Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Таксономия и биологические свойства молликут, актуальные аспекты эпидемиологической и лабораторной диагностики, вызываемых ими заболеваний у человека (обзор литературы) 10
1.1. Характеристика класса молликут 10
1.1.1. Таксономия и филогения 10
1.1.2. Морфология и структурная организация 13
1.2. Эпидемиология заболеваний, вызванных молликутами 16
1.3. Заболевания, ассоциированные с генитальными микоплазмами 19
1.3.1. Влияние урогенитальных микоплазм на течение беременности и родов 19
1.3.2. Влияние микоплазм и уреаплазм на состояние влагалища 21
1.4. Методы лабораторной диагностики заболеваний, вызываемых представителями класса молликут 24
1.4.1. Серологические методы 24
1.4.2. ГЩР-диагностика 26
1.4.3. Культуральные и биохимические свойства 28
1.4.4 Определение чувствительности к антибиотикам 33
1.5. Антибиотикорезистентность молликут 35
ГЛАВА 2. Материалы и методы 38
2.1. Объем исследованного материала 38
2.2. Эпидемиологические методы 41
2.3. Бактериологические методы 42
2.4. Молекулярно-генетические методы 46
2.5. Статистические методы 47
ГЛАВА 3. Эпидемиология инфекций, ассоциированных с уреаплазмами и микоплазмами 48
3.1 Заболеваемость микоплазмозами и уреаплазмозами в г.Омске 48
3.2. Особенности эпидемического процесса уреа - и микоплазмозг у женщин 51
3.2.1. Видовой состав выделенных молликут 55
3.2.2. Показатели частоты обнаружения молликут в различных группах женщин 57
3.2.3. Количественная характеристика выделенных урогенитальны микоплазм в различных группах женщин 58
3.2.4. Факторы риска развития инфекций, ассоциированных с уреаплазмами и микоплазмами 64
3.3. Влияние факторов риска, связанных с половым поведением, на состояние микробиоценоза влагалища 66
ГЛАВА 4. Совершенствование микробиологической диагностики урогенитальных микоплазм 75
4.1. Совершенствование алгоритма культивирования и диагностики микоплазм 75
4.1.1. Особенности взятия и посева и сохранения материала 75
4.1.2. Особенности трактовки результатов культивирования микоплазм ... 77
4.1.3. Алгоритм исследования 80
4.2. Изучение антибиотикочувствительности штаммов уреаплазм и микоплазм выделенных от пациенток учреждений акушерско-гинекологической помощи женщинам на территории г.Омска 84
4.2.1 Актуальность вопроса 84
4.2.2. Собственные исследования 86
4.3. Теоретическое обоснование необходимости разработки нового комплекта для определения чувствительности урогенитальных микоплазм к антибиотикам новых поколений. Подбор МИК для антибиотиков. Работа по апробации набора 92
4.4. Разработка усовершенствованной среды с улучшенными ингибирующими свойствами 4.4.1. Экспериментальное обоснование создания усовершенствованной среды для индикации микоплазм и уреаплазм 94
4.4.2. Результаты экспериментальной проверки модифицированных питательных сред 97
ГЛАВА 5. Вопросы организации эпиднадзора за урогенитальными инфекциями, ассоциированными с уреаплазмами и микоплазмами 101
Заключение 108
Выводы 113
Список литературы 115
- Влияние урогенитальных микоплазм на течение беременности и родов
- Количественная характеристика выделенных урогенитальны микоплазм в различных группах женщин
- Особенности трактовки результатов культивирования микоплазм
- Экспериментальное обоснование создания усовершенствованной среды для индикации микоплазм и уреаплазм
Введение к работе
В последние годы среди женщин многих стран мира отмечается рост урогенитальных инфекций. В структуре данной патологии наряду с увеличением встречаемости возбудителей «классических» инфекций, передаваемых половым путем (ИШШ), возрастает удельный вес заболеваний, вызванных микроорганизмами резидентной флоры, в т.ч. урогенитальные уреа- и микоплазмозы составляют от 10 до 50 % по данным разных авторов (ПухнерА.Ф., Козлова В.И., 1998; Дмитриев Г.А., 2003). Возрастанию интереса к этой группе инфекций способствовало более подробное изучение клинико-патогенетических особенностей действия микоплазм, в частности их влияние на репродуктивную, менструальную, половую функции женского организма, что определяет высокую социальную значимость данной проблемы.
