Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Пневлюцнстоз и цитомегаловнрусная инфекция как оппортунистические инфекции 12
1.1 Пневмоцистоз: этиология, патогенез, диагностика, эпидемиология, профилактика 15
1.2 Цитомегаловнрусная инфекция: этиология, патогенез, диагностика, эпидемиология, профилактика 28
Глава 2. Материалы и методы 47
2.1 Материалы исследования 47
2.2 Методы исследования 51
2.2.1 Паразитологические методы 51
2.2.2 Вирусологические методы 51
2.2.3 Сероэлидемиологические методы 52
2.2.4 Молекулярно-генетический метод (ПНР) 52
2.2.5 Статистические методы 53
Глава 3. Разработка тест-систем для диагностики пневмоцистоза и цитомегаловирусной инфекции 53
3.1 Моделирование иммунодефицитного состояния и пневмоцистоза у лабораторных животных 54
3.2 Разработка и оценка эффективности тест-систем НРИФ и ИФА для определения антигенов P. carinii и антител классовом и IgG 55
3.3 Разработка и оценка эффективности тест-систем НРИФ и ИФА для определения антигенов ЦМВ и антител классов IgM и IgG 62
Глава 4. Эпидемиологическая характеристика пневмоцистоза 66
4.1 Распространение возоудителя пневмоцнстоза среди населения России 66
4.2 Периодичность и сезонность пневмоцнстоза 73
4.3 Пневмоцистоз у лиц с иммунодефицитными состояниями разной природы 80
4.3.1 Пневмоцистоз у ВИЧ-инфицированных 80
4.3.2 Пневмоцистоз у больных гемобластозами 83
4.4 Пневмоцистоз в организованных коллективах 86
Глава 5. Эпидемиологическая характеристика цитомегаловируснои инфекции 91
5.1 Распространение ЦМВ среди населения России 91
5.2 Цитомегаловирусная инфекция у лиц с различными иммунодефицитными состояниями 96
5.3 Оппортунистические инфекции в условиях смешанного инфицирования 108
Глава 6. Тактика лабораторной диагностики при эпидемиологическом анализе пневмоцнстоза и цитомегаловирусноиинфекции и рекомендации по их профилактике 111
IV. Заключение 121
V. Выводы 127
VI. Список литературы 130
VII. Приложения 169
- Цитомегаловнрусная инфекция: этиология, патогенез, диагностика, эпидемиология, профилактика
- Разработка и оценка эффективности тест-систем НРИФ и ИФА для определения антигенов P. carinii и антител классовом и IgG
- Распространение возоудителя пневмоцнстоза среди населения России
- Цитомегаловирусная инфекция у лиц с различными иммунодефицитными состояниями
Введение к работе
Актуальность проблемы
Понятие «оппортунистические инфекции», появившееся в медицинской литературе несколько десятилетий назад, приобрело особую значимость в эру пандемии ВИЧ-инфекции и СПИДа. За последние годы отмечен значительный рост числа лиц с иммунодефицитными состояниями различной природы, что позволяет говорить о формировании «популяци-онных иммунодефицитов». В современных условиях причины возникновения иммунодефицитов могут быть различными: соматические или инфекционные (в том числе и ВИЧ-инфекция) заболевания, нарушения экологической и радиационной обстановки, социально-экономическая нестабильность, стрессы, наркомания и др. На этом фоне могут происходить существенные изменения эпидемиологических закономерностей многих инфекционных заболеваний, в том числе и оппортунистических инфекций (ОИ) (51,59,198,256). Поэтому изучение основных эпидемиологических особенностей ОИ в современных условиях является весьма актуальным для выработки адекватной тактики противоэпидемических и профилактических мероприятий. К оппортунистическим инфекциям принято относить такие, которые проявляются в виде клинически манифестных заболеваний главным образом у пациентов с иммунодефицитами той или иной природы (53). При этом возбудителями ОИ могут быть инфекционные агенты различной природы (бактерии, микоплазмы, грибы, простейшие, хламидии, вирусы), как хорошо известные ранее, так и вновь открытые (62,72). Заболевания, возникающие на терминальной стадии ВИЧ-инфекции (СПИД), представлены более узким перечнем, их принято обозначать как «СПИД-ассоциированные заболевания». Из всех ОИ, по заключению ВОЗ, 23 отнесены к СПИД-ассоциированным заболеваниям, 18 из которых являются инфекциями, а 5 - новообразованиями (6).
Пневмоцистоз относится к часто встречающимся ОН при ВІГЧ-инфекции, цитомегаловирусная инфекция (ЦМВИ) также часто возникает у ВИЧ-инфицированнных, при этом она может служить причиной смерти у 20% больных СПИДом лиц (7, 70). В начале 90-х годов XX столетия среди взрослого населения преобладающим путем передачи возбудителей ВИЧ-инфекции и ЦМВИ считался половой, реализуемый как среди гомосексуалистов, так и среди гетеросексуалов. По данным различных авторов специфические к ЦМВ антитела класса IgM, являющиеся маркерами «свежего» инфицирования, были обнаружены у 90% гомосексуалистов и у 45% гетеросексуалов, что свидетельствует о высокой степени инфицирования этих групп ЦМВ (156).
За последние годы доказано важное значение артифициального меха низма передачи возбудителей ВИЧ-инфекции и ЦМВИ, который реализу ется при переливании крови и ее компонентов, парэнтеральных медицинских лечебных или диагностических вмешательствах, пересадке органов и тканей, а также при инъекционной наркомании. В мире, в том числе и в России, время инъекционных наркоманов неуклонно уве- личивается. В нашей стране оно достигает уже трех миллионов (4,33,35,36). Такие данные настораживают и позволяют ожидать значительного увеличения числа инфицированных как ВИЧ, так и ЦМВ. Известно, что ЦМВ является также причиной внутриутробной . и перинатальной патологии, вызывая тяжелые поражения плода (38,55,64).
Эпидемиология пневмоцистоза и ЦМВИ за последние десятилетия претерпела существенные изменения, что важно учитывать при разработке тактики противоэпидемических и профилактических мероприятий, а также системы эпидемиологического надзора за этими инфекциями. Эпидемиологический мониторинг за этими инфекциями невозможен без широкого использования методов их лабораторной диагностики, поскольку клиническая дифференциальная диагностика затруднена из-за сходства симптома- тики, а официальный статистический учет заболеваемости пока не осуществляется.
Цель настоящей работы - изучение эпидемиологических особенностей актуальных оппортунистических инфекций - пневмоцистоза и ЦМВИ - на основе применения комплекса современных методов лабораторной диагностики.
Задачи исследования:
Разработать адекватные стандартизованные тест-системы на основе иммунофлюоресцентных и иммуноферментных методов для диагностики пневмоцистоза и ЦМВИ;
С использованием этих тест-систем оценить широту распространения возбудителей этих инфекций среди населения разных территорий России;
Определить значение этих инфекций в патологии у лиц с имму-нодефицитными состояниями разной природы (в том числе - у ВИЧ-инфицированных, больных злокачественными заболеваниями крови);
Выявить эпидемиологическую значимость групп риска в отношении инфицирования возбудителями пневмоцистоза и ЦМВИ,
На основании результатов комплексных исследований разработать алгоритм лабораторной диагностики пневмоцистоза и ЦМВИ;
Выработать тактику противоэпидемических и профилактических мероприятий в отношении пневмоцистоза и ЦМВИ.
Научная новизна:
Разработаны стандартизованные диагностические тест-системы на основе иммунофлюоресцентного и иммуноферментного методов для выявления антител разных классов иммуноглобулинов к возбудителям пневмоцистоза и ЦМВИ, а также их антигенов, доступные и пригодные для использования при массовых обследованиях населения;
Впервые установлено широкое распространение возбудителей пневмоцистоза и ЦМВИ среди детского .. и взрослого ч ~ ' населения разных городов России, в том числе в условиях смешанного инфицирования (42,1%);
Впервые доказано развитие пневмоцистоза не только у ослабленных детей первого года жизни, как это считалось ранее, но и у детей более старшего возраста, а также у подростков и взрослых, что свидетельствует о существенном изменении возрастной структуры заболевших пневмоцистозом;
Обоснована необходимость мониторинга за лицами с иммуноде-фицитами разной природы (ВИЧ-инфицированные, больные гемо-бластозами, наркоманы и пр.) с целью своевременного осуществления профилактических и лечебных мероприятий;
Показано значение ЦМВ в формировании акушерской и перинатальной патологии: невынашивание плода, преждевременные роды, мертворождение, а также пневмонии, нарушения слуха и зрения, пороки ЦНС и др. у новорожденных;
Выявлены не известные ранее закономерности распространения явных и скрытых форм пневмоцистоза в детских организованных коллективах закрытого и открытого типа, а также в организованных коллективах взрослых закрытого типа и определены причины, приводящие к возникновению этих заболеваний;
Разработаны алгоритмы лабораторной диагностики пневмоцистоза и ЦМВИ с использованием современных методов (РИФ и И ФА), для их применения в широкой эпидемиологической практике.
Практическая значимость
Впервые разработаны стандартизованные диагностические тест-системы для определения антител к P. carmii классов IgM и IgG методами иммуноферментного анализа, которые подготовлены для экспериментального производства. Указанные диагн ости кумы выпускаются малыми сериями ЗАО «НИАРМЕДИК+» («Пневмоцисто Скрин»).
Впервые разработаны иммунофлюоресцентные тест-системы для определения антител к P. carinii классов IgM и IgG и пневмоцист в разных стадий развития.
Разработаны новые иммуноферментные тест-системы для определения антител к ЦМВ классов IgG и IgM, а также тест-системы НРИФ для выявления указанных антител, а также суммарных (ранних и поздних) антигенов ЦМВ,
Созданные тест-системы апробированы в клинических и эпидемиологических исследованиях на базе 1-й инфекционной больницы г. Москвы, и отделения СПИД 2-й инфекционной больницы г. Москвы, Гематологического научного центра РАМН, Центров по борьбе со СПИДом гг. Казани и Омска, Центра лабораторной диагностики при Омской государственной медицинской академии.
По результатам наших исследований изданы следующие методические материалы: методические рекомендации «Лабораторная диагностика ЦМВ-заболеваний глаз у детей с помощью реакции бласттрансформации (РБТ) лимфоцитов крови» (утверждены МЗ СССР, 1986г.); «Пневмоцистоз - эпидемиология, клиника, диагностика и лечение» (утверждены Комитетом Здравоохранения Правительства Москвы, 1999г.) и «Цитомегалови-русная инфекция - эпидемиология, профилактика и лечение» (утверждены Комитетом Здравоохранения Правительства г. Москвы, 2001г.), методическое пособие «Диагностика поражений легких при острой дыхательной недостаточности у больных с депрессиями кроветворения» (утверждено Комитетом Здравоохранения при МЗ РФ, 2001г.). Указанные документы подготовлены совместно со специалистами ШШ глазных болезней им. Гедьмгольца, Гематологического научного центра РАМН, 1-й клинической инфекционной больницы г. Москвы.
Различные фрагменты диссертации используются при чтении курсов лекций на кафедрах: микробиологии, вирусологии и иммунологии Медицинской академии им. И.М. Сеченова; инфектологии последипломного образования Московской Медицинской академии им. И.М. Сеченова; эпидемиологии РМАПО; тропических и паразитарных болезней РМАПО, акушерства и гинекологии факультета усовершенствования врачей Омской государственной медицинской академии.
Получено 3 патента: «Штамм цитомегаловируса «Весна» Cytomegalovirus hominis, используемый для диагностики ЦМВИ» № 769889; «Способ диагностики воспалительных заболеваний заднего отрезка глаз у детей с подозрением на ретинобластому» № 2077726; «Способ выделения пневмоцист» № 2186390,
Получено 2 авторских свидетельства: «Способ диагностики ЦМВ-хориоретинитов и увеитов у детей» № 971317 и «Способ получения биомассы P. carinii» № 168599.
Апробация работы
Диссертации обсуждена 8 апреля 2002г. на совместной научной конференции отделов эпидемиологии, медицинской микробиологии, природ-ноочаговых инфекций, иммунологии ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.
