Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 13
2.1 Лектины. Функции лектинов 13
2.2. Углевод-содержащие биополимеры как носители биологической информации 16
2.3. Классификация зоолектинов 18
1.1. Маннан-связывающие лектины позвоночных 24
1.2. Лектины иглокожих ..35
3. Методы исследования 42
3.1. Сбор материала 42
3.2. Реакция прямой гемагглютинации 42
3.3. Ингибирование РПГА 43
3.4. Определение зависимости активности МСЛ-Т и МСЛ-К от температуры 43
3.5. Определение зависимости активности МСЛ-Т и МСЛ-К от рН и концентрации ионов Са в среде 44
3.6. Выделение МСЛ-Т и МСЛ-К 45
3.6.1. Ионообменная хроматография 45
3.6.2. Аффинная хроматография 46
3.6.3. Гельфильтрация 46
3.7. Получение антисывороток к МСЛ-Т и МСЛ-К 47
3.8. Выделение фракций иммуноглобулинов из антисывороток против МСЛ-Т и МСЛ-К 48
3.9. Иммуноферментное определение МСЛ-Т и МСЛ-К 49
3.9.1. Получение коньюгатов IgG анти-МСЛ-Т и IgG анти-МСЛ-К с пе-роксидазой хрена 49
3.9.2. Подбор концентрации IgG анти-МСЛ-Т и IgG анти-МСЛ-К для адсорбции на планшетах 50
3.9.3. Подбор разведений коньюгата 51
3.9.4. Построение калибровочной кривой 51
3.9.5. Определение концентрации МСЛ в целомической жидкости трепанга и кукумарии 52
3.9.6. Определение перекрестной реактивности IgG анти-МСЛ-Т с МСЛ-К, а также с МСЛ сыворотки крови человека и мыши 53
3.10. Иммуноэлектрофорез 53
3.11. Анализ белковых препаратов с помощью электрофореза в полиак-риламидном геле в присутствии ДСН 54
3.12. Иммуноблоттинг 55
3.13. Определение содержания белка микробиуретовым методом 56
3.14. Выявление локализации лектинов в тканях голотурий 57
3.15. Постановка экспериментов по изучению воздействия бактерий Yersinia pseudotuberculosis, их лизата и термостабильного токсина на компоненты защитной системы трепанга 58
3.16. Электронная микроскопия 59
3.17. Постановка экспериментов по изучению воздействия маннанов, с которыми эффективно связываются МСЛ-Т и МСЛ-К, на гуморальный компонент защитной системы голотурий 60
3.18. Постановка опытов по регенерации кишки дальневосточного трепанга 60
3.19. Получение и культивирование эмбрионов Strongylocentrotus nudus 61
4. Результаты ...63
4.1. Идентификация лектинной активности 63
4.2. Выделение лектинов из целомической жидкости A.japonicus и С. japonica
4.2.1. Разработка метода фракционирования белков целомической жидкости на основе ионообменной хроматографии 65
4.2.2. Разработка метода фракционирования белков целомической жидкости на основе аффинной хроматографии 68
4.2.3. Разработка метода фракционирования белков целомической жидкости на основе гельфильтрации 72
4.3. Физико-химические свойства лектинов
4.3.1. Молекулярная масса и субьединичный состав 72
4.3.2. Углеводная специфичность лектинов 82
4.3.3. Зависимость активности лектинов от концентрации ионов Са 85
4.3.4. Зависимость активности лектинов от рН 85
4.3.5. Зависимость активности лектинов от температуры 88
4.3.6. Аминокислотный состав МСЛ-Т и МСЛ-К 88
4.4. Иммунохимические свойства лектинов
4.4.1. Получение и тестирование антител к МСЛ-Т и МСЛ-К 91
4.4.2. Исследование общих антигенных детерминант у МСЛ-Т и МСЛ-К 91
4.4.3. Исследование перекрестной реактивности МСЛ-Т и МСЛ-К с другими маннан-связывающими лектинами 97
4.5. Локализация МСЛ-Т и МСЛ-К в организме A. japonicus и С. japonica 97
4.6. Взаимодействие бактерий псевдотуберкулеза, их «лизата» и термостабильного летального токсина с компонентами иммунной системы дальневосточного трепанга 98
4.6.1. Динамика суммарной лектинной активности и содержания МСЛ-Т в целомической жидкости A. japonicus 101
4.6.2. Влияние «лизата» бактерий и термостабильного летального токсина на динамику суммарной лектинной активности и содержание МСЛ-Т в целомической жидкости трепанга 105
4.6.3. Поведение бактериальных клеток и взаимодействие их с целомо-цитами, ответственными за осуществление защитных реакций -амебоцитами и морулоподобными клетками 108