До настоящего времени остается актуальной проблема повышения эффективности лабораторной диагностики этих инфекций.
В большинстве случаев диагностика и лечение основываются на
выявлении основного возбудителя без учета количественных критериев, не
проводится микробиологический контроль эффективности применяемых
противомикробных средств для лечения (изучение
антибиотикочувствительности).
Недостаточно изучена геновидовая структура штаммов микоплазм и уреаплазм, циркулирующих в Западной Сибири, и их роль в возникновении тех или иных нарушений функций женского организма.
Требует дальнейшего изучения вопрос оценки патогенного потенциала урогенитальных уреа- и микоплазм, которых часть авторов (Кисина В.И. 2001; Гамова Н.А.,2003) относят к условно-патогенным микроорганизмам, другие исследователи (Teylor-Robinson D., 1998; Ильин И.И.,2001) к облигатным патогенам.
Цель исследований
Повышение эффективности эпидемиологического надзора и лабораторной диагностики урогенитальных инфекций, ассоциированных с уреаплазмами и микоплазмами.
Задачи исследования
1. Провести эпидемиологический анализ структуры и
распространенности генитальных микоплазм и уреаплазм в различных
возрастных и социальных группах, оценить их этиологическую роль в
структуре урогенитальной патологии (на примере г. Омска).
2. Усовершенствовать питательные среды и методы культивирования
урогенитальных микоплазм и уреаплазм.
Изучить структуру чувствительности к основным группам применяемых антибиотиков региональных популяций микоплазм и уреаплазм.
Обосновать подходы к эпидемиологическому надзору на региональном уровне и алгоритмы лабораторной диагностики с учетом применения антибиотикограмм для более эффективного лечения больных с урогенитальными инфекциями, ассоциированными с уреаплазмами и микоплазмами
Научная новизна и теоретическая значимость работы Впервые проведено изучение структуры, распространенности и особенностей эпидемического процесса инфекций, ассоциированных с урогенитальными уреа- и микоплазмами, среди различных групп женщин по результатам микробиологических и молекулярно-генетических исследований, анкетирования, данных официальной регистрации.
Впервые, на примере г. Омска, проведена оценка связи (определена степень влияния) между количеством микоплазм в первичных образцах и сопутствующей патологией репродуктивного системы женщины.
Впервые на территории Западной Сибири изучена антибиотикорезистентность выделенных штаммов различных видов Ureaplasma и M.hominis.
На основании полученных данных предложен диагностический алгоритм обследования женщин с целью верификаций инфекций, ассоциированных с уреаплазмами и микоплазмами.
Практическая значимость работы
Разработаны новые питательные среды для индикации и идентификации микоплазм с улучшенными селективными свойствами.
В связи с развитием антибиотикорезистентности и необходимости более эффективного лечения больных с уреамикоплазмозами, разработаны экспериментальные серии нового комплекта для определения чувствительности к 6 антибиотикам современных поколений фторированных хинолонов и макролидов и тетрациклинов (сумамед, рулид, ровамицин, офлоксацин, юнидокс и джозамицин).
Выделены и изучены штаммы U.parvum и U.urealyticum, которые депонированы во Всероссийский музей микоплазменных культур НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.
По результатам исследования разработаны методические рекомендации для врачей и студентов «Лабораторная диагностика инфекций, ассоциированных с уреаплазмами и микоплазмами», которые внедрены в учебный процесс кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ОмГМА.
Получено положительное решение о выдаче патента на изобретение «Способ определения антибиотикочувствительности аэробов» от 28 марта 2006 г. по заявке № 2006109928/13.
