществляли на основании тест-системы «ВектоНИЛ-IgG-авидность» (ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск) и ИФА на планшетах «Avidity Anti-West Nile Virus (IgG) ELISA» («Euroimmun AG», Германия).
Молекулярно-генетические и иммунодиагностические исследования проведены совместно с сотрудниками лаборатории генной диагностики и типирования микроорганизмов и группой иммунологических исследований Референс-центра по мониторингу за возбудителем лихорадки Западного Нила на базе ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора, соответственно.
Компьютерный анализ секвенированных последовательностей В начале осуществлялся поиск последовательностей генов ВЗН в генетической базе данных GenBank, гомологичных исследуемым, с использованием алгоритма Basic Local Alignment Search Tool (BLASTn) на web-сервере Национального Центра Биотехнологической Информации (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov /BLAST/).
Следующим шагом являлось проведение сравнительного анализа секвенированных последовательностей, которые сопоставлялись с аналогичными последовательностями генов ВЗН генетической базы данных GenBank. Выравнивание последовательностей осуществлялось с помощью алгоритма ClustallW программного пакета Vector NTI Express Static Academic License (Life Technologies.inc, США). Установление принадлежности к филогенетической группе осуществлялось также с помощью программы Vector NTI.
Для построения дендрограмм использовались последовательности изолятов ВЗН генетической базы данных GenBank. Группирование штаммов и построение филогенетических деревьев проводили при помощи метода присоединения соседей, NJ (Neighbour-Joining method). Для расчета генетических дистанций использовалась модель Кимуры. Достоверность топологии построенных деревьев осуществлялась с помощью бутстрэп-анализа на основе создания 1000 случайных выборок. Достоверно установленными узлами считали те, для которых значение индекса бутстрэпа превышает 70%.
Молекулярно-биологические и иммунодиагностические методы
Анализ клинических проявлений позволил установить, что в 94,9 % зарегистрированных случаев заболевание протекало без симптоматики поражения ЦНС, в 5,1 % случаев присутствовали менингиальные симптомы, различной степени выраженности. По степени тяжести процентное соотношение составило: 74,2% случаев средней тяжести; 20,7% случаев было отнесено к легкой форме клинического течения; и 5,1% больных были с тяжелыми клиническими симптомами поражения ЦНС, из которых 5 человек умерли. Основными причинами летального исхода заболевания являлись позднее обращение за медицинской помощью, пожилой возраст и наличие у пациентов сопутствующих заболеваний.
Сравнительный клинико-эпидемиологический анализ заболеваемости ЛЗН в Волгоградской области и за последние десятилетие, начиная с 1999 г., позволяет выявить определенные эпидемиологические особенности. К ним можно отнести, в первую очередь, интенсивность эпидемических вспышек в определенные годы, с вышеотмеченными пиками заболеваемости (таблица 2). Четко прослеживается и выраженная сезонность, с максимумом заболевания людей в августе-сентябре (рисунок 16). Ярко выражена и территориальная неоднородность распределения заболеваний, с преимущественным поражением городского населения (рисунок 16, таблица 3). Таблица 2. Количество лабораторно подтвержденных случаев ЛЗН за 1999 – 2010 годы по Волгоградской области.
При проведении эпидемиологического анализа случаев заболевания людей ЛЗН было установлено, что подавляющее большинство заболевших отмечали наличие комаров на дачных участках, а также в местах отдыха и рыбной ловли, а для сельских жителей по месту их жительства. При рассмотрении основных причин и условий заражения ВЗН было установлено, что около половины заболевших (44 %) находились большую часть времени или сезонно на своих дачных участках за пределами города. Контакту с комарами были подвержены 41 % больных при посещении природных и загородных рекреационных зон. 15 %, относящиеся к жителям районов области, также указывали на укусы комаров (рисунок 17).
По результатам проведенного в 1999 г. скринингового исследования сывороток крови доноров в городах Волгограде и Волжском установлено, что в 10,9% у жителей этих городов наблюдается положительная сероконверсия, в то время как антитела к возбудителю ЛЗН у жителей сельских районов были найдены в 5,8% случаев. Данный факт дает возможность предположить, что истинные масштабы вспышки были гораздо выше регистрируемой заболеваемости в 1999 году. Таким образом, можно сделать вывод о том, что в эпидемический процесс активнее вовлекается городское население.