4.6.4. Корреляция между содержанием МСЛ-Т, суммарной лектинной активностью и содержанием целомоцитов в целомической жидкости дальневосточного трепанга ПО
4.7. Лектинная активность и содержание лектинов в целомической жидкости A.japonicus и C.japonica в ответ на введение этим животным бактериальных полисахаридов 113
4.7.1. Динамика лектинной активности и содержания МСЛ-Т в целомической жидкости A. japonicus 113
4.7.2. Динамика лектинной активности и содержания МСЛ-Т в целомической жидкости C.japonica 117
4.8. Исследование роли МСЛ-Т в процессах репаративной регенерации кишки дальневосточного трепанга после эвисцера-ции 120
4.8.1. Динамика суммарной лектинной активности и содержания МСЛ-Т в целомической жидкости в ходе регенерации кишки дальневосточного трепанга 120
4.8.2. Распределение МСЛ-Т в регенерирующих тканях кишки дальневосточного трепанга 122
4.9. Влияние антител к МСЛ-Т на процесс эмбрионального развития морского ежа Strongylocentrotus nudus 124
5. Обсуждение 131
5.1. Определение лектинной активности целомической жидкости дальневосточного трепанга и японской кукумарии 131
5.2. Выделение МСЛ-Т и МСЛ-К 132
5.3. Свойства МСЛ-Т и МСЛ-К 133
5.3.1 Молекулярная масса и субъединичность 133
5.3.2. Углеводная специфичность МСЛ-Т и МСЛ-К 134
5.3.3. Зависимость активности лектинов от рН и концентрации ионов Са2+ и другие свойства 135
5.3.4. Аминокислотный состав и иммунохимические свойства лектинов 137
5.4. Локализация МСЛ в органах и тканях голотурий 139
5.5. Участие МСЛ-Т и МСЛ-К в защитных реакциях 141
5.3.6. Участие МСЛ-Т в регенерации кишки дальневосточного трепанга после эвисцерации 145
5.3.7. Участие МСЛ-Т в эмбриональном развитии 148
Выводы 151
Литература... 153
- Маннан-связывающие лектины позвоночных
- Определение концентрации МСЛ в целомической жидкости трепанга и кукумарии
- Исследование перекрестной реактивности МСЛ-Т и МСЛ-К с другими маннан-связывающими лектинами
- Определение лектинной активности целомической жидкости дальневосточного трепанга и японской кукумарии
Маннан-связывающие лектины позвоночных
Маннан-связывающие лектины (МСЛ) позвоночных принадлежат к семейству Са -зависимых эндогенных лектинов С-типа. Их относят к группе коллектинов, так как они имеют коллагеноподобный домен в N-концевой области полипептидной цепи (Holmskow et al., 1994).
Структура молекулы МСЛ. МСЛ позвоночных представлены в виде двух форм - МСЛ-С (сывороточной), растворенной в плазме крови и МСЛ-А (печеночной), встроенной в мембраны эндоплазматической сети и аппарата Гольджи гепатоцитов.
В структуре МСЛ имеется короткая (около 30 аминокислотных остатков) обогащенная цистеином область, содержащая 2-3 остатка цистеи-на, за ней следует коллагено-подобный домен, состоящий из 18-20 повторов Gly-Xaa-Yaa, затем линкерная область - так называемая «шейка», содержащая около 30 аминокислот, и, наконец, СООН-концевой углевод-рас-познающий домен из 115 аминокислот (Kawasaki, 1999).
Молекулы МСЛ позвоночных представляют собой гомополимеры, состоящие из субъединиц молекулярной массой около 32 кДа. Субъединицы МСЛ стремятся к объединению в тримеры 96 кДа за счет дисульфид-ных связей в N-концевой области, а также свойств коллагенового домена и линкерной области. Такие тримеры называют структурной единицей МСЛ (Kawasaki, 1999). Структурные единицы МСЛ стабилизированы гидрофобными взаимодействиями и дисульфидными связями, соединяющими N-концевые области отдельных субьединиц (Wallis and Drickamer, 1997). МСЛ сыворотки крови человека - мультимер (молекулярной массой 200-600 кДа), состоящий из 2-6 таких структурных единиц. Сывороточный МСЛ в нативных условиях существует в виде высоко гетерогенной популяции молекул, состоящей из мономеров, димеров, тримеров, тетрамеров, пентамеров и гексамеров структурных единиц (Kawasaki, 1999). Одна по липептидная цепь имеет вид «голова-хвост», а в ходе ассоциации образуются структуры, похожие на «букет тюльпанов».