На защиту выносятся следующие положения
1. Основные закономерности эпидемического процесса при урогенитальных уреамикоплазмозах в целом схолш с эпидемическими проявлениями при других ИШШ (основные факторы и группы риска). В
этиологической структуре заболеваемости основное значение имеют уреаплазмы, при преобладании распространенности U.parvum.
2. Разработанные питательные среды с улучшенными селективными
свойствами, повышают эффективность индикации и идентификации
молликут и могут быть использованы для повышения эффективности
лабораторной диагностики и мониторинга, циркулирующих штаммов. Рост
заболеваемости уреамикоплазмозами в г.Омске обусловлен
преимущественно улучшением качества лабораторной диагностики.
3. В условиях развития антибиотикорезистентности для более
эффективного лечения больных с уреамикоплазмозами необходим
мониторинг чувствительности урогенитальных микоплазм с учетом
применяемых антибиотиков.
4. Комплексный алгоритм обследования женщин, с учетом данных
анамнеза (отнесение к группе риска), позволяет выявить возбудителей с
наименьшими лабораторными затратами, оптимизирует
микробиологический мониторинг за урогенитальными инфекциями,
ассоциированными с уреа- и микоплазмами, и повышает достоверность
информации, используемой при эпидемиологическом анализе.
Апробация работы
Диссертационная работа апробирована на совместном заседании кафедр эпидемиологии и микробиологии, вирусологии и иммунологии Омской государственной медицинской академии, 2007.
Основные положения диссертации доложены и обсуждены на V межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы здоровья населения Сибири: гигиенические и эпидемиологические аспекты». - Омск, 2004; на Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология - XXI век» -Саратов, 2004.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 6 работ, в том числе 3 - в журналах перечня ВАК.
Объём и структура диссертации. Работа изложена на 135 страницах, содержит 13 таблиц и 19 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, указателя литературы. Библиографический указатель включает 167 работ, в том числе 102 отечественных и 65 иностранных авторов.
Влияние урогенитальных микоплазм на течение беременности и родов
Анализ случаев мертворождения через 1 ч после разрыва плодных мембран ранее 29 недель беременности показал, что угроза преждевременных родов связана с инфекцией, вызванной U. urealyticum. В то же время U. urealyticum редко обнаруживали при прерывании беременности из-за тяжелой преэклампсии или прогрессирующих противопоказаниях со стороны плода [161]. Для определения взаимосвязи между вагинозом, вызванным U. urealyticum и преждевременным разрывом плодных оболочек было проведено рандомизированное исследование. В 29 из 38 случаев преждевременный разрыв плодных оболочек ассоциировался с выявлением U. urealyticum. Это подтверждает,что вагиноз, вызванный U. urealyticum может приводить к преждевременным родам.
Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis - два вида генитальных моликут, штаммы которых чаще всего выделяют в перинатальном периоде и присутствие которых ассоциируется с неблагополучными исходами беременности и родов. Поскольку эти микроорганизмы обладают способностью взаимодействовать с иммунной системой хозяина, они могут усиливать воспаление, стимулируя макрофаги продуцировать фактор некроза опухоли-а (ФНО-а) и индуцибельную синтазу окиси азота. Для подтверждения этой гипотезы клеточную линию макрофагов мышей инфицировали либо U. urealyticum, либо М. hominis; оба вида микоплазм индуцировали продуїщию ФНО-а, которая была зависима от концентрации. Сделан вывод, что как жизнеспособные, так и нежизнеспособные U. urealyticum и М. hominis, способны индуцировать продукцию ФНО-а мышиными макрофагами. Сделано предположение, что заболевания, вызванные микоплазмами в перинатальном периоде, обусловлены продукцией медиаторов воспаления путем взаимодействия этих микроорганизмов с клетками воспаления и что микоплазмы индуцируют (либо служат катализатором) воспалительную реакцию, которая, в свою очередь, приводит к неблагополучным исходам беременности и родов [113].