Материалы диссертации доложены на 24 Международных и Всероссийских симпозиумах, конгрессах^ конференциях: X Международная конференция по СПИДу (Япония, Йокогама, 1994г.), III Международная конференция по СПИДу в Азии (Таиланд, 1995г.), 3-я и 4-я Международные конференции «СПИД, рак и родственные проблемы» (Санкт-
Петербург, 1995г., 1996г.), XI Международная конференция по СПИДу (Канада, Ванкувер, 1996г.), X Международный конгресс по вирусологии (Израиль, Иерусалим, 1996г.), 8-й Национ&тьный конгресс по болезням органов дыхания. Европейская респираторная школа (Москва, 1998г.), VII Научная конференция Европейского общества химиотерапии инфекционных болезней (Италия, Сорренто, 2000г.), Всероссийская научная конференция «Современные технологии диагностики и терапии инфекционных болезней» (Санкт-Петербург, 1999г.)3 Всероссийская научно-практическая конференция «Внутриутробные инфекции плода и новорожденных» (Саратов, 2000г.) и др.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 58 работ, в том числе, глава «Ци-томе гало в иру с нал инфекция» в руководстве для врачей «Частная эпидемиология» (2002 г.). Структура и объем работы
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов собственных исследований (4 главы), заключения, выводов и библиографического указателя, включающего ссылки на 73 отечественных и 287 иностранных работ. Работа изложена на ($1. страницах машинописного текста, иллюстрирована 14 таблицами и 12 рисунками и содержит 5 приложений.
II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава 1. Пневмоцистоз и ЦМВИ как оппортунистические инфекции
В конце 70-х годов XX века было сообщено о новом заболевании, сопровождающемся развитием выраженного документально подтвержденного Т-клеточного иммунодефицитного состояния, на фоне которого активно проявлялись другие заболевания - пневмоцистоз и саркома Капоши (102), в дальнейшем это заболевание получило название «ВИЧ-инфекция», а фи-н&іьная его стадия - СПИД. Было показано, что с усилением иммуноде- фицита, клиническую картину и тяжесть состояния оольного определяют именно присоединившиеся или активизировавшиеся вторичные заболевания. Они включают в себя оппортунистические инфекции (ОИ) и другие как инфекционные, так и неинфекционные болезни и являются непосредственной причиной гибели больных (47,271). СПИД-ассоциированные заболевания как инфекционные, так и неопластические, вызывают 18 видов возбудителей (Cryptosporidium spp., Toxoplasma gondii, Pneumocystis cari-nii, Isospora belli, Zeishmania nfantum, Acanthamoeba spp., Blastocystis hominis, Strongyloides stercorals, Sarcoptes scabiei, Candida albicans, Crypto-coccus neoformans, Histoplasma capsunis, Herpes simplex, Mycobacterium avium complex, Mycobacterium tuberculosis, Salmonella spp.) (6). В большинстве своем возбудители оппортунистических инфекций являются эндогенными агентами, зачастую условно-патогенными и реактивируются на фоне иммунодефиците в при соматических, инфекционных заболеваниях, а также при антропогенных вмешательствах - лучевой и рентгенотерапии, при использовании антибиотиков широкого спектра действия, цитостати-ков и иммунодепрессантов. Неблагополучная экологическая обстановка, связанная с бурным развитием цивилизации, также способствует снижению иммунитета населения и активизации оппортунистических инфекций (59).
Проявления оппортунистических инфекций зависят от особенностей их возбудителей и от характера и степени дефектов иммунитета. Так, поражения гуморального иммунитета способствуют возникновению бактериальных инфекций, тогда как нарушение Т-клеточного звена иммунитета сопровождается развитием вирусных, протозойных или грибковых инфекций (53, 181).
Пневмоцистоз и цитомегал о вирусная инфекция являются классическими оппортунистическими инфекциями (93,102,152). За последние годы в связи с проблемой ВИЧ-инфекции и СПИДа их актуальность возросла (62,226). Поскольку их возбудители являются представителями разных царств микромира, у них имеются сходства и различия: например, возбудители имеют различные механизмы репликации. Так, если ЦМВ тесно связан с клеткой и весь процесс синтеза и сборки происходит в клетке, то P. carinii внеклеточный паразит и его жизненный цикл происходит в альвеоле.
Известно, что обе инфекции имеют аспирационный и вертикальный пути передачи возбудителей и относятся к антропонозам.
Восприимчивость населения к этим инфекционным агентам достаточно высокая.
Реальная официальная регистрация пневмоцистоза и ЦМВ И и соответствующие статистические данные отсутствуют. Они относятся к неуправляемым инфекциям, так как для них пока не существует эффективных средств воздействия на эпидемический процесс.
Ранее обе эти инфекции относили к «детским», в последние 20 лет они приобрели другое значение в связи с ростом заболеваемости ВИЧ-инфекцией и увеличением числа иммунодефицитов разной природы.
У многих ВИЧ- инфицированных больных возникают пневмонии, вызванные как P. carinii, так и ЦМВ, либо смешанного характера, причиной которых являются оба упомянутых возбудителя (31,234), которые могут оказывать взаимное активизирующее воздействие (268).
Симптоматика пневмоний, вызванных P. carinii и ЦМВ сходная: сухой кашель, одышка, лихорадка, однако, имеются отличия на рентгенограммах, При гшевмоцистной пневмонии видимые участки уплотнения легких перемежаются с участками вздутия - так называемое «ватное» легкое, тогда как при ЦМВ И характерно усиление сосудистого рисунка легкого (13,23,70,182).
Большое значение для распространения этих инфекций имеют такие социальные факторы, как наркомания, сексуальная активность и рост числа лиц нестандартной ориентации, экологический кризис (27,33,35,36).
1.1 Пневмоцнстоз: этиология, патогенез, диагностика, эпидемиология, профилактика
Возбудителем пневмоцистоза является условно-патогенный микроорганизм P. carinii, который впервые был описан в 1909 году Chagas К. в Бразилии и в дальнейшем был выделен и идентифицирован многими учеными в различных странах мира (99,103,139,203,204). Было показано, что этот микроорганизм существует в очень ограниченной среде обитания - в альвеолярных пространствах легких млекопитающих (крыс, морских свинок и других) (140,175,295). Этот возбудитель хорошо сохраняется во внешней среде, так как не теряет активности при перепадах температуры и не гибнет при замораживании и оттаивании; оптимальная РН среды 7,2 -7,4. Инфицированные P. carinii легкие животных можно хранить при -20 С длительное время.
Первые описания интерстициальной плазмоклеточной пневмоиистоз-ной пневмонии были сделаны в Европе во время Второй мировой войны; эта патология наблюдалась у детей-сирот, страдавших от истощения. В 50-х годах уже было отмечено несколько эпидемий пневмоцистоза в странах Центральной Европы (Чехословакии, Югославии и Швейцарии).
В 1991 году в мире было зарегистрировано уже более 100 000 случаев пневмоцистоза. В России и странах СНГ эта инфекция до настоящего времени не учитывается официальной статистикой из-за трудности постановки этиологического диагноза только на основании клинических проявлений и недостаточно широкого внедрения лабораторных методов диагностики в практику. Pneumocystis carinii до конца 80-х годов относили к простейшим, но в 1988 году было сообщение Edman F.C. и соавторов, которые основываясь на молекулярно-биологических исследованиях рибосомальной РНК P. carinii отнесли этот возбудитель к грибам (141,314). Последние работы, опубликованные рядом авторов, позволяют говорить о принадлежности Р. carinii к дрожжеподобным грибам, сходным с патогенами растений (21,87,139,190). Известно, что P. carinii находили практически у всех млекопитающих - лабораторных, домашних и диких животных, поэтому существовало мнение, что возможно аэрогенное заражение людей от больных животных (179,295,324,353). Kucera К. относил пневмоцистную инфекцию к антропозоонозам (242). Позже рядом авторов было показано, что P. carinii, выделенные у животных, не вызывали заболевания у людей, тогда как в эксперименте удалось заразить мышей пневмоцистами, выделенными от людей и крыс (355).
В последние годы выявлены генетическая и фенотипическая неоднородность вида P. carinii, что вызвало необходимость введения триноми-нальной номенклатуры, включающей не только название рода и вида, но и название хозяина на латинском языке (Pneumocystis carinii hominis) (196,260,296,337,352). Pneumocystis carinii hominis передается только от человека к человеку (больного или носителя) и в силу этого пневмоцистоз принято относить к антропонозам (40,68,240,241,354).
Повторные заболевания людей пневмоцистной пневмонией свидетельствуют о нестойком постинфекционном иммунитете к P. carinii. Pneumocystis carinii - внеклеточный эукариот, весь жизненный цикл которого происходит в альвеоле и включает четыре стадии (349): трофозо-ит, прециста, циста, внутрицистные тельца. Размножение паразита сопровождается появлением большого числа трофозоитов - вегетативной формы Pneumocystis carinii величиной 1-5 мкм, одноядерных с 2 слойной тонкой клеточной мембраной. Прецисты размером около 5 мкм имеют овальную форму и толстостенную 3 слойную стенку, представленную трубчатыми включениями, иногда в прецистах можно определить внутрицистные тельца. Толстостенные цисты величиной 6-7 мкм с характерной 3 слойной мембраной содержат четное количество (чаще 8) внутрицистных телец-«спорозоитов». Наличие пневмоцист с максимальным числом спорозоитов свидетельствует об активации возбудителя (212). Полный цикл развития Р, сашш включает две фазы: половую и неполовую. В половой фазе в момент заражения зрелые цисты, попавшие в чувствительный орган, разрываются, высвобождая внутрицистные тельца, часть из которых являются гаплоидами. Они сливаются попарно, образуя трофозоиты, способные развиваться в прецисты и далее в цисты. В неполовой фазе трофозоиты, перетягиваясь, делятся на две клетки, и каждая из них развивается в пневмоцисту. Пневмоцисты обладают выраженным тропизмом к легочной ткани, как уже указывалось, они находятся в просвете альвеол. Некоторые ученые связывают эту закономерность с вероятным присутствием в альвеолах какого-то специфического и необходимого для этого микроорганизма фактора, при этом не исключают, что это может быть кислород (41). Вирулентность этого микроорганизма крайне низкая.
При генерализованной форме паразит может определяться и в других органах больного: желудке, кишечнике, лимфоузлах, щитовидной железе, сердце, почках, печени. Известен случай выделения Р. сагіпіі из среднего уха (317,328). Патогенез внелегочной диссеминации пневмоцист объясняется лимфогенным либо гематогенным распространением и, особенно при применении ингаляционных лечебных препаратов.
Транс плацентарная передача паразита предполагается на основании обнаружения пневмоцист в плаценте у недоношенных детей первых дней жизни и мертворожденных (176).
Однако, основным путем заражения при пневмоцистозе остается аэрогенный. В семейных очагах, где источниками инфекции являлись родители - здоровые носители возбудителя, их ослабленные дети и заболевали пневмоцистными пневмониями. Описаны внутрибольничные заражения детей от медицинского персонала, являющегося носителями пневмоцист, в отделениях для недоношенных, новорожденных, в детских больницах или домах ребенка (19,24,56,196). Возникновению внутрибольничных вспышек пневмоцистоза способствует перевод детей с явлениями интерстициальной пневмонии без установленного этиологического диагноза из отделений но- ворожденных в общие палаты стационаров. Распространение пневмоцист-ной инфекции также может быть связано с нарушением противоэпидемического режима в стационарах; нарушением цикличности заполнения палат и их переуплотнением. Наиболее часто заболевают дети в возрасте 7 - 20 дней в период выраженной физиологической гиппогаммаглобулино-мии (42,289). К факторам риска возникновения заболевания в больнице относят и дефицит полноценного белкового питания. Другой фактор риска, названный авторами «госпиташзм», включает продолжительное лечение антибиотиками и кортикостероидами, дефекты питания и продолжительные контакты с другими больными (166).
Клиническая картина пневмоцистоза может быть разнообразной: от бессимптомных форм до манифестных пневмоний (37,44).
В большинстве случаев встречи человека с возбудителем P. carinii имеет место бессимптомная инфекция, что доказано многими экспериментальными и клиническими исследованиями (25,72,73).
Результаты серологических обследований, проведенных в 1977 году Meuwissen с соавторами, опосредовано подтвердили, что большинство людей перенесло пневмоцистную инфекцию в первые годы жизни, так как более чем у 90% взрослых были определены антитела к P. carinii, а у детей в возрасте до 4-х лет наличие антител наблюдалось уже в 75% (263).