Как и в случае коллагена тканей, коллагеновый домен МСЛ подвергается посттрансляционной модификации - гидроксилированию остатков пролина, а также гидроксилированию и гликозилированию остатков лизина, что необходимо для обеспечения ассоциации тримеров в более крупные мультимеры (Ma et aL, 1997).
Коллагеновый домен обеспечивает взаимодействие с рецептором Clq на поверхности фагоцитов, инициируя фагоцитоз связанного лиганда. Кроме того, последовательность из 9 аминокислот МСЛ сыворотки крови человека и обезьян {Масаса muttata, М. rhesus), образующая N-конец, участвует в активации системы комплемента (Kurata et aL, 1994; Mogues et aL, 1996), причем для этого требуется образование «узловой» структуры, состоящей из N-концевых участков и коллагеновых доменов нескольких три-мерных структурных единиц. В этой области расположено 2 либо 3 инвариантных остатка цистеина, соединяющих дисульфидными связями данную субьединицу с другими (Ezekowitz and Stahl, 1988).
Для проявления углевод-связывающей активности МСЛ необходимо присутствие ионов Са" , который, согласно данным рентгеноструктурного анализа, принимает непосредственное участие в связывании лиганда, образуя координационные связи с 3-й и 4-й ОН-группами лиганда (Weis et aL. 1992).
Специфичность МСЛ. МСЛ обладают специфичностью преимущественно к высокоразветвленным маннанам. Некоторые из них (например. связывающий маннозу рецептор макрофагов), проявляет специфичность не только к D-маннозе, но и к фукозе и N-ацетилглюкозамину, которые имеют такую же конфигурацию заместителей при 2-м, 3-ми 4-м атомах углерода, как и манноза (Ezekowitz and Stahl, 1988). Кроме того, на специфичность и авидность связывания лиганда с лектином оказывает влияние структура терминального моносахаридного остатка, конфигурация глико-зидной связи между мономерами и степень разветвленное (антенность) гликана (Sharon and Lis, 1989, Ezekowitz and Stahl, 1988). МСЛ распознают предпочтительно глкжаны, липофосфогликаны, гликоинозитол, фосфоли-пиды, содержащие маннозу, глюкозу, фукозу и N-ацетилглюкозамин как концевые гексозы. Общая черта этих гексоз - экваториальная ориентация 3-й и 4-й гидроксильных групп, которые должны быть представлены на концевых невосстанавливаюпшх остатках гексозы. Примечательно, что МСЛ связывает маннозу с весьма низкой аффинностью (около Ю" ) (Iobst et al., 1994). Тогда как авидность к мишеням, экспонирующим многочисленные углеводные детерминанты (к мананам) многократно выше (порядка 10"9М). Типичный лиганд МСЛ in vivo должен обладать множеством сайтов связывания, что обеспечивает высокое сродство связывания через многочисленные углевод-распознаюшие домены. Анализ трехмерной структуры МСЛ человека и крысы показал, что лиганды должны располагаться на расстоянии 45-50 ангстрем друг от друга для достижения эффективного связывания (Sheriff et al., 1994). Эти два типа характеристик связывания лигандов мультивалентными лектинами было предложено назвать микро-и макроструктурным распознаванием (Hoffman et al., 1999) Данное свойство позволяет МСЛ эффективно распознавать поверхности клеток бактерий с высоким содержанием повторяющихся концевых остатков маннозы и/или N-ацетилглюкозамина, как, например, у Saccharomyces cerevisiae,Candida albicans, Echerichia coli (штаммы Kl и 2), Salmonella typhylorum и Neisseria gonorrhoeae (Holmskow et al., 1994; Neth et al., 2000). Биосинтез МСЛ в основном осуществляют гепатоциты (это относится как к сывороточному МСЛ, так и к МСЛ печени). Недавно методом PCR-анализа было обнаружено, что мРНК сывороточного МСЛ (но не МСЛ печени) экспрессируется в почках крысы (почечные тела и дисталь-ные канальцы), что составляет 1/8 часть от его экспрессии в печени (Mono et al., 1997). Предполагают, что это может быть связано с необходимостью локальной зашиты почек. Обе формы МСЛ (сывороточная и печеночная) синтезируются в печени. Известно, что МСЛ ряда млекопитающих (грызуны, макака-резус) имеют различия в аминокислотной последовательности и кодируются двумя различными формами мРНК, тогда как обе формы МСЛ человека и шимпанзе кодируются одной мРНК и имеют идентичную аминокислотную последовательность. Наиболее существенным различием между МСЛ сыворотки и МСЛ печени человека является количество структурных единиц в составе молекулы (1-3 в МСЛ печени и 3-6 в МСЛ сыворотки), а также то, что МСЛ печени, в отличие от МСЛ сыворотки, не способен активировать комплемент (Kurata et al., 1994). Возможно, что первоначально синтезированные полипептидные цепи МСЛ подвергается посттрансляционной модификации в клетках печени, в результате которой и образуются две формы МСЛ человека: МСЛ печени и МСЛ сыворотки (Kurata etal., 1994).