Имеются работы о выявлении генитальных микоплазм в ткани плаценты, маточных трубах, эндометрии при спонтанных абортах, преждевременных родах, мертворождении. Группа исследователей получила данные о том, что U. urealyticum является важным этиологическим фактором в развитии эндометритов после кесарева сечения [147]. Показано, что уреапазменный хориоамнионит является причиной преждевременных родов. Инфицирование плаценты уреаплазмами в 14 раз повышает риск преждевременных родов [93].
Для изучения возможной роли Mycoplasma genitaliura в развитии эндометрита, анализировали методом ПНР цервикальные образцы и образцы эндометрия. Таким образом было продемонстрировано существование ассоциации между инфекцией, вызванной М. genitalium, и острым эндометритом [105].
Как показали исследования Л.И. Мальцевой, лишь у 11% беременных уреаплазмы и микоплазмы обнаруживались в виде моноинфекции, у подавляющего числа пациенток наблюдалось сочетание уреаплазмоза и микоплазмоза с хламидийной, герпетической или наличие трех этих инфекций одновременно. При всех вариантах микоплазменного и смешанного инфицирования у женщин с отягощенным акушерским анамнезом наблюдались сосудистые, дистрофические, некротические и пролиферативные изменения в плаценте, что приводило к нарушению кровообращения в системе мать-плацента-плод. Характерным осложнением беременности при инфекциях, вызываемых микоплазмами, явилось формирование хронической фетоплацентарной недостаточности, основным пороком развития плода была дисплазия почек различной степени, приводившая к развитию хронического пиелонефрита [54].
Для оценки роли Mycoplasma hominis в качестве патогенного микроорганизма влагалища было проведено проспективное исследование, в котором детально сравнивали анамнез, данные клинического обследования, данные о наличии ИППП и бактериального вагиноза (БВ), результаты исследования материала, полученного тампоном из влагалища на микоплазмы и другие микроорганизмы, а также данные последующего наблюдения за больными с БВ [126]. M. hominis обнаружены во влагалище у женщин, однако при моноинфекции частота выделения и количество этих микроорганизмов у женщин с симптомами достоверно не отличались от женщин без симптомов. Не обнаружено связи между М. hominis и числом лейкоцитов в окрашенных по Граму мазках из влагалища, вне зависимости от того, обнаруживались ли у этих пациенток только М. hominis или у них имелось еще одно ИППП. В данном исследовании не получено доказательств, что М. hominis является у взрослых женщин патогенным микроорганизмом влагалища [126]. Однако по данным В.И. Кисиной и ряда других авторов [12,16,39,87,88] колонизация урогенитального тракта, микоплазмами и уреаплазмами является фактором, существенно влияющим на микроэкологию влагалища.
О наличии влияния уреаплазм на картину микробиоценоза влагалища свидетельствуют данные Е.В. Наумкиной [39,59]. С микробиологической картиной, характерной для бактериального вагиноза (невысокое содержание или отсутствие лактофлоры при замещении ее гарднереллами в ассоциации с облигатными анаэробами различных родов) ассоциировался вид U.parvum - 59,4%, тогда как U.urealyticum лишь в 28,5% случаев. Дрожжеподобные грибы рода Candida, напротив, чаще встречались в ассоциации с U.urealyticum 28,5%, чем с U.parvum 16,2%. Приблизительно в половине случаев (U.parvum - 48,6 %; U.urealyticum 57,1%) высеву уреаплазм обоих видов сопутствовали высокие концентрации факультативно-анаэробных условно-патогенных микроорганизмов. Многие исследователи отмечают, что существует возможность синергидного действия U.urealyticum и Gardnerella vaginalis [13,16].