Пневмоцистная пневмония у лиц с иммунодефицитными состояниями как правило развивается не за счет реактивации латентной инфекции, а за счет P. carinii, поступившей из экзогенного источника (37, 107). У детей раннего возраста на протяжении заболевания наблюдаются все периоды развития инфекционного процесса: инкубационный, продромальный, период нарастания симптомов, разгара заболевания, угасания клинических симптомов и выздоровления, тогда как, у подростков пневмоцистоз может протекать в виде бронхолегочного скоротечного заболевания. У взрослых с иммунодефицитным состоянием болезнь развивается быстро и цикличность ее плохо выражена. Случаи пневмоцистоза возникают на протяже- ний всего года и в отношении сезонности этого заболевания нет единого мнения и достоверных эпидемиологических наблюдений.
Ряд исследователей (201,202) считают, что сезонность пневмоцистных пневмоний такая же, как и у других воздушно-капельных инфекций. Пик выявления этого заболевания приходится на февраль - апрель (45 - 59%), минимальное количество диагностируется в августе - сентябре (27 - 31%) (24,26). Румынские исследователи нашли, что число заболевших пневмо-цистозом возрастает в августе - ноябре, с максимум в сентябре (166). Ковалева Е.П. и Васильева В.И. отмечали, что ими наблюдалось сезонное повышение заболеваемости в зимне-весенний период с наибольшим подъемом в период с декабря по май (19, 42,56,73).
Данные о периодичности пневмоцистоза также весьма ограничены.
После открытия и изучения ВИЧ-инфекции стало очевидным, что пневмоцистоз относится к так называемым оппортунистическим инфекциям и возникает главным образом у пациентов с иммунодефицитными состояниями (290,291).
Гуморальный иммунитет также имеет важное значение в защите организма от заражения P. carinii, однако, уровень антител в крови не коррелирует с тяжестью заболевания. Пневмоцистоз часто развивается у недоношенных детей с белковой недостаточностью, при которой нарушается специфический синтез иммуноглобулинов (166).
Экспериментальные исследования на мышах с выраженным иммунодефицитом, зараженных пневмоцистозам и, показали, что введение специфической гипериммунной сыворотки приводило к снижению числа пневмоцист как на ранней, так и на промежуточной и поздней стадиях заболевания (313).
Наиболее важным, предрасполагающим к пневмоцистному заболеванию фактором является дефект Т-клеточного иммунитета. До начала эпидемии ВИЧ-инфекции случаи пневмоцистной пневмонии регистрировали чаще всего у больных с первичной иммунопатологией либо со вторичной, вызванной медикаментозной иммуносупрессией (294,304,347). Из 194 случаев пневмоцистной пневмонии, опубликованных CDC (США) в 1967 -1970 гг., 29 были отмечены у детей в возрасте до 1 года, у 83% из которых наблюдалась иммунопатология разного генеза, а также у детей старше 1 года острым лимфобластным лейкозом.
Обследование детей со злокачественными новообразованиями (1251 ребенок) в педиатрическом стационаре в США (1962 - 1971гг.) выявило пнвмоцистную пневмонию у 4,1%, тогда как в группе сравнения (1669 детей без злокачественных образований и иммунодепрессивных состояний) не было отмечено ни одного случая пневмоцистных пневмоний (293).
Пневмоцистоз в настоящее время признан одной из ведущих СПИД-ас с ошшрованных инфекций. Основная масса всех случаев пнев моцистных пневмоний приходится на больных СПИДом (39,41,51,114,205,250,251,284). Паразитологическими методами пневмоци стоз подтверждается у 60% больных СПИДом. Показано, что P.carinii по ражает до 70% детей, больных СПИДом.
У большинства больных СПИДом ко времени первого эпизода пневмоцистной пневмонии число СД4+ лимфоцитов составляет от 50 до 75 кл/мм , а в более чем 90% случаев инфекция, вызванная P. carinii развивается при количестве СД4+ менее 200 кл/мкл3. В этой ситуации без применения медикаментозной профилактики риск развития пневмоцистной пневмонии составляет 8,4%, 18,4%, 33,3% в течение 6,12 и 36 месяцев соответственно (39,85,286,333).
Пневмоцистная пневмония является частым осложнением у больных гемобластозами (49%) и реже (4%) - у больных солидными опухолями (4%), что объясняется двумя существенными факторами, связанными с нарушениями иммунитета. С одной стороны, для лимфопролиферативных заболеваний характерно нарушение Т-лимфоцитарного звена иммунитета, а с другой стороны, применение ряда иммуносупрессивных препаратов снижает число Т-хелперов. Использование флюдорабина, подавляющего
Т-лимфоциты и, в частности, СД4 , часто завершается осложнением пневмоцистной пневмонией. Применение циклоспорина и стероидов больным с трансплантированными органами также приводит к развитию пневмоцистной пневмонии (11,294). Неконтролируемое и необоснованное использование больших доз витамина Д и недостаток витамина С, антибиотикотерапия, а также радио- и рентгенотерапия, проводимые без анализа иммунологического статуса больных, могут активизировать пнев-моцистную инфекцию. Достаточно часто выявляется пневмоцистная пневмония у онкологических больных, получающих химиотерапию (293).
У больных алкоголизмом и наркоманией также повышен риск заболевания пневмоцистной пневмонией (72).
В экспериментах на собаках, кроликах, крысах, мышах, обезьянах (169,175,295,324) ыло показано, что длительное применение кортикосте-роидов и кормление пишей, бедной солями калия, при отсутствии витамина С способствует активизации латентной пневмоцистной инфекции (72).
Пневмоцистоз широко распространен практически повсеместно, однако наиболее часто пневмоцистную инфекцию выявляли в США, Канаде, странах Западной Европы.
Имеющиеся данные литературы свидетельствуют о том, что во многих странах мира были сделаны попытки изучить степень распространения пневмоцистоза среди населения с помощью различных методов серологического контроля. Доля лиц с антителами к возбудителю пневмоцистоза колебалась в значительных пределах: от 30% до 83%, что зависело от возраста обследованных, состояния их здоровья, региона проживания и методов определения маркеров пневмоцистоза (12,26,40,104,237,263).
Из-за отсутствия стандартных и неинвазийных методов диагностики прижизненный диагноз пневмоцистоза ставился редко. По этой же причине до наших исследований широкая серо-эпидемиологическая оценка им- муноструктуры населения различных регионов России также оыла не доступна.
Сложность этиологической диагностики пневмоцистоза только на основе клинической картины обосновывает необходимость использования комплекса адекватных лабораторных методов (21).
Паразитологический метод основан на прямом морфологическом выявлении пневмоцист и трофозоитов в биологическом материале (легочной ткани, бронхо-альвеолярном лаваже (БАЛ), индуцированной мокроте (ИМ) (23,92,94,149,238,276,282).
Легочную ткань при жизни получают транс бронхиатьной биопсией с помощью бронхоскопа, что позволяет выявить пнвмоцисты в 66 -98%, однако, этот метод забора материала показан далеко не всем больным (326). Другой способ получения материала возможен при открытой биопсии легкого у больных, которым противопоказано проведение трансбронхиальной биопсии при прогрессирующем течении заболевания. Для патологоанато-мического исследования в течение первых суток после гибели больного приготавливают мазки-отпечатки легкого или мазки из пенистого содержимого альвеол, внутри которых лежат цисты и трофозоиты. В настоящее время в клиниках стали активно исследовать бронхо-альвеолярный лаваж для выявления цист и трофозоитов (23). Более простым методом получения материала для выявления пневмоцист является забор индуцированной мокроты (281).
Для получения материала от детей раннего возраста возможно использовать прямую ларингоскопию без медикаментозной подготовки или метод воспроизведения кашлевого рефлекса путем надавливания на корень языка с последующим забором слизи с помощью тампона.
Из полученного материала готовят мазки, которые окрашивают различными известными методами, такими как : импрегнация метенамин-серебрянным нитратом по Гомори, окраска толуидиновым синим, кристаллическим фиолетовым по Грамму, раствором Шиффа, Гимза (или его мо- дификацией Diff Quik), а также по Романовскому-Гимза (25,54,155,169,232,265,272).
Ряд авторов провели сравнительный анализ методов окраски препаратов для выявления P. carinii и показали, что метод окраски по Diff Quik быстрый и недорогой, который выявляет все стадии цикла развития P. carinii, т.е. трофозоиты, спорозоиты и, в меньшей степени цисты. Недостаток этого метода заключается в том, он дает фоновое окрашивание, особенно в образцах мокроты.
Серебрение по Гомери хоть и считалось «золотым эталоном» (190,234), однако, этот метод не лишен недостатков, занимает много времени, кроме того выявляет только стенки цист.
Модифицированный метод толуидиновым -о- голубым сходен с серебрением и окраской крезилехтвиолетом (25) тем, что выявляет стенки цист и похожие на P. carinii микроорганизмы (155, 238), но окрашивает их в пурпурный цвет. Методика окрашивания более быстрая, чем при серебрении, но в состав красителя входит ряд ядовитых химических веществ, что требует особых мер предосторожности.
Наиболее универсальным для выявления всех форм P. carinii (цист, трофозоитов и спорозоитов) является окраска по методу Романовского -Гимза. Характерным и диагностическим является обнаружение розовых цист, оболочка которых имеет вид прозрачного кольца, а внутри их находятся от 4 до 8 красно-фиолетовых включений. Наличие большого числа трофозоитов говорит об активности инфекционного процесса (212,213).
После получения моноклональных антител к P. carinii за рубежом были разработаны прямой и непрямой методы иммунофлюоресцентного анализа для выявления антигенов P. carinii (95,145,149,160,233,267,278, 308,351,358).
Эти методы обеспечивают быструю идентификацию P. carinii. Mahul В. Amin с соавторами (86), сравнивая методы РИФ на основе монокло-нальных антител и различные морфологические окраски, показали, что чувствительность методов оыла следующей: РИФ - 92%, окраска толуиди-новым синим - 80%, окраска методом Гимза - 76%,
В середине 90-х годов на основе моноклональных антител были разработаны и стали выпускаться за рубежом коммерческие тест-системы для определения антигена P. carinn фирмами «Диагностик Пастер» (Франция) и «Медак диагностика» (Германия).
В последние годы в ряде работ показана возможность выявления пневмоцист методом ГЩР путем амплификации ДНК паразита с прайме-рами митохондриальнои РНК в серии конечных разведений исследуемых материалов. Количественный метод ГЩР - один из наиболее перспективных методов диагностики пневмоцистной инфекции, особенно у новорожденных, когда трудно получить адекватный материал для других методов исследования. (146,247). Применение ПНР также может значительно повысить диагностическую чувствительность исследования мокроты и брон-хоальвеолярного лаважа (213). Так, в одном из исследований было показано, что чувствительность ПЦР для индуцированной мокроты и крови у пациентов с документированной пневмоцистной пневмонией составила 100% по сравнению с 38-53% при окраске толуидиновым синим и иммунофлюоресцентной реакцией. Хотя этот метод пока не стандартизирован, но его результаты хорошо согласуются с результатами, полученными другими методами (219).
Серологические методы проведения скрининговых исследований в эпидемиологии, а также для диагностики пневмоцистной инфекции при невозможности получения бронхоальвеолярного лаважа или индуцированной мокроты у пациента, имеют большое значение (252,321,326).
Основная сложность при разработке тест-систем для серодиагностики состояла в получении очищенного антигена P. carina.
Начиная с 1952 года, в Центральной Европе стати проводить серологические обследования больных с интерстициальными плазмоклеточными пневмониями с использованием реакции связывания комплемента (РСК) (91). Наличие специфических антител было выявлено у 75-95% обследованных лиц.
Обследование медицинского персонала в Европейских центрах, где наблюдались вспышки пневмоцистоза, показал, что около 15% были серо-положительными, что свидетельствовало о вовлечении медперсонала в эпидемиологический процесс пневмоцистоза.
Позже были сообщения о высоком проценте положительных результатов в РСК в сыворотках детей, больных пневмоцистозом (16, 22). Комплементе вязы ваю щи е антитела появились уже в конце второй недели заболевания (233,234,277).
Рядом авторов было показано, что основная сложность при разработке РСК заключалась в том, что использование гипериммунных сывороток, полученных от животных, иммунизированных инфицированной P. carinii легочной тканью, в качестве положительных контролен не давало удовлетворительных результатов. Они пришли к выводу, что необходимо собирать сыворотки от реконвашецентов (216,277,351).