К эпидемиологическим особенностям заболеваемости ЛЗН на территории Волгоградской области можно отнести и особенности возрастной структуры заболевших. Она характеризуется заболеванием преимущественно лиц пожилого возраста, с высоким процентом нейроинвазивных форм и летальных исходов, обусловленных тяжёлым течением болезни, преимущественно за счет развития менингоэнцефалитов (таблица 4). В возрастной структуре заболевших доминирует группа 50-59 лет, 70 и старше, при этом летальный исход в 80% зарегистрирован именно в этой возрастной категории. Однако, при сравнении вспышек ЛЗН 2007, 2010, 2011 и 2012 г.г. выявлен рост числа больных в возрасте 20-29 лет, а также увеличение значений в категориях 30-39, 40-49 лет (рисунок 18).
Анализ заболеваемости позволил выделить основные категории лиц, подвергающихся наибольшему риску заражения ЛЗН (таблица 5). Из общего числа больных превалирует группа пенсионеров, которые значительную часть времени проводили на дачных участках. Другие социально-профессиональные группы вовлекались в эпидемический процесс в разной степени активности, но ни одна из них не имела определяющего значения (рисунок 19). Таким образом, можно выделить основные группы риска заражения ВЗН. Первая категория – пенсионеры, затем рабочие служащие, а также неработающие лица, которые активно посещают дачные участки, природные и рекреационные зоны, к третьей группе можно отнести остальные категории граждан. Анализ структуры больных ЛЗН Волгоградской области по половому признаку показал, что из общего числа заболевших ЛЗН в 1999 году было 199(52,3 %) мужчин и 181(47,7 %) женщин.
Долевое распределение различных категорий граждан по принадлежности к «группам риска». Существенной роли полового распределения при определении групп риска не удалось выявить и в 2000 году, из 32 зарегистрированных случаев соотношение больных мужчин и женщин составило 15 (46,9%) и 17 (53, 1 %) соответственно. В последующие годы наблюдалось примерно такое же соотношение полов. В 2009 этот показатель составлял мужчины/женщины – 44%/56%, в 2010 г. – 55,2%/44,8%.
После вспышки ЛЗН в 2010 году заболеваемость пошла на относительный спад и в 2011 году был зарегистрирован 61 случай заболевания ЛЗН (рисунок 20). Доминирующим по количеству зарегистрированных больных остался город Волгоград. Причем наиболее неблагополучными оказались Красноармейский, Советский, Дзержинский районы города и Городищенский район (рисунок 21).
Рисунок 21. Картограмма заболеваемости ЛЗН по районам города Волгограда в 2011 году. К отличительным особенностям вспышки 2011 года можно отнести относительно не высокое значение количества нейроинвазивных форм течения заболевания (3,3 %). Произошло увеличение доли больных в группе до 50 лет (50, 3 % в 2011 году, тогда как в 2010 это значение составляло 15,2 %), причем данная тенденция наблюдалась на всей территории РФ (в 2011 году заболевшие до 50 лет составляли 58,6%, в 2010 - только 3,8%). Отмечено изменение мест и условий инфицирования. Основная часть заболевших в 2011 году заразилась по месту проживания в сельской местности (31,5 %), в то время как на дачных участках заразилось 8,1 %, по сравнению с 2010 годом (42,2 %). Были отмечены и случаи заражения при выезде за территорию Волгоградской области. В остальном эпидемиологическая картина 2011 года была схожа со вспышкой ЛЗН в 2010 году.
В 2012 году на территории Волгоградской области зарегистрировано 210 случаев заболеваний лихорадкой Западного Нила, причем показатель заболеваемости на 100 тысяч населения составлял уже около 8,0 случаев по сравнению с 2,3 в 2011 году. В городе Волгограде было зарегистрировано 144 случая (68,6%), а оставшиеся 66 случаев распределились по муниципальным районам области (31,4%). Первый случай ЛЗН был зарегистрирован 5 июля, а последний 24 сентября. Также было зафиксировано 4 случая с летальным исходом (г. Волгоград - 2, г. Волжский -1, Среднеахтубинский район -1). Таким образом, летальность составила 1,9 %.
Пространственный эпидемиологический анализ территории Волгоградской области, отражающий степень риска заражением ЛЗН
Широкое географическое распространение, видовое многообразие представителей, полиморфизм клинических проявлений, вариабельность и пластичность генетической структуры арбовирусных инфекций, обилие факторов, оказывающих влияние на показатели заболеваемости, по-прежнему обуславливают пристальное внимание к арбовирусам со стороны и медицинской науки и здравоохранения во всем мире. Представители арбовирусных инфекций нередко выступали в качестве инфекционных агентов, вызывающих эпидемии, сопровождающиеся тяжелым заболеванием среди людей, не редко с летальным исходом, и животных, многие из которых могут являться резервуаром поддерживающим циркуляцию вирусов в окружающей среде [3, 10, 11, 45].