Количественная характеристика выделенных урогенитальны микоплазм в различных группах женщин
Частота обнаружения у беременных женщин уреаплазм в виде моноинфекции составила 54,7 случаев на 100 женщин, в сравнении с небеременными женщинами 53,2 случаев на сто женщин. В то же время, данный вопрос требует дальнейшего изучения, так как обследованная нами выборка беременных женщин мала и различия между показателями не достоверны. Обращает на себя внимание что, частота обнаружения инфекций, ассоциированных с M.hominis в монокультуре достоверно чаще наблюдалась в группе небеременных женщин 32,3 случаев на 100 женщин в сравнении с беременными 9,4 случаев на 100 женщин (рО.001). Сочетанная инфекция обеими видами встречалась у беременных в 5,6 случаях на 100 женщин, примерно те же показатели зарегистрированы у небеременных женщин 7,5 случаев на сто женщин (р 0,005).
Как показано на диаграмме (рис.7) достоверно чаще М. hominis выделялась от пациенток в низком титре (71,4%), тогда как уреаплазмы выделяли от пациенток чаще в высоком титре (72,4%) (р 0.001), более детальное описание количественных параметров приведено в таблице. Для оценки полученных данных необходимо учитывать, что концентрация уреаплазм и микоплазм выше 10 ЦОЕ/мл считается клинически значимой концентрацией.
С учетом всего вышеизложенного реальная частота обнаружения инфекций, ассоциированных с уреаплазмами на сто женщин (учитывались данные, где концентрация уреаплазм и микоплазм выше 10 4 ЦОЕ/мл) в группе беременных и небеременных составила соответственно 35,8 и 38,9 случаев на сто женщин. Частота обнаружения инфекций, ассоциированных с М. hominis в клинически значимых концентрациях в группе небеременных и беременных составила 2,4 и 9,7случаев на сто женщин соответственно.
При исследовании количественной характеристики возбудителя в более однородных группах беременных и небеременных женщин, были отмечены те же закономерности что и в общей группе всех женщин рис.8, (различия между титрами уреаплазм и микоплазм достоверны рО.001). М. hominis чаще выделяли в низких титрах (75,0%) в группе беременных и 70,0% в группе небеременных. В то же время уреаплазмы чаще выявляли от больных в высоких титрах в группе беременных (65,6%) по сравнению с небеременными женщинами (73,3%).
Нами было проведено дополнительное исследование с целью изучения роли уреаплазм и М. hominis в развитии тех или иных субъективных проявлений заболеваний урогенитальной сферы у женщин, а так же оценки косвенного влияния связи количества (титра) выявленных молликут с симптоматикой у пациенток.
На основании критерия отбора «жалобы» все данные о когорте женщин основной (п=154) и контрольной групп (п=85), были рассортированы в две статистически однородные группы женщин: с симптоматикой (наличием жалоб) и женщин без жалоб, причиной обращения за медицинской помощью последних явился профилактический осмотр. В обеих группах были представлены данные о беременных и небеременных женщинах, так как гравидарный фактор не может влиять на наличие или отсутствие симптоматики у женщины при колонизации влагалища микоплазмами. Это в первую очередь определяется факторами патогенности возбудителя (адгезией, выделением аммиака и других токсичных соединении). Результаты характеристик групп представлены в таблице 5.
Обращает на себя внимание достоверно более высокая (р 0,05) встречаемость уреаплазм в группе пациенток с симптоматикой: 68 пациенток из 99 (68,7%), против 77 пациенток из 140 (55%) в группе женщин без симптомов, а также явно более высокие цифры выявления уреаплазм в больших титрах 56,6 на сто обследованных женщин с жалобами (82,4%) против 35,5 из 100 обследованных женщин без симптомов (63,6%), причем данные в этой группе (с жалобами) отличаются от сравниваемой группы с высокой степенью достоверности (р 0,01). Это, несомненно, свидетельствует о косвенном влиянии присутствия уреаплазм в высокой концентрации на наличие проявлений (наличие субъективных жалоб) и соответственно на состояние репродуктивных органов женщины. С другой стороны, микоплазма (М. hominis) одинаково часто выделяли от группы пациенток без симптомов 17 женщин из 140 и в группе женщин с симптоматикой 11 пациенток из 100. Но интересен факт выделения микоплазм в больших титрах (клинически значимой концентрации) от пациенток без жалоб. Эти данные требуют дальнейшего изучения с учетом характера количественного распределения микоплазм в женской популяции (малая выборка наблюдений (р 0,005)).