Другой трудностью было отсутствие необходимых количеств антигена для серологических реакций (347).
Источниками антигена P. carinii практически у всех исследователей были легочная ткань человека, погибшего от пневмоцистоза, либо легкие инфицированных крыс (160,214,354).
Шведский ученый Kerstin Е. в 1994 году провел иммунофлюорес-центные исследования, используя в качестве антигена срез легочной ткани человека, погибшего от пневмоцистоза, однако, пришел к выводу о необходимости дополнительной очистки антигена для обеспечения высокой чувствительности и специфичности реакций (237).
Экстрагировать антиген P. carinii из легких человека, полученных при аутопсии, пыташсь многие исследователи. Barta К. с соавторами экстрагировали антигены 96 этиловым спиртом (91,159). Jrovec (232), Kucera (240, 241), Ikai и другие (213,338) получали антиген методом гомогенизации или замораживания и оттаивания. Ікаі высказал предположение, что растворимые антигены, полученные вышеуказанными методами, были трофозоит-ными (213,339). J.Watanabe (356) считает, что трофозоиты являются преобладающей формой возбудителя при пневмонии (>99%) и выявление их более важно, чем цист при патологическом процессе. С другой стороны, многие ученые также проводили сбор цист различными методами: в градиенте плотности сахарозы (277), с проназовым усвоением (272) и на миллипоровых фильтрах (213), коллагеназой и гиалуронидазой (84), затем центрифугировали в градиенте плотности Ficoll Hypaque.
Разработанные многими исследователями подходы для экспериментального получения цист, их очистка позволили перейти к отработке лабораторных методов ИФА и РИФ, и оценке их значения в серодиагностике пневмоцистоза. Авторы пришли к выводу, что ИФА является чувствительным методом для выявления специфических антител и антигеномии при диагностике пневмоцистоза (166,174,176).
Другими авторами (240), при сравнении клинических данных и динамики антителообразования сделан вывод, что антитела класса IgM формируются у детей, больных пневмоцистозом, в течение первых недель заболевания, появление антител класса IgG происходит между 4-й и 6-Й неделями болезни, IgG-антитела, как правило, определяются в период продолжительной болезни в сыворотках реконвалесцентов, а также людей, перенесших эту болезнь несколько месяцев назад. Об активности течения заболевания можно судить по сероконверсии либо по величине титров антител, Выявление антител в P. carinii класса IgG у детей первого года жизни уже считается диагностическим (166).
Профилактике пневмоцистоза среди населения отводится значительная роль (40,250). Она должна проводиться в нескольких направлениях: санитарно-эпидемиологическом и медикаментозном (2,202,239,292,340, 347).
Санитарно-эпидемиологическая профилактика подразумевает ознакомление практических врачей (педиатров, терапевтов, инфекционистов) с путями передачи этой инфекции, с факторами, влияющими на снижение резистентности населения к P. carinii Как было изложено ранее, под этими факторами подразумевается рентгеновское облучение, иммуносупрессив-ная терапия, низкобелковое питание и др. (8,166, 294).
В настоящее время предложено осуществлять первичную и вторичную медикаментозную профилактику.
Первичная профилактика призвана предотвратить пневмоцистоз у еще не болевших людей, но находящихся под риском заболевания. Единого мнения ученых по поводу начала первичной профилактики нет, для большинства основным критерием является снижение числа СД4+ лимфоцитов ниже 200 в мл (253,348), так как пневмоцистная пневмония развивается у взрослых с выраженным иммунодефицитным состоянием.
Вторичная профилактика подразумевает постоянный прием противо-пневмоцистных препаратов после первичного эпизода пневмоцистной инфекции (148,150,203,222,223,257). Несмотря на то, что уже существуют эффективные лекарства, такие как дапсон, триметопримсульфаметоксизол, пентамидин, разработаны схемы приема этих препаратов, ни один из них не обеспечивает абсолютной эрадикации пневмоцист (116,205,253,261). Поэтому на ряду с этими средствами профилактики должны приниматься меры по борьбе с иммунодефицитным состоянием.
Надежды на вак>цин о профилактику сомнительны (71,184).
В ближайшие годы не приходится рассчитывать на разработку проти-вопневмоцисгной вакцины, и не выработана тактика ее применения (216,221).
Система эпидемиологического надзора за пневмоцистной инфекцией практически отсутствуют, ввиду недостаточной изученности многих вопросов эпидемиологии этой инфекции.
1.2 Цитомегаловирусная инфекция: этнология, патогенез, диагностика, эпидемиология, профилактика
Возбудителем этой инфекции является цитомегаловирус человека (Cytomegalovirus Hominis) (ЦМВ) - условно-патогенный микроорганизм, относящийся к семейству герпесвирусов (Herpes virus), подсемейству В-герпесвирусов пятого типа; для него характерен узкий диапазон хозяев и длительный тип репликации (10,129,357). Из большого числа герпетических вирусов возбудителями различных заболеваний человека являются шесть: вирус герпеса I и II типов, вирус ветряной оспы, Эшлтейна-Барр, цитомегало вирус и В-лимфотропный вирус (вирус герпеса VI) (3).
Вирионы ЦМВ человека имеют диаметр около 200 нм и представляют собой двухтяжевые молекулы ДНК, заключенные в нуклеокапсид, окруженный тегументом, покрытым липо протеи дн ой оболочкой. Определение внутренних протеинов имеет большое значение для ранней диагностики ЦМВИ (191,211,309,346). Геном цитомегаловируса человека самый крупный из всех геномов представителей семейства герпесвирусов. Репликация вируса происходит следующим образом. Вирус адсорбируется на клетке с помощью специфических рецепторов; проникает в цитоплазму, где происходит разрушение оболочки; оставшийся капсид продвигается в ядро. В ядре репликация вириона завершается полной сборкой, при выходе из клетки он одевается мембраной (98,113,158,309,334,335,336). Структуры, лишенные сердцевины вируса, не обладают инфекционными свойствами (226).
Вирус способен вызывать продуктивную, абортивную, а также лате нтную формы инфекции (199,206,335). Отдельные штаммы ЦМВ человека обладают онкогенными свойствами, приводя к малигнизации клеток (215,280).
Для этого вируса характерна строгая видовая специфичность (187). Вне организма он размножается в диплоидных эмбриональных кожно-мышечных и легочных клетках человека. Оптимальная РН среды 7,2 - 8,0.
ЦМВ термолабилен: инактивируется при прогревании при 56 С и хранится при +4 С в течение недели, при медленном залюраживании до -20 С его инфекционность теряется. Хранить ЦМВ рекомендуется при -90 С в течение не более двух месяцев, длительное хранение возможно в жидком азоте при-190 С (5,65).
Активность репродукции цитомегавируса зависит от ряда факторов: дозы вируса, путей заражения, возраста пациента, генетических особенностей и состояния иммунитета в момент заражения (10,113,115).
Репликация попавшего в кровь ЦМВ происходит в лейкоцитах и в системе мононуклеарных фагоцитов. Вирус персистирует в лимфоидных органах (188). В данном случае клетки не инактивируют вирус, а наоборот, являются элементами крови и лимфоидных органов, в которых он размножается, делая его недоступным для специфических циркулирующих антител и интерферона, что имеет существенное значение в патогенезе цитомегаловирусного заболевания. Многие вирусные частицы захватываются макрофагами и уничтожаются. Однако часть вирусных частиц, связанных с лейкоцитами, продолжает циркулировать в организме, обуславливая диссеминацию вируса (180,227,249,285).
Важную роль в патогенезе ЦМВ И играет система клеточного иммунитета (122,285). Только при иммунодефицита ом состоянии больного ЦМВИ проявляется яркой клинической картиной (248). Причиной иммунной недостаточности могут быть различные факторы: физиологическая иммунная недостаточность детей раннего возраста, иммунодефицит, обусловленный беременностью, ятрогенными вмешательствами, неблагоприятными экологическими факторами (8,129).
ЦМВИ является одной из ведущих СПИД-ассоциированных инфекций. Она активизируется в В-стадии ВИЧ-инфекции, то есть в период острой инфекции со вторичными заболеваниями (51).
Свойства ЦМВИ, как оппортунистического заболевания, проявляются и в других ситуациях, когда в организме больного возникает Т-клеточный иммунодефицит. Подавление клеточного иммунитета человека может оыть и следствием прямого воздействия цитомегаловируса на Т-лимфоциты (29,138,208,209).
Наиболее значительные изменения выявляются в субпопуляции хел-перов / индукторов, уровни которых падают, в то же время уровни супрес-соров / киллеров увеличиваются. Снижаются соотношения СД4/СДЗ, активность естественных киллеров. Одновременно нарушается регуляция иммунного ответа вследствие повреждения системы интерлейкинов (101,325).
На фоне угнетения иммунного ответа цитомегаловирус током крови разносится в различные органы и системы и адсорбируется на клеточных мембранах эпителия, например слюнных желез (преимущественно околоушных), а вирионы проникают в цитоплазму, индуцируя цитомегаличе-ский метаморфоз клеток (ЦМК) и образование цитомегалов. ЦМВ может персистировать в организме человека пожизненно (20,129).
Однако имеются данные, свидетельствующие, что перс и старую щая ЦМВИ в большинстве случаев не сопровождается нарушениями в составе субпопуляции Т-лимфоцитов (хелперы/супрессоры), характерными для синдрома цитомегаловирус ного мононуклеоза (283).
Хроническая ЦМВИ сопровождается выработкой различных антител (нейтрализующих, комплементсвязывающих, тормозящих гемагглютина-цию, агрегацию тромбоцитов и др.), которые не препятствуют его репродукции в организме.
Таким образом, патогенез различных форм цитомегаловирусной инфекции еще недостаточно изучен. Однако достоверно установлено, что в ряде случаев заболевание развивается в результате активации латентной инфекции на фоне снижения резистентности организма, связанной с им-мунодефицитным состоянием.
Цитомегаловирусная инфекция человека является антропонозом, при котором источником инфекции является больной человек или хронический вирусоноситель. Источник наиоолее опасен в активной фазе первичного инфицирования или в период обострения инфекции.
Механизмы передачи цитомегал о вируса могут быть различными: как естественные - аспирационный, фекально-оральный, прямой так и непрямой контактный, вертикальный, искусственный (артифициальный).
Пути передачи ЦМВ : воздушно-капельный, половой, кон- тактными ероральный, парэнтер&чьный и энтералъный (93,129,135,136,154, 275,302).
Факторами передачи являются: кровь, цервикальный и вагинальный секреты, сперма, женское молоко, слюна. Выделение вируса из организма происходит с мочой, фекалиями, слюной, мокротой и, в незначительных количествах, со слезной жидкостью (319). Заражение может происходить также через донорские кровь, органы и ткани, трансплантируемые реципиентам (75,79,97,98,106,109,110,117,124,130,144,229).
Входными воротами для ЦМВ человека в антенатальном и интрана-тальном периодах может быть плацента и плодные оболочки, в неонаталь-ном и любом возрасте - дыхательные пути, пищеварительный тракт, а также возможно заражение через кровь.
Данные о периодичности и сезонности ЦМВИ пока отсутствуют.
Цитомегал о вирусная инфекция не имеет выраженной цикличности. Инкубационный период и продромы могут пройти стерто в виде острого респираторного заболевания, состояния утомления и слабости. Даже в разгар заболевания может наблюдаться симптоматическое многообразие, что создает большие сложности при клинической диагностике. Для этой инфекции характерно длительное вирусоносительство, иногда хроническое, что, как мы предполагаем, можно объяснить латентной формой вируса, то есть присутствием вируса внутри «нормальной» клетки, по аналогии с он-когенными вирусами, тем более, что отдельные штаммы цитомегаловируса также обладают онкогенными свойствами (18,280).
Латентное носительство вируса приводит к инаппарантной форме течения патологического процесса. В активной форме цитомегаловирус человека способен преодолевать плацентарный барьер и поражать плод в любые сроки беременности, вызывая нарушения, характерные для врожденной инфекции (38,121,126,128,186,316,323).