Наиболее значимым представителем данных инфекций для Волгоградской области является возбудитель ЛЗН. Впервые на территории Российской федерации ВЗН был детектирован на территории Астраханской области в 1967 году. В 50 % случаев клиническая картина течения заболевания имела форму серозного менингита и менингоэнцефалита [5]. Последующие годы являлись относительно благоприятными и регистрировалась незначительная заболеваемость. Начиная с 1997 года, в Волгоградской области был выявлен рост случаев менингитов и менингоэнцефалитов неизвестной этиологии, что стало предвестником крупной вспышки ЛЗН в 1999 году в городах Астрахань и Волгоград, по итогам которой было зафиксировано 380 случаев в Волгограде и 95 – в городе Астрахань. Причем большое количество летальных случаев и частота тяжелых неврологических симптомов свидетельствовали о повышенной нейровирулентности штаммов вируса ЛЗН 1 генотипа, обладающими высокой гомологией с африканскими штаммами. Начало роста заболеваемости в 1999 году было отмечено в начале июня, пик наблюдался в августе и сентябре, с дальнейшим спадом в октябре. Важно отметить, что эти эпидемии оказались идентичными по временным показателям со вспышкой на территории США в
Нью-Йорке. Анализ вспышки в Волгоградской области в 1999 году показал, что центром очага являлись города Волгоград, Волжский и некоторые близлежащие районы (Светлоярский, Городищенский, Среднеахтубинский). Также была выявлена заболеваемость среди населения в Ольховском, Октябрьском, Палласовском и Старополтавском районах. После проведения районирования территорий области были выделены зоны высокой эпидемиологической опасности
С 1999 по 2007 года регистрировались периодические не значительные вспышки заболевания. Можно предположить, что начиная с 2007 года, когда впервые был выделен 2 генотип ВЗН из объектов внешней среды, произошло изменение вирусной активности, и в 2010 году возникла крупнейшая вспышка на территории Волгоградской области, вызванная 2 геновариантом возбудителя ЛЗН. Было зарегистрировано 413 лабораторно зафиксированных случаев, 5 из которых с летальным исходом [37]. Эпидемиологические показатели не имели значительных отклонений от таковых при эпидемических осложнениях 1999 -2007 гг., за исключением существенного снижения тяжелых форм заболевания и уменьшения количества клинических проявлений, связанных с поражением ЦНС и как следствие снижение процента летальных исходов, что может быть связано с генотипической принадлежностью штаммов ВЗН, обусловивших рост заболеваемости. Кроме этого, наибольшее количество случаев ЛЗН наблюдалось в возрастных категориях 20-59 лет. К отличительным особенностям вспышки 2011 года можно отнести относительно постоянное значение количества нейроинвазивных форм течения заболевания (3,3 %). Отмечено изменение мест и условий инфицирования. В остальном эпидемиологическая картина 2011 года была схожа со вспышкой ЛЗН в 2010 году. В 2012 году на территории Волгоградской области зарегистрировано уже 210 случаев заболеваний лихорадкой Западного Нила, причем количество случаев 100 заболевания на 100 тысяч населения составляло уже около 8,0 случаев по сравнению с 2,3 в 2011 году.
Природно-климатические особенности Волгоградской области
способствуют проникновению ВЗН и амплификации вируса во внешней среде. Климат Волгоградской области засушливый, с резко выраженной континентальностью. В северо-западной части преобладают лесостепные зоны, в восточной части доминируют полупустынные зоны, постепенно переходящие к настоящим пустынным территориям. Среднегодовое количество осадков составляет до 500 мм. Температурный максимум тепла обычно наблюдается в июле-августе и составляет до +44 C. Температурный фактор является основополагающим для быстрого роста численности, развития и амплификации вируса в организме орнитофильных комаров обитающих на территории Волгоградской области, представленных 3 родами – Aedes, Anopheles, и Culex. Скорость размножения вируса в слюнных железах линейно возрастает с увеличением температуры [98, 134, 144]. Необходимое количество вируса для инфицирования человека через укус при 30 C накапливается через 11 суток.
В циркуляцию ВЗН в Волгоградском регионе вовлекается широкий круг птиц водного, околоводного и наземного комплексов, а большое количество водоемов различного размера, обеспечивают благоприятную среду не только для пролета и гнездования птиц, но и для выплода комаров. Наиболее значимыми узлами концентрации мигрирующих и гнездящихся птиц в регионе являются Волго-Ахтубинское междуречье и Сарпинские озера, Эльтонско-Булухтинское «бутылочное горлышко», Щербаковско-Ерусланский узел, а также Средне-Донская излучина. Волго-Ахтубинский и Средне-Донской узлы концентрации птиц являются ключевыми при миграции птиц для Волгоградского региона, эти экосистемы замыкают восточную и западную окраины Волго-Донского перешейка, где проходит тесное сближение двух разных миграционных потоков птиц.