Особенности трактовки результатов культивирования микоплазм
Взятие материала лучше производить в пробирки со специальной транспортной средой для урогенитальных микоплазм. Среда содержит антибиотики, препятствующие росту и размножению сопутствующей флоры. Отсутствие в среде лошадиной сыворотки замедляет развитие микоплазм, но препятствует ее контаминации посторонней флорой. Транспортную среду после высева в пробирки со специальными средами для идентификации микоплазм и уреаплазм следует хранить в холодильнике, по крайней мере, 5 суток (гибель культур, постановка антибиотикограммы).
Динамика и скорость роста представителей класса молликут в определенной степени зависит от условий культивирования. Кривая их роста в основном сходна с кривой роста бактерий. Логарифмическая фаза роста самая короткая у ахолеплазм и уреаплазм составляет около 12-14 часов, более длинная у микоплазм. Уреаплазмы имеют очень короткую стационарную фазу и их жизнеспособность резко падает уже через 24, реже -48 часов культивирования, когда может погибнуть большая часть клеток, особенно в плохо забуференной среде. Поэтому продолжительность отдельных фаз роста нужно постоянно контролировать и корректировать в нужную сторону параметры культивирования (температура, рН). Но пробы от больных инкубировали до Зх суток и более, т.к. латентная фаза роста могла затянуться. Большие трудности культивирования возникали с уреаплазмами из-за высокой скорости их роста. Пробирку, изменившую цвет среды с желтого на зеленый сразу же отставляли в холодильник, т. к. резкий сдвиг рН - среды в щелочную сторону и присутствие большого количества аммиака в среде приводили к быстрой гибели уреаплазм. И как следствие этого, возникали трудности при постановке антибиотикограммы и посева на плотные среды. Добавление в среду изменившую цвет, свежей порции питательных веществ в виде доливки питательного бульона, не приводила к существенному повышению «выживаемости» уреаплазм и микоплазм, т.к. рост культуры ингибируется в присутствии ионов аммония, концентрация которых увеличивалась по мере роста культуры
К низким температурам молликуты довольно устойчивы. По нашим данным жизнеспособность бульонных культур сохраняется от 7 до 14 дней при температуре 4С (холодильное отделение бытового холодильника) и даже более 20дней для уреаплазмы при температуре 4С, но скорость роста и накопления микробной биомассы снизилась (изменение цвета среды для культивирования произошло лишь на третьи сутки). Что связано с процессами отмирания микробной биомассы, снижения ее концентрации (титра) в среде. Лишь треть штаммов уреаплазм и микоплазм выживали в течение 2-3 недель при сохранении в низких температурах. Причем штаммы микоплазм лучше сохранялись в холоде, чем штаммы уреаплазм. Для уреаплазм характерен более низкий титр колониеобразующих единиц (КОЕ) в жидкой питательной среде, чем микоплазм, - не более чем 106КОЕ/мл.
По мнению S. Razin et al. [84,142] истинное число клеток уреаплазм в единице объема среды, значительно ниже чем было бы микоплазм при таком же количестве колониеобразующих единиц, так как у микоплазм 1 КОЕ представлена конгломератом нескольких клеток (структурные элементы глобулы и гранулы), в то время как у уреаплазм она обычно соответствует одной клетке.