Наибольшая опасность для плода возникает при первичном заражении женщины, не защищенной специфическими антителами, в первые 20 недель беременности (122,123,124). Американскими авторами установлено, что ежегодно рождались около 0,1% (3-4 тыс.) новорожденных с признаками ЦМВИ, тогда как у 1,0% (30-40 тыс.) инфекция протекала бессимптомно, однако, у 15% из них имелись в дальнейшем осложнения со стороны органов слуха, зрения и ЦНС (161,192,279,297). Полное выявление всех случаев ЦМВИ не происходит в виду трудности ее диагностики (360).
В более поздней работе Smith T.F. (1994) уже было показано, что около 0,2-2,4% всех рожденных детей в США инфицированы ЦМВ. Признаки и симптомы ЦМВИ выявлялись у 5-10% новорожденных с врожденной инфекцией. Смертность новорожденных с клиническими проявлениями ЦМВИ достигала 30%, а у выживших в 90% случаев отмечались неврологические последствия, которые однако могли наблюдаться и у 10% инфицированных детей, не имевших клинических проявлений. У 90-95% детей врожденная ЦМВИ протекала бессимптомно, при этом мог отмечаться более низкий вес при рождении по сравнению с неинфицированными новорожденными (269,329).
В работах последних лет, проведенных отечественными исследователями, в России выявлено 2,3-3,7% новорожденных с внутриутробной ЦМВИ (38,64,67); с помощью ҐЩР выявляли внутриутробную ЦМВИ и в более высоких значениях (34).
Инфицирование в ранние сроки беременности вызывает выкидыш, рождение мертвого плода и острую врожденную инфекцию (58,65).
Установлено, что первичная ЦМВИ встречается у 0,7-6,8% беременных женщин. В 24-50% эти случаи завершаются рождением детей с врожденной ЦМВИ, при этом у большинства младенцев она носит бессимптомный характер (10,89,119,124,188,189,259,303).
Обследование детей с врожденной ЦМВИ выявило у них нарушение гуморального и клеточного иммунитета (29). Было показано, что у этих детей отмечается длительное выделение ЦМВ и низкие уровни специфических антител. У большинства детей выделение вируса из слюны регистрировали в течение 2 лет, а из мочи в течение 5 лет (330).
Трансплацентарная передача цитомегаловируса плоду наиболее убедительно подтверждается выявлением антител класса IgM непосредственно из сыворотки крови пупочного канатика (69, 331).
Рядом авторов было показано, что антитела класса IgM могут быть выявлены у 1 - 1,7% здоровых новорожденных, подтверждая таким образом острую бессимптомную ЦМВИ (76,254).
Русанова Н.Н. с коллегами показали, что частота выявления IgM-антител против ЦМВ у новорожденных изменяется с возрастом от 34% в 3 месяца, достигая максимума в 4 месяца (61%) и снижаясь к 4% в 6 месяцев (55).
Определение у здоровых новорожденных (1%) антител к ЦМВ класса IgG свидетельствует о возможной передаче через плаценту не только ЦМВ, но и материнских IgG антител, в отличие IgM, которые вырабатываются самим плодом. Реактивация хронической ЦМВИ в первой половине беременности является причиной роледенил детей с выраженными симптомами болезни. Doerr H.W. с соавторами наблюдали клинические проявления ЦМВИ у 10-50% инфицированных новорожденных. Врожденная генерализованная ЦМВИ может завершиться летальным исходом (154, 230), либо поражением головного мозга с разнообразными психоневрологическими дефектами развития в дальнейшем (271,341).
Инфицирование во второй половине беременности приводит к хронической врожденной инфекции, выражающейся в поражениях ЦНС, печени, потере слуха и нарушении зрения (118,119,163,220,345). Беременные, у которых вирус находится в латентном состоянии, могут родить детей с ина-парантной, либо умеренно выраженной ЦМВИ, а клинические проявления инфекции обнаруживаются в более поздние сроки (до 2 лет) (318). При условии напряженного иммунитета у ребенка первичное инфицирование ЦМВ может привести к латентной инфекции на протяжении всей его жизни.
Однако у беременных с латентной ЦМВИ плод поражается не всегда, а преимущественна на фоне физиологической иммунодепрессии, либо при заболевании матери другой инфекцией, когда имеет место проникновение ЦМВ в кровь.
Часто ЦМВ является причиной бесплодия; ряд авторов показали, что у женщин, страдающих подобным недугом, в 19,2% выявляются специфические антитела класса IgM (254).
Постаатальное заражение новорожденного протекает, как правило, бессимптомно. Инфицирование новорожденного может иметь место при прохождении через родовые пути матери. Как показано рядом авторов, от 12,5 до 26% детей заражались в процессе родов, причем вирус выделялся у них до 3 месяцев (258, 259). Другим, достаточно часто встречающимся путем заражения новорожденных является вскармливание грудным молоком женщины-вирусоносителя (360). В работах Stagno S. с соавторами и Hayes К. с соавторами выявлено, что у 58% детей, вскормленных молоком матерей, выделявших ЦМВ, развилась цитомегалия, тогда как среди искусственно вскормленных проверенным молоком, заболевших ЦМВИ не наблюдалось (97,136). Инфекция чаще протекала в субклинической форме, так как дети с материнским молоком получали секреторные иммуноглобулины IgA и IgM. На более поздних сроках, когда здоровые дети начинают ходить и посещают детские центры, ясли или сады, они могут контактным путем заразиться от детей с оессимптомной ІДМВИ. В середине 80-х годов в США и Европе были проведены широкие исследования в детских дневных центрах; ЦМВ был изолирован с игрушек и рук; было показано, что он сохраняется на них в течение 30 минут (164,225,231). Schupfer Р.С. с соавторами выделяли ЦМВ из слюны, попавшей на поверхности предметов, в течение 2 часов, а из бумажных пеленок в течение 48 часов (319). Подобные исследования других ученых из Швеции, Канады, США подтвердили эти результаты (77,78,120,121,132,133,171,231). Дети, посещающие детские учреждения, являются источниками инфекции в семьях. Как было выявлено рядом исследователей, 25-80% детей заражаются ЦМВ в детских учреждениях и длительно выделяют его с мочой и слюной, по данным Taber L.H. с соавторами, как минимум 9 месяцев (75). Такие дети могут инфицировать родителей и медицинский персонал. Было показано, что в семьях циркулируют те же штаммы ЦМВ, что и в детских учреждениях, посещаемых обследованными детьми (77,79). Заражение происходит при тесном бытовом контакте (170).
Таким образом могут формироваться множественные очаги инфекции, как в детских учреждениях, так и семейные очаги.
Случайный контакт не всегда может быть причиной передачи вируса. Тем не менее возможно инфицирование человека при прямом контакте -при поцелуе, фактором передачи в этом случае является слюна, в этой связи ЦМВИ ранее называли «болезнью поцелуев». Имеются данные об оральном и воздушно-капельном путях заражения.
Среди взрослого населения ЦМВ передается, в основном, половым и парентеральным путем. Уровень инфицированное населения цитомега-ловирусом очень высок; еще в начале 70-х - середине 80-х годов в индустриально развитых странах он колебался от 56 до 83% (80,106,131,357). В странах третьего мира он был выше - 90 -100%. Серологическое обследование женщин Лимы, Перу выявило 89,1% сероположительных к ЦМВ (90, 322). На Кубе из 220 беременных женщин 1,08% имели свежие IgM ан- титела против ЦМВ, а у новорожденных они были выявлены у 0,8% (86). Обследование беременных женщин Мадагаскара в возрасте 17-30 лет показало серораспространенность ЦМВ в 83% случаев (165).
В России в Омске и Омской области было обследовано 6486 жителей и выявлено, что 76,1% мужчин были серопозитивными к ЦМВ; у женщин IgG антитела к ЦМВ выявлены в 82,2%. В среднем среди городского населения ЦМВ-антитела класса IgG определялись чаще (78,0%), чем среди сельского (70%). Авторы предполагают, что эта разница связана с большей активностью распространения вируса за счет более высокой плотности населения и большей доли лиц с нарушением иммунной системы (14).
Ряд исследователей констатируют прямую зависимость между социально-экономическим уровнем жизни населения и уровнем заболеваемости ЦМВИ. Среди населения с низким уровнем жизни 40-60% лиц инфицируются в возрасте до 5 лет, к 15-19 годам специфические антитела выявляются в 50-88% (14,137,142,143,299).
По данным зарубежных и отечественных исследователей у 3,5-20% практически здоровых женщин из канала шейки матки был выделен ЦМВ; примерно у 30% здоровых мужчин в сперме выявляется вирус цитомега-лии.
Выдумкиной СП. и соавторами были исследованы сыворотки 1312 детей разного возраста и 250 взрослых и показано, что у детей до 1 года антитела к ЦМВ класса IgM встречаются в 1,3% случаев, но в течение года их процент возрастает до 5. 5-6% детей дошкольного и школьного возраста имеют эти ранние вирус специфические антитела. У взрослых частота показателя острой инфекции достигает 15% (9).
В работах зарубежных авторов показано, что частота выявления антител IgM увеличивается с 15% до 63% с возрастом от 20 лет до 60 лет и более соответственно (122,218,262,315).
Многими исследователями показано, что среди лиц, ведущих беспорядочную половую жизнь - проституток, гомосексуалистов и других, - очень высокий процент лиц, имеющих как бессимптомную, так и активную формы ЦМВИ (156,157,300,343). Было выявлено, что среди гомосексуалистов 90% имеют IgM антитела, указывающие на «свежую» инфекцию, а также у 36% можно было выделить ЦМВ из спермы и мочи (131).
В другом исследовании, проведенном учеными Швейцарии, было показано, что среди 150 гомосексуалистов у 74% были выявлены специфические антитела к ЦМВ. Интересно упомянуть, что у инъекционных наркоманов сероположительные в отношении ЦМВ лица составляли 31% (298).
Для России приведенные выше данные актуальны. За последние 5 лет количество лиц, потребляющих наркотики возросло в 3,5 раза и в настоящее время колеблется от 3 до 4 млн. человек. Около 100 тысяч молодых людей состоит на учете наркологической службе МЗ РФ, более 150 тысяч -на учете в системе МВД РФ. Увеличивается число молодых женщин, употребляющих наркотики; за последние 10 лет их число возросло в 10 раз. Среди проституток 25% используют инъекционные наркотики (27,35,36).
Способность цитомегаловируса сохраняться в лейкоцитах приводит с одной стороны к возможности развития ЦМВИ у реципиентов органов, крови и ее компонентов, с другой - к длительному латентному состоянию этой инфекции и проявлению ее активности на фоне лечения цитостатиками и иммунодепрессантами (74,109,130,229).
В работе Courault К. и соавторов из 3458 обследованных доноров у 56,3% были выявлены специфические иммуноглобулины к ЦМВ (125). Wreghitt Tim описал наблюдение с января 1970 года по март 1988 года за 244 пациентами (217 мужчин и 27 женщин) в госпитале Papworth, которым трансплантировали сердце и легкие. У 17,6% из них была выявлена первичная ЦМВ-инфекция, а у 31,1% - реактивация или реинфекция ЦМВ.
Более тяжело заболевание протекало при инфицировании через донорский орган нежели через кровь или ее продукты (248,359).
Показано, что пересадка почки и переливание крови от сероположи-тельного к ЦМВ донора к серонегативному реципиенту приводили к заболеванию цитомегаловирусной инфекцией, тогда как пересадка почки от серонегагивного донора к серонегативному реципиенту не приводила, к ЦМВ-заболеванию (301,332). Sarov Z. и соавторы обнаружили возвратную ЦМВИ у больных с пересаженной почкой, Из 15 пациентов в сыворотках 14 были выявлены ви-русспецифические антитела класса IgA против ЦМВ в интервале от 1 до 12 недель после трансплантации, через 6-12 недель у 6 пациентов были обнаружены антитела класса IgM и 11 больных в промежутке от 3,5 дней до 32 недель из мочи выделяли цитоме гало вирус (147).
Цитомегаловирусная инфекция занимает одно из первых мест в структуре вторичных оппортунистических заболеваний у больных ВИЧ-инфекцией (7,214,228,273). Поражение Т-клеточной защиты, связанное с ВИЧ-инфекцией, допускает реактивацию латентного ЦМВ с последующей виремией и рассеиванием вируса по всем органам (138).
Так Rook R.c соавторами при обследовании органов больных, погибших от ВИЧ-инфекции, в 10 из 17 органов выявили и идентифицировали ЦМВ-инфекцию. Цитомегалические клетки были обнаружены в легких, надпочечниках, кишечнике, ЦНС, печени и пищеводе (153).