Как уже упоминалось выше, МСЛ печени человека локализован внутри гепатоцитов, преимущественно в шероховатой эндоплазматической сети и аппарате Гольджи (Kurata et al., 1994). Потенциальными эндогенными лигандами для МСЛ печени в шероховатом эндоплазматическом рети-кулюме могут быть лизосомальные энзимы и биосинтетические интерме-диаты гликопротеинов сыворотки, которые обладают углеводными цепями высокоманнозного типа. Возможно, что функция МСЛ печени связана с транспортом биосинтетических интермедиатов гликопротеинов из шероховатого эндоплазматического ретикулюма в аппарат Гольджи (Kurata et al., 1994). Было установлено, что, МСЛ печени кролика способен эффективно связывать вирус А инфлюэнцы (Kawai et al.,1998). Возможно, что антивирусная активность МСЛ печени необходима для внутриклеточной нейтрализации патогенных организмов in vivo (Kawai et al.,1998). Функции МСЛ. Биологическая роль МСЛ обусловлена их связыванием с углеводными цепями гликопротеидов, содержащими маннозу (таких как Ig М, оболочки вирусов, бактерий и других патогенов). Остатки маннозы, N-ацетилглюкозамина и фукозы крайне редко обнаруживаются на концах углеводных цепей позвоночных животных. Полисахариды, содержащие концевую маннозу и фукозу - характерный компонент глико-коньюгатов поверхности клеток бактерий, дрожжей, паразитических простейших и вирусов. Необходимо отметить, что углеводные цепи глико-коньюгатов млекопитающих в норме, как правило, оканчиваются сиаловы-ми кислотами, которые не распознаются МСЛ и экранируют нормальные углеводы (Petersen at al., 2001). Патологические процессы, такие как злокачественная трансформация, вирусная инфекция сопровождаются нарушениями гликозилирования, что приводит к экспозиции полисахаридов, содержащих концевую маннозу и фукозу - маркеров патологии.
Определение концентрации МСЛ в целомической жидкости трепанга и кукумарии
Во все лунки планшета вносили по 100 мкл IgG анти-МСЛ-Т или IgG анти-МСЛ-К в буфере (1), в концентрации 10 мкг/мл, и инкубировали в течение ночи при 4С. Планшет отмывали водой, и 3 раза буфером (3). Полученные двухкратные разведения стандартов соответствующих антигенов вносили по 100 мкл в лунку, в первые два вертикальных ряда (A-G) по убывающей концентрации сверху вниз 100, 50, 25, 12, 6, 3, 1.5 нг/мл. В остальные лунки планшета, за исключением ряда Н, вносили по 100 мкл анализируемых проб в дублетах. Для определения МСЛ-Т и МСЛ-К в качестве анализируемых проб вносили целомическую жидкость в разведении 1/10 от исходной. В 1-12 лунки ряда Н вносили по 100 мкл буфера (3) (бланк). Планшет инкубировали 1 ч при +37С. Отмывали дистиллированной водой и трижды буфером (3). Длительность отмывки каждой сменой буфера составляла 2-3 мин. После этого во все лунки планшета вносили по 100 мкл соответствующего конъюгата в разведении 1/600 для IgG анти-МСЛ-Т-ПХ и 1/100 для IgG анти-МСЛ-К-ПХ. Планшет инкубировали 1 час при +37 С и отмывали водой и буфером (3). Во все лунки планшета вносили по 100 мкл субстрата ОФДА