Жизнеспособность штаммов микоплазм и уреаплазм при замораживании(-18С) у части штаммов при нашем исследовании сохранялась в течение года. Замораживание предпочтительно проводить в определенном режиме (сначала поместить в холодильное отделение 4С на сутки, затем в морозильное отделение -18С), а размораживание - быстро, чтобы предотвратить рекристаллизацию внутриклеточного льда. Повторное замораживание приводило к 100% гибели микоплазм. По данным И.В.Раковской чувствительность клеток микоплазм к замораживанию зависит от состава липидов их мембран и повышается при применении криопротекторов. Микоплазмы и уреаплазмы можно хранить лиофильно -высушенными. Исследования жизнеспособности культур в динамике нами не проводилось. По данным Ш.Разина и Ш. Роттема жизнеспособность молликут сохранялась от 3 до 20 лет. Но нами было замечено, что бульонные культуры, полученные из высушенных штаммов, отличались более низким потенциалом выживаемости в неблагоприятных условиях. Низкая активность культур проявлялась при втором пассаже и более резко проявлялась при проведении антибиотикограммы. В литературе мы не нашли объяснения этого явления, но по всей видимости число жизнеспособных клеток в процессе высушивания падает, за счет снижения активности ферментных систем или способности утилизировать стеролы, возможно нарушается какая либо из структур цитоплазматической мембраны. Считается, что холестерин является стабилизатором мембраны, регулируя степень проницаемости и пластичности мембраны, которая зависит, прежде всего, от температуры. При температуре выше оптимума проницаемость мембраны резко увеличивается [74].
Рост микоплазм в пробирках с жидкой диагностической средой оценивался по трем критериям: 1. Скорость изменения цвета среды. 2. Изменение цвета среды (все оттенки зеленого) 3. Степень мутности среды. Для идентификации уреаплазм ключевым признаком являлось образование аммиака из мочевины. Образующийся аммиак меняет рН среды в щелочную сторону, что легко быть выявлено с помощью индикатора. Это сопровождалось изменением цвета среды с желтого на зеленый, без помутнений в течение 1-2 суток. Утилизация аргинина, ведет к накоплению щелочных продуктов метаболизма. Нормальным для аргининутилизирующих микоплазм считалось, что рост микоплазм сопровождался изменением цвета среды с желтого на зеленый, без помутнений в течение 2-3 суток. Но пробы от больных инкубировали до 4х суток и более, т.к. латентная фаза роста могла затянуться.
Скорость изменения цвета среды - это резкий и быстрый сдвиг рН в щелочную сторону. Он зависит от химических и биологических факторов. Так, нами неоднократно наблюдалось изменение цвета среды сразу или в течение часа после внесения биоматериала. Это могло объясняться присутствием в материале следов соды (неправильный гигиенический туалет женщины перед исследованием) или присутствием в пробирке следов моющих средств, а так же длительным или не правильным хранением транспортной среды (вне холодильника), которое приводило к защелачиванию сред в пробирках при посевах с нее. При действии биологических факторов рН может быстро (в течение 12 часов) меняться из-за наличия в среде контаминирующих микроорганизмов, приводящих к изменению рН. Но цвет среды, как правило, изменялся на интенсивно зеленый с синим оттенком. Чаще это происходило при размножении в среде грамотрицательных бактерий, кокков и грибов. Быстро достигая стационарной фазы, они накапливали большое количество биомассы и имели более крупные размеры клеток, поэтому в среде регистрировалось большее, чем обычно количество КОЕ и в последующие часы среда становилась мутной.
Экспериментальное обоснование создания усовершенствованной среды для индикации микоплазм и уреаплазм
Мутность среды могла регистрироваться в виде крупно хлопчатого агглютината на дне пробирки или диффузного помутнения среды. Причем первый не был связан с качеством взятия и посева биоматериала от пациенток (большое количество эпителия или лейкоцитов), хотя это на первый взгляд можно предположить. В результате анализа данных нами были сформулированы наиболее частые причины ошибок при учете результатов исследования на микоплазмы и уреаплазмы.
Причины ложноположителъных результатов: Вещества химического происхождения, влияющие на рН среды (сода, моющие вещества) Не правильное хранение сред (изменение буферных свойств) Присутствие в материале от больного других представителей класса Mollicutes, способных утилизировать субстраты среды (аргинин и глюкозу) до конечных продуктов с изменением цвета среды, без помутнений. Причины ложноотргщателъных результатов: Трудно или не культивируемые штаммы микоплазм [3,5] Присутствие в материале или среде ингибиторов роста микоплазм: солей тяжелых металлов (консерванты) или антисептиков. Не правильное взятие материала у пациенток. Материал лучше забирать в пролиферативную фазу, т.к. по данным наших наблюдений и данных литературы частота положительных высевов в эту фазу была выше. До начала лечения и местных процедур. Не правильная транспортировка материала в лабораторию (излишнее нагревание проб летом или переохлаждение их зимой).