Первичная ЦМВИ часто поражает больных СПИДом. У 79% таких больных развивается симптоматическая, прогрессирующая ЦМВ-инфекция, приводящая к различным нарушениям: слепоте, слабоумию и другой неврологической патологии. Развивается ЦМВ-пневмония, почечная недостаточность, неукротимый понос, первичные и вторичные системные васкулиты и другие проявления (60,70).
Цитомегаловирус обладает онкогенными потенциями: его выделяли из опухолей больных саркомой Капоши (181), из злокачественной лимфо- мы (312), карциномы простаты (197,215). ЦМВ был изолирован из рака шейки матки, аденокарциномы толстой кишки и идентифицирован в вирусологических исследованиях в пермиссивных клеточных культурах (194,270,350).
Приведенные данные подтверждают возможную этиологическую роль ЦМВИ в возникновении онкологических заболеваний человека.
Диагностика ЦМВИ, основанная на клинической картине, при многообразии проявлений, крайне затруднена. Многие десятилетия диагноз «ци-томегалия» ставился посмертно на основании патанатомического обнаружения цитомегалических клеток (ЦМК). Только в 1952 году был впервые поставлен прижизненный диагноз с помощью морфологического исследования осадка мочи ребенка и выявления в нем ЦМК (173).
Работы Smith М. G., позволившие идентифицировать ЦМВ человека в электронном микроскопе и в дальнейшем реплицировать его в пермиссивных культурах клеток фибробластов эмбрионального миометрия, открыли путь к дальнейшим разработкам лабораторных диагностических методов (255,327).
Лабораторные методы стали включать три вида исследований: морфологические, культуральные и серологические (244,245,246). Морфологические методы выявляли с помощью цитологического окрашивания гемотоксилином и эозином или азур-эозином ЦМК в слюне, моче, глоточных смывах, спинномозговой жидкости и т.п. пациентов (54,66,82).
Культуральные методы заключались в подсеве 3 дневной культуры лейкоцитов больного к выросшим в пробирках на покровных стеклах пер-миссивным кожно-мышечным или легочным эмбриональным клеткам человека. Полученные пробирки с лейкоцитарными культурами и фибробластами периодически встряхивали и часть культуральной жидкости с попавшими в нее лейкоцитами переносили в другие пробирки с пер-миссивными клеточными культурами. Покровные стекла с лейкоцитарными культурами фиксировали метиловым или этиловым спиртом и окрашивали гематоксилином и эозином или Азур Ш-эозином по Романовскому (65,227,344).
Серологические методы, основанные на выявлении специфических антител и с еро конверсии в крови пациентов, включали реакцию связывания комплемента (РСК), реакцию нейтрализации (РН), реакцию пассивной гемагглютинации (РПГА) и агрегации тромбоцитов (193,207,210,287).
Позже спектр диагностических методов был расширен и усовершенствован, методы стали более специфичными и чувствительными. Лабораторная диагностика стала основываться на различных методах выделения цитомегаловируса, его антигенов, специфических антител, характерных морфологических изменениях, идентификации вирусной ДНК.
Для разработки новых качественных тест-систем необходимо было получить большие количества антигена цитомегаловируса.
В 1980 году нами (Каражас Н.В., Канторович Р. А., Хилько С.Н. и др.) был впервые разработан метод получения специфического антигена ЦМВ с преобладанием белков с молекулярным весом 10-60 KDa и общим содержанием белка 1,36 мг/мл защищенный авторским свидетельством № 9713117.
В 1988 году в США был запатентован способ выделения ЦМВ из культуры клеток, зараженной цитомегаловирусом, и его использование для обнаружения антител против ЦМВ. Антиген выделяли из зараженных клеток культуры крайней плоти человека в присутствии гипертонического раствора (2-3,5 М) неорганических или органических солей (КС1, гуанидин НО, MgCl, NaCl и т.д.). Экстракцию вируса проводили при температуре не выше 30, РН 6-10 (178).
Классическим и наиболее убедительным до сих пор является метод выделения ЦМВ из материалов больных в культуре клеток.
Так Paradis Irvin с соавторами исследовали образцы смывов клеток легких имму но дефицитных лиц, страдающих цитомегаловирусной пневмонией, на наличие ЦМВ. Вирус был изолирован в культуре клеток у
РОССИЙСКАЯ
ГОСУДАРСТВЕННАЯ
БИБЛИОТЕКА
100% больных ЦМВ-пневмонией и у 70% больных пневмонией другой этиологии. С помощью цитологического обследования ЦМВ-включения были обнаружены только у 21% больных ЦМВ-пневмонией.
Эти исследования демонстрируют значительно большую чувствительность вирусологического метода (306).
Однако выделение вируса на клеточных культурах требует обычно нескольких недель наблюдения. Рядом исследователей были предприняты усовершенствования метода для быстрого обнаружения цитомегаловируса в матер налах больных. Crawford Stephen с соавторами нашли, что возможно повышение чувствительности, специфичности и быстроты получения результатов при использовании метода, основанного на подсеве вируссодержащего материала во флаконы с культурами клеток на покровных стеклах, затем центрифугируемых на малых скоростях для оптимизации адсорбции ЦМВ на клетках (307).
Значительно ускоряет получение результатов при диагностике острой ЦМВ-инфекции применение высокочувствительного метода обнаружения прераннего и раннего белков с помощью непрямого иммунофлюоресцент-ного метода с использованием моноклональных антител. Этот метод позволяет обнаружить ранний антиген ЦМВ в материалах больного (моче, слюне и др.) уже через 16-24 часа после внесения его в культуру клеток (177,224,266,305). Сравнительный анализ методов выделения вируса с использованием низкоскоростного центрифугирования при адсорбции на клетках, определения прераннего белка (р72 КД) через 16-20 часов после инфицирования культуры клеток (РИФ) и определения вирусной ДНК методом гибридизации через 5 дней после инфицирования клеток показал, что наиболее чувствительным оказатся метод выявления вирусной ДНК (93,0%), у 51,4% был обнаружен вирусный преранний белок и в 32% случаев установлена репликация ЦМВ по цитопатическому действию (13,100, ,208,311,342).
Цитомег&іовирусная персистирующая инфекция не проявляется клинически, в органах и тканях отсутствуют симптомы воспаления, не наблюдается цитопатнческое действие вируса при внесении его на чувствительные культуры из-за малой инфекционной дозы. Тем не менее в инфицированных клетках с помощью ДНК гибридизации или полимераз-ной цепной реакции (ПЦР) выявляется присутствие вирусной ДНК (111, 144). Только при появлении в организме условий, при которых инфицированная клетка вновь станет пермиссивной, инициируется продуктивная инфекция и будет наблюдаться репликация ЦМВ (183).
Полимеразная цепная реакция - высокочувствительный метод, однако, иногда может осуществляться амплификация ЦМВ-ДНК, полученной из лейкоцитов периферической крови бессимптомных ЦМВ-позитивных пациентов с латентной ЦМВ-инфекцией, и даже ЦМВ-отрицательных лиц. Дальнейшая разработка количественного метода ПЦР, а также подбор праймеров к сверхранним, ранним и поздним генам, обеспечит ведущую роль этого метода в диагностике цито метало вирус ной инфекции человека (143).
Наши соотечественники из Санкт-Петербурга Виноградская Г.Р., Попов С.Д. и др. использовали ПЦР для диагностики ЦМВИ у новорожденных и у детей раннего возраста, для изучения этой инфекции на секционном материале. Они показали, что ПЦР обладает высокой чувствительностью и рекомендовали этот метод для использования в диагностически неясных случаях, в том числе для дифференциальной диагностики с инфекциями, вызванными другими ДНК-содержащими вирусами (20, 45).
При невозможности применения методов выделения вируса или определения вирусных ДНК и РНК, а также в дополнение к ним значительная роль отводится серологическим методам диагностики. Большое значение имеет серодиагностика в эпидемиологических исследованиях.
Современные серологические исследования, помимо РСК, непрямой иммунофлюоресценции, реакции подавления гемагглютинации, латекс- агглютинации, радиоиммунологического анализа, включают фермент-связанный иммуносорбентный метод (ELISA-ИФА), Вестерн-блотт и антитело-захватывающий ELISA (162,217,274).
Все эти методы позволяют выявлять в исследуемых сыворотках крови антитела классов IgA, IgM и IgG.
В середине 80-х годов, когда создавались новые серологические тест-системы для детекции специфических антител против ЦМВ, были проведены работы по сравнению чувствительности и специфичности отдельных серологических методов. Сравнение РИГА и ИФА показало, что оба метода пригодны для выявления специфических антител, однако, ИФА обладал преимуществами и поэтому был рекомендован для скрининга сывороток доноров на наличие антител к ЦМВ (105).
При сравнении РСК, латекс агглютинации, качественного ИФА с антигеном на шариках и количественного ИФА на планшетах наиболее чувствительными были признаны методы латекс агглютинации и ИФА на шариках, тогда как специфичными - РСК и ИФА на планшетах. Серокон-версия выявлялась всеми количественными методами (127).
Другие исследователи, сравнивая метод латексагглютинации и РИФ, (ABBOTT) нашли, что обе эти тест системы в 100% выявляют антитела к ЦМВ. Специфичность методов РИФ (ABBOTT) и латексагглютинации в пределах 96,4% - 92,2 %* Авторы для скрининга рекомендовали как наиболее простой и быстрый метод латексагглютинации (167).
Дальнейшие работы по сравнению ИФА и РИФ показывали высокую чувствительность обоих методов; у одних авторов 100% чувствительность и специфичность была отмечена в ИФА (320), у других наибольшей чувствительностью обладал РИФ, но этот метод давал большее количество ложно положительных результатов (310).
В настоящее время для эпидемиологических исследований цитомега-ловирусной инфекции отдается предпочтение ИФА. Теперь уже эти тест- системы разраоотаны и у нас в стране (52), производятся рядом отечественных предприятий.
Серологические исследования позволяют выявлять специфические антитела к ЦМВ класса IgG, реагирующие с целым вирусом, клеточными ранними и поздними белками и отдельными регулятор ными и структурными гликопротеинами. Сероконверсия антител класса IgG у больных или выздоравливающих говорит о первичной инфекции, повышенные титры указывают на реинфекцию, либо на реактивацию латентного ЦМВ.
Выявление антител к ЦМВ, реагирующих с ранними белками (IgM), может помочь различить активную и латентную фазы инфекции. Так, например, определение ЦМВ-специфических антител класса IgM выявило у 73% беременных женщин первичную ЦМВИ, а у 98,8% больных мононуклеозом и у новорожденных (в 50-69%) - врожденную ЦМВИ (63,104,112,217,274).
Ріс пользуя адекватные серологические методы можно проводить эпидемиологические исследования по изучению иммуноструктуры населения, в том числе, выявлять соотношение восприимчивых и невосприимчивых к ЦМВ лиц и тенденции к изменению этого соотношения.
Определение иммуноструктуры населения, раннее выявление вирусо-носителей и групп риска может стать основой для разработки тактики профилактических мер в отношении ЦМВИ.
Уже многие годы делаются попытки получить вакцину против цито-мегаловируса человека. Трудность подбора штамма для приготовления вакцины заключается в опасности вызвать болезнь у здоровых людей, в наличии антигенных вариантов среди различных штаммов ЦМВ человека, а также способность этого вируса к малигнизации клеток.
Во Франции были испытаны две вакцины из аттенуированных штаммов ЦМВ. Штамм АД 169, аттенуир о ванный в процессе 54-58 пассажей в клетках человеческого происхождения, предназначался для орального, внутрикожного и подкожного применения. При подкожном введении не наблюдалось экскреции вируса, тем не менее у вакцинированных появлялись специфические антитела, персистировавшие в течение года. Штамм Towne 125, аттенуированный в ходе 125 пассажей в клетках W1-3S с сепарацией клонов, был изучен более детально. ЦМВ-вакцину использовали для иммунизации здоровых взрослых добровольцев, женщин детородного возраста, больных перед почечной трансплантацией, а также в комбинации с краснушной вакциной. У вакцинированных сформировались антитела 2 -3-й неделе после вакцинации, пика они достигли к 4 - 8-ой неделям и сохранялись в титре 1:10 более 12 месяцев. Вакцинация обоими штаммами сопровождалась появлением умеренных местных реакций. Однако, несмотря на развитие антител после вакцинации у 7 из 17 трансплантированных больных обнаружилась цитоме гало вирусная инфекция. Видимо, титр ЦМВ-специфических антител был недостаточен для защиты вакцинированных пациентов (108).
В США Plotkin S. и соавторы также разработали несколько вариантов вакцин (живых и инактивированных) (81,288).
Позже начались разработки вакцин на основе белков цитомегаловиру-са.
Методом двухмерного электрофореза в ПААГ в клетках, инфицированных ЦМВ человека, обнаружили синтез 35 новых белков, у 13 из которых была одинаковая молекулярная масса между 28000 и 47000 KDa. Высокоразрешающая жидкостная хроматография этих белков с последующим электрофорезом в ПААГ свидетельствовали о возможности их разделения и получения в чистом виде. Многие из полученных фракций связывались со специфическими антителами и вызывали пролиферацию лимфоцитов крови только от иммунных доноров.
В дальнейшем для создания эффективной субъединичной вакцины против ЦМВИ человека требовалось определить локализацию вирусных антигенов в клетках (мембрана, цитоплазма, ядро) и в вирионах (мембрана, матрикс, нуклеокапсид), а также время экспрессии этих антигенов в клетках и роль в формировании иммунитета (8S).
Позже другими американскими исследователями была запатентована вакцина против цитомегаловируса человека. Эта вакцина включает полипептиды, обладающие перекрестной иммунологической активностью с gPA ЦМВ. Они индуцируют у человека синтез нейтрализующих антител после иммунизации. Для получения полипептидов gPA ЦМВ используют изоляцию gPA из клеток, зараженных ЦМВ, путем экскреции его неионным детергентом с последующей адсорбцией на иммунно-аффинной колонке. Полученный gPA представляет собой смесь различных родственных форм полипептидов с разной степенью гликозилирования с различными электрофоретическими свойствами.
Созданная таким образом вакцина используется в смеси с адъюванта-ми. Она предназначена для лиц с иммунодефицитами, женщин детородного возраста для подавления трансмиссии ЦМВ плоду, а также для больных, имеющих показания к трансплантации органов (264).
Таким образом, на основании анализа вышеизложенных данных можно сделать заключение о том, что эпидемиологические закономерности двух ОИ -пневмоцистоза и ЦМВИ пока изучены не полностью, сведения о них в разных странах различаются, методы исследования иммунного ответа организма человека на возбудителей этих инфекций весьма разнообразны.
Единые методические стандартные (унифицированные) подходы для изучения этих вопросов пока отсутствуют.
Несомненно, что судить о распространении этих ОИ, о поражении определенных возрастных, половых, профессиональных групп возможно только на основании результатов иммунологических (серологических) исследований с использованием адекватных диагностических тест-систем, ввиду трудности клинической дифференциальной диагностики. На момент начала наших исследований такие тест-системы в России практически от- сутствовали, поэтому для выполнения эпидемиологических исследовании прежде всего необходимо было разработать современные чувствительные и специфичные препараты, что и явилось одной из задач настоящей работы.
III. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Цитомегаловнрусная инфекция: этиология, патогенез, диагностика, эпидемиология, профилактика
Возбудителем этой инфекции является цитомегаловирус человека (Cytomegalovirus Hominis) (ЦМВ) - условно-патогенный микроорганизм, относящийся к семейству герпесвирусов (Herpes virus), подсемейству В-герпесвирусов пятого типа; для него характерен узкий диапазон хозяев и длительный тип репликации (10,129,357). Из большого числа герпетических вирусов возбудителями различных заболеваний человека являются шесть: вирус герпеса I и II типов, вирус ветряной оспы, Эшлтейна-Барр, цитомегало вирус и В-лимфотропный вирус (вирус герпеса VI) (3).
Вирионы ЦМВ человека имеют диаметр около 200 нм и представляют собой двухтяжевые молекулы ДНК, заключенные в нуклеокапсид, окруженный тегументом, покрытым липо протеи дн ой оболочкой. Определение внутренних протеинов имеет большое значение для ранней диагностики ЦМВИ (191,211,309,346). Геном цитомегаловируса человека самый крупный из всех геномов представителей семейства герпесвирусов. Репликация вируса происходит следующим образом. Вирус адсорбируется на клетке с помощью специфических рецепторов; проникает в цитоплазму, где происходит разрушение оболочки; оставшийся капсид продвигается в ядро. В ядре репликация вириона завершается полной сборкой, при выходе из клетки он одевается мембраной (98,113,158,309,334,335,336). Структуры, лишенные сердцевины вируса, не обладают инфекционными свойствами (226).
Вирус способен вызывать продуктивную, абортивную, а также лате нтную формы инфекции (199,206,335). Отдельные штаммы ЦМВ человека обладают онкогенными свойствами, приводя к малигнизации клеток (215,280).
Для этого вируса характерна строгая видовая специфичность (187). Вне организма он размножается в диплоидных эмбриональных кожно-мышечных и легочных клетках человека. Оптимальная РН среды 7,2 - 8,0. ЦМВ термолабилен: инактивируется при прогревании при 56 С и хранится при +4 С в течение недели, при медленном залюраживании до -20 С его инфекционность теряется. Хранить ЦМВ рекомендуется при -90 С в течение не более двух месяцев, длительное хранение возможно в жидком азоте при-190 С (5,65).
Активность репродукции цитомегавируса зависит от ряда факторов: дозы вируса, путей заражения, возраста пациента, генетических особенностей и состояния иммунитета в момент заражения (10,113,115).
Репликация попавшего в кровь ЦМВ происходит в лейкоцитах и в системе мононуклеарных фагоцитов. Вирус персистирует в лимфоидных органах (188). В данном случае клетки не инактивируют вирус, а наоборот, являются элементами крови и лимфоидных органов, в которых он размножается, делая его недоступным для специфических циркулирующих антител и интерферона, что имеет существенное значение в патогенезе цитомегаловирусного заболевания. Многие вирусные частицы захватываются макрофагами и уничтожаются. Однако часть вирусных частиц, связанных с лейкоцитами, продолжает циркулировать в организме, обуславливая диссеминацию вируса (180,227,249,285).
Важную роль в патогенезе ЦМВ И играет система клеточного иммунитета (122,285). Только при иммунодефицита ом состоянии больного ЦМВИ проявляется яркой клинической картиной (248). Причиной иммунной недостаточности могут быть различные факторы: физиологическая иммунная недостаточность детей раннего возраста, иммунодефицит, обусловленный беременностью, ятрогенными вмешательствами, неблагоприятными экологическими факторами (8,129).
ЦМВИ является одной из ведущих СПИД-ассоциированных инфекций. Она активизируется в В-стадии ВИЧ-инфекции, то есть в период острой инфекции со вторичными заболеваниями (51).
Свойства ЦМВИ, как оппортунистического заболевания, проявляются и в других ситуациях, когда в организме больного возникает Т-клеточный иммунодефицит. Подавление клеточного иммунитета человека может оыть и следствием прямого воздействия цитомегаловируса на Т-лимфоциты (29,138,208,209).
Наиболее значительные изменения выявляются в субпопуляции хел-перов / индукторов, уровни которых падают, в то же время уровни супрес-соров / киллеров увеличиваются. Снижаются соотношения СД4/СДЗ, активность естественных киллеров. Одновременно нарушается регуляция иммунного ответа вследствие повреждения системы интерлейкинов (101,325).
На фоне угнетения иммунного ответа цитомегаловирус током крови разносится в различные органы и системы и адсорбируется на клеточных мембранах эпителия, например слюнных желез (преимущественно околоушных), а вирионы проникают в цитоплазму, индуцируя цитомегаличе-ский метаморфоз клеток (ЦМК) и образование цитомегалов. ЦМВ может персистировать в организме человека пожизненно (20,129).
Однако имеются данные, свидетельствующие, что перс и старую щая ЦМВИ в большинстве случаев не сопровождается нарушениями в составе субпопуляции Т-лимфоцитов (хелперы/супрессоры), характерными для синдрома цитомегаловирус ного мононуклеоза (283).
Хроническая ЦМВИ сопровождается выработкой различных антител (нейтрализующих, комплементсвязывающих, тормозящих гемагглютина-цию, агрегацию тромбоцитов и др.), которые не препятствуют его репродукции в организме.
Таким образом, патогенез различных форм цитомегаловирусной инфекции еще недостаточно изучен. Однако достоверно установлено, что в ряде случаев заболевание развивается в результате активации латентной инфекции на фоне снижения резистентности организма, связанной с им-мунодефицитным состоянием.
Цитомегаловирусная инфекция человека является антропонозом, при котором источником инфекции является больной человек или хронический вирусоноситель. Источник наиоолее опасен в активной фазе первичного инфицирования или в период обострения инфекции.
Разработка и оценка эффективности тест-систем НРИФ и ИФА для определения антигенов P. carinii и антител классовом и IgG
Непрямая иммунофлюоресцентная реакция для выявления антигена Р. сагіпіі проводилась по общепринятой методике в нашей модификации. В материалах от больных достоверно -выявлялись цисты и трофозоиты. Чувствительность метода составила 85%. Высокую специфичность реакции обеспечивало разведение гипериммунной сыворотки ре-конвалисцентов анти-Р. сагіпіі физиологическим раствором (РН 7,2) 1:20. В этом разведении специфические антитела, содержащиеся в гипериммунной сыворотке, образовывали комплексы с антигенами пневмоцист и тро-фозоитов в исследуемых препаратах индуцированной мокроты или бронхоальвеолярного лаважа, выявляясь ярким, штатным изумрудным све чением. В контрольных положительных препаратах при использовании гипериммунной сыворотки в разведении 1:20 наблюдалось 100% свечение, тогда как при разведении сыворотки 1:40 свечение было отмечено у 50% паразитов; разведение 1:80 выявило лишь 30% пневмоцист. В образцах от рицательных контроле и, где вместо гипериммунной сыворотки использо вали сыворотку, не содержащую антитела Р, carinii, свечение полностью отсутствовало. Чувствительность и специфичность метода определяли при обследовании материалов различных групп больных с подтвержденным диагнозом «пневмоцистная пневмония». Было показано, что выявляемость P. carinii была высокой и зависела от исследуемых материалов. Так, в пре паратах индуцированной мокроты выявляемость цист и трофозоитов д & препаратах бронхоальвеолярного лаважа -100%, Непрямая иммунофлюоресцентная реакция для выявления анти тел проводилась по общепринятой методике (49) в нашей модификации, которая заключалась в использовании оригинального авторского антигена в виде цельных пневмоцист и трофозоитов (50 кл/лунку). Для определения чувствительности и специфичности предлагаемого теста были исследова ны 48 сывороток крови от больных пневмоцистной пневмонией, а в каче стве контроля - 64 сыворотки доноров крови - - . (табл. 3). Анализ полученных результатов показал, что при разведении : испытуемых сывороток 1:20 и более достигалось выявление специфических антител и были исключены ложно-положительные результаты, связанные с неспецифической реакцией.
При интерпретации результатов, полученных в НРИФ, к низкому уровню антител были отнесены разведения 1:20 - 1:40; к среднему -1: 160 и более - к высокому.
ИФА для выявления А Т (Ig\t и IgG) к P. carinii В отличие от реакции иммунофлюоресценции, где требовались неразрушенные цисты и трофозоиты, для иммуноферментного анализа были необходимы внутренний и оболочечный антигены пневмоцисты. Поэтому очищенные и сконцентрированные в градиенте плотности перколла пневмоцисты разрушали, подвергая обработке ультразвуком. В надосадочной жидкости содержался внутренний растворимый антиген P. carinii, тогда как в осадке - поверхностный (оболочечный) нерастворимый антиген. Поверхностный антиген дополнительно обрабатывали 8 М мочевиной, а затем проводили диализ против 0,01 М ФСБ. После диализа пробы с внутренним и поверхностным антигенами объединяли и измеряли концентрацию белка в 1 мл полученного препарата. Для иммуноферментного анализа использовали антиген с концентрацией белка 0,95 - 1,2 щг/мл.