Вышеприведенные сведения и данные литературного обзора. о патогенных потенциях микоплазм, их связи с заболеваниями мочеполовой сферы и обнаружении этих микроорганизмов у практически здоровых людей позволили нам предложить разработанную нами методику обследования пациенток на урогенитальные микоплазмы с учетом данных анамнеза (рис. 16). Она предусматривает достоверную информацию не только- о качественном составе микоплазм, но и их количественную оценку, а так же изучение чувствительности их к наиболее широко используемым лекарственным препаратам. Конечно такая методика без учета других микробных «ассоциантов» является несколько ущербной. Анализ результатов проведенного нами исследования позволяет рекомендовать следующий алгоритм применения комплексного обследования пациентов пациенток на урогенитальные микоплазмы с учетом данных анамнеза. Он предусматривает информацию не только о качественном составе микоплазм, но и их количественную оценку, а так же изучение чувствительности их к наиболее широко используемым антибактериальным препаратам. Разработанная методика должна в необходимых случаях дополняться анализом других микробных «ассоциантов», участвующих в развитии воспалительных процессов урогенитального тракта. Предлагаемый нами алгоритм исследования в качестве основного предлагает культуральный метод с определением титра микоплазм. В качестве дополнительного или подтверждающего метода предлагается ПЦР, в случаях, когда данные культуральной диагностики остаются сомнительными главным образом из-за присутствия большого количества бактериальной или грибковой флоры.
Следует отметить, что высокая частота обнаружения сочетания мико- и уреаплазм с другими условно-патогенными возбудителями инфекций половой сферы (бактериальный вагиноз, урогенитальный кандидоз, факультативно-анаэробные условно-патогенные микроорганизмы) делает оправданным сочетание исследования на мико-и уреаплазмы с комплексным микробиологическим исследованием отделяемого половых путей, позволяющим выявить вышеперечисленные возбудители с определением их количественного содержания и оценить состояние облигатной микрофлоры.
При первичных посевах клинического материала применяли жидкие аргининовый и мочевинный бульоны с раститровкой (приложение 2). Таким образом, мы добивались количественного определения микоплазм в материале. Просмотр посевов проводили 2 раза в сутки. Инкубировали в термостате 24-48 часов при температуре (37 С. В случаях характерного роста микоплазм в бульоне для дополнительной идентификации возбудителя производили посев на плотные среды для выделения микоплазм различных видов. На поверхность агара наносили 2-3 капли инокулята, не делая штрихового посева. Учет роста проводился ежедневно в течение 10 суток для плотных сред по наличию микроколоний в агаре. В сомнительных или отрицательных случаях целесообразно использовать и подтверждать диагноз молекулярно-генетическими методами. В случае обнаружения микоплазм в большом титре (клинически значимой концентрации) проводили исследование их чувствительности к антибиотикам.
Вопросы диагностики являются наиболее проблематичными в изучении уреа- и микоплазменных инфекций [75,69,85,100]. Несмотря на значительный прогресс в области диагностики урогенитальных инфекций в последние годы, появление новых методологий и целых комплексов детекции возбудителей, питательных сред, распространение и совершенствование ПЦР - диагностики, остается целый ряд нерешенных проблем в этой области. Какой метод более чувствительный? Какой более приемлемый по финансовым затратам? И разработка четкого алгоритма обследования женщины с учетом данных анамнеза (отнесение к группе риска), позволяет выявлять возбудителей с наименьшими производственными и материальными затратами. Это является одной из актуальных задач, направленных на оптимизацию микробиологического мониторинга урогенитальных инфекций, повышение достоверности информации, используемой при эпидемиологическом анализе на уровне функционирования информационно-аналитической системы эпидемиологического надзора.