Поскольку принцип иммуноферментного анализа на твердой фазе известен (50,243), в нашу задачу входило установить оптимальные условия для проведения реакции. Были определены концентрации специфических составляющих тест-систему (антигена и иммуноглобулинов), а также конъюгата, от чего зависела чувствительность и специфичность реакции, подобраны временной и температурный режимы адсорбции антигена и время инкубации сывороток. В реакции был использован антиген с концентрацией белка 5-10 мкг/мл. Положительным контролем служили сыворотки реконвалисцентов, собранные в пулы, отобранные в РИФ- и содержащие иммуноглобулины класса G в титре 1:160 и более; иммуноглобулины класса М с тиром 1:80. Отрицательные контрольные сыворотки не содержали антител к P. carinii. Время контакта антигена с сыворотками - 2 часа при температуре 37 С. Оценку чувствительности и специфичности метода ИФА проводили, исследуя сыворотки больных пневмоцистной пневмонией и как контроль - доноров крови (табл. 3).
В результате указанных исследований было принято, что при проведении ИФА для выявления антител класса IgG начальное разведение сывороток должно быть 1:100, а для IgM - 1:200. Начальные разведения сывороток являются диагностическими. Специфичность разработанного метода - 100%, чувствительность при выявлении антител классов IgM и IgG - 97,9%. В ИФА титр антител от 1:100 до 1:200 определяется как низкий, от 1:200 до 1:500 как средний и 1:500 и более - как высокий. Диагностически значимым результатом признается 4 кратная сероконверсия антител класса IgG, а также выявление антител класса IgM, свидетельствующих о наличии острой или недавно перенесенной инфекции. С целью сравнения чувствительности полученных тест-систем для выявления антител к P. carinii классов IgG и IgM были проведены исследования сывороток крови больных манифестной пневмоцистозной пневмонией и доноров г. Москвы. Была показана более высокая чувствительность имуноферментного анализа по сравнению с НРИФ. С помощью обоих методов были отобраны положительные сыворотки, содержащие антитела в высоких титрах, а также отрицательные сыворотки, на основе которых создана панель для проверки воспроизводимости результатов, которая составила 99%. Стабильность тест-систем проверяли, инкубируя серию при 37 С в течение 5 суток.
Распространение возоудителя пневмоцнстоза среди населения России
Таким образом, на общем фоне широкого распространения возбудителя пневмоцистной инфекции по территории России для всех ее регионов характерно преобладание лиц с низкими титрами антител класса IgG, что говорит о встрече с возбудителем завершившейся су б клинической формой инфекции, носительством, а возможно и полным выздоровлением. Высокие титры антител класса IgG к Р. сагіпІі свидетельствуют об активном ответе организма при первичном инфицировании или реинфицировании.
Анализ им мун о структуры населения по отдельным взростным груп пам позволил установить ряд новых, неотмеченных ранее особенностей: наличие антител к Р.сагіпіІ выявлено }риц разного возраста, фом числе у детей старшего возраста, а также у подростков и взрослых, а не только у ослабленных детей первого года жизни, как это традиционно считалось ранее. Наипример.среди детей первого года жизни у 37,7 ±6,7% были выяв лены антитела класса IgG. В группе от 1 года до 3 лет доля серопозитив ных составила 25,6±7,0%. В следующей группе (от 4 до 14 лет) доля детей с антителами к P. carmii достигла 36,3 ±10,3%. Среди детей первого года жизни 30±6,5% имели антитела класса IgG в низких титрах, а 14,0±4,9% - в высоких титрах (табл.6). Наличие специфических антител к P. carinii у детей первого года жизни с интерстициальными пневмониями указывало на наличие пневмоцистной пневмонии, перенесенной, очевидно, в манифестной форме. В сыворотках крови взрослых (доноров) выявлены специфические антитела класса IgG у 70,6%, причем в старших возрастных группах их количество увеличивалось. Так, среди лиц моложе 30 лет выявлено 68,1 ± 6,8% серопозитивных, тогда как в возрастной группе от30до50лет-72,7 ± 6,0%. Антитела в высоких и средних титрах также преобладали в старших возрастных группах (табл.7).
Достоверной разницы в частоте выявления антител к P. carinii у мужчин и женщин мы не обнаружили. Наблюдения в динамике за состоянием иммуноструктуры населения в г. Москве не выявило значительных различий в частоте обнаружения серопозитивных лиц, число которых в 2000 году составило 63,3%, однако, отмечено некоторое увеличение доли лиц с антителами в низких титрах (до 89,4%). Количество лиц с антителами в высоких титрах не превышало 10,6%. Антитела класса IgM к P. carinii были выявлены у 29,2% обследованных, что является косвенным свидетельством перенесенной пневмоцистной инфекции.
Обследование группы доноров г. Москвы в декабре 2001 года показало значительное снижение количества серопозитивных лиц к P. carinii по сравнению с 1994 годом, число которых составляло 54,5%. На этом фоне превалировали доноры с антителами класса IgG в низких титрах (95% от общего числа серопозитивных). Помимо антител класса IgG, у обследованных были выявлены и антитела класса IgM (15,3%), подтверждающие наличие «свежего» инфицирования.
Полученные данные свидетельствуют о проявлении эпидемического процесса пневмоцистоза как среди детского, так и среди взрослого населения, при этом уровень иммунитета, оцениваемый по титрам гуморальных антител, был подвержен значительным колебаниям. Попытка выявления зависимости серопозитивности к Р. саппії от пола не обнаружила достоверной разницы между мужчинами и женщинами. Последующее изучение иммуноструктуры населения г. Москвы в 2000 году показало незначительное снижение доли серопозитивных (до 63,3%), при этом возросла доля лиц с антителами в низких титрах (до 89,4%). Количество серопозитивных с антителами в высоких титрах не превышало 10,6%, но были выявлены лица (29,2%), обладающие антителами класса IgM к P. carinii.
Обследование доноров Москвы в декабре 2001 года выявило убедительное снижение количества сероположительных лиц к P. carinii по сравнению с 1994 и 2000 годами, что соответствовало 54,5%. Доноры с антителами класса IgG в низких титрах составляли 95% от общего числа сероположительных; средние и высокие титры антител наблюдались у 5,0%. Помимо антител класса IgG у обследованных были выявлены и антитела класса IgM (15,3%), подтверждающие наличие острой или активизировавшейся пневмоцистной инфекции.
Полученные данные показывают уменьшение в течение 2-х последних лет сероположительных к P. carinii среди здорового населения Москвы с преобладанием лиц с низкими титрами антител до 89,4% и 95,0% соответственно. Тем не менее процент лиц с острой инфекцией все же остается высоким (29,2% и 15,3% соответственно), обеспечивая большое количество больных пневмоцистозом в Москве.
Таким образом, результаты изучения иммуноструктуры населения к Р. carinii в разных городах страны позволяют сделать вывод о широком распространении пневмоцистоза на всей ее территории. Регистрация антител к P. carinii в разных возрастных группах свидетельствует, что пневмоци-стоз поражает как детей, так и взрослых. Показатели низких титров антител подтверждают, что у индивидуума была встреча с возбудителем без клинических проявлений, как правило, у иммунозащищенньгх взрослых. В результате этого, возможно и не произошло инфицирования. Средние титры специфических антител (без выраженной клинической картины) свидетельствуют об инфицировании иммунокомпетентных, и в силу этого, невосприимчивых лиц, формируя группу здоровых носителей P. carinii При этом возбудитель пневмоцистоза может присутствовать в неактивном состоянии, а носитель может быть источником инфекции. Высокие титры антител класса IgG без сероконверсии подтверждают инфицирование без клинических проявлений, как правило, взрослых с нормальным иммунитетом. Форма инфекции - субклиническая. При этом в течение 2-3 месяцев - острое носителъство, особенно опасное для окружающих. Средние и высокие титры анти-Р. carinii класса IgG с сероконверсией или наличие антител класса IgM возникают в острой фазе заболевания с клиникой интер-стициалъной пневмонии при иммунодефицита ом состоянии больного.
Цитомегаловирусная инфекция у лиц с различными иммунодефицитными состояниями
В первых отечественных работах, посвященных пневмоцистозу были описаны эпидемические вспышки в домах ребенка и в школах-интернатах (40,42). Учитывая, что основной путь передачи пневмоцистной инфекции воздушно-капельный, можно было предположить, что эта инфекция приносит значительный ущерб здоровью людей во многих организованных коллективах.
Для выяснения характера и форм проявления пневмоцистоза сероэпи-демиологическими методами были проведены обследования детей в организованных коллективах открытого и закрытого типа, а также взрослых лиц в закрытых коллективах системы МВД.
Исследование сывороток крови, взятых у детей в динамике наблюдения, показало, что наибольший удельный вес (77,6%) серопозитивных к Р. carinii был в коллективах закрытого типа - домах ребенка. Среди детей, посещающих дошкольные учреждения, доля лиц с антителами к P. carinii, составила 67,5%. Из числа «неорганизованных» детей дошкольного возраста доля серопозитивных лиц не превышала 41,3%, при чем у 28,1 ± 3,4% были выявлены антитела в низких титрах, а в высоких титрах - у 13,2 ± 2,6%. Среди детей из организованных коллективов открытого типа данный показатель был в 2,5 раза выше и составил 33,7 ± 3,1% (t=5,4). В доме ребенка, где дети находятся в однородной эпидемической обстановке, обнаружено 43,3 ± 3,5% (t=6,89) детей с маркерами пневмоцистоза (рис. 5). За весь период наблюдения в указанных организованных коллективах не бьыо зарегистрировано ни одного случая пневмоцистоза, тогда как наши исследования выявили их наличие при использовании методов лабораторной диагностики. Результаты этих исследований демонстрируют более высокую инфицированность P. carinii детей в организованных коллективах, особенно закрытого типа, по сравнению с «неорганизованными» детьми, что можно объяснить скученностью, более тесными условиями проживания, частыми различными инфекционными заболеваниями, сниженным уровнем иммунитета, недостаточно сбалансированным питанием и другими причинами. Наблюдение в динамике с интервалом в б месяцев за детьми в возрасте до 3 лет из дома ребенка выявило при первом обследовании 79,2% серопозитивных детей. Дети с низкими уровнями антител (44%) и серонегативные (20,8%) могут представлять собой группу возможного инфицирования P. carinii. Другая группа детей, составляющая 56,0%, очевидно, перенесла пневмоцистную инфекцию ранее, что сопровождалось выработкой специфических антител в высоких титрах. Повторное обследование показало, что 75,5% детей по-прежнему не имели антител к P. carinii. В то же время из 24,3% ранее серонегативных лиц у 16,2% были выявлены антитела в высоких титрах, что свидетельствует о перенесенной острой пневмоцистной инфекции в интервале между двумя обследованиями. Наличие низких титров специфических антител у 8,1% детей подтверждает встречу с P. carinii, однако, судить о клинических последствиях этого не представляется возможным.
Проведенный анализ заболеваемости в этом доме ребенка показат, что в течение срока наблюдения случаев пневмоний не было зарегистрировано, но отмечались частые острые респираторные инфекции, в этиологии которых P. carinii, очевидно, принимаш участие, что подтверждают наши данные о натичие иммунного ответа разной интенсивности. Наблюдения в динамике за уровнем антител к P. carinii показати натичие диагностической сероконверсии у 17,4% обследованных, что подтверждает роль P. carinii в этиологии перенесенных заболеваний. Таким образом, мониторинг состояния иммунитета к возбудителю пневмоцистоза у детей в доме ребенка позволил выявить случаи заболеваний, чаще всего в виде острых респираторных инфекций только благодаря применению адекватных методов лабораторной диагностики пневмоцистоза. Следовательно, в детских организованных коллективах эпидемический процесс пневмоцистоза поддерживается постоянно, однако, клинически случаи заболевания, очевидно, протекают достаточно легко, так как острые пневмонии в обследованных коллективах не были зарегистрированы.
Источниками инфекций могут быть как дети, так и медицинский и обслуживающий персонал, что не исключает возможность перекрестного инфицирования. Полученные данные обосновывают целесообразность периодических обследований медицинского персонала на маркеры пневмоцистоза для предупреждения возникновения как спорадических случаев, так и вспышек пневмоцистоза.
![Клинико-эпидемиологическая характеристика стрептококковой инфекции в г. Сургуте (на примере скарлатины) [Электронный ресурс]](/i/i/4404/207456.png "Клинико-эпидемиологическая характеристика стрептококковой инфекции в г. Сургуте (на примере скарлатины) [Электронный ресурс] Козловская Ольга Витальевна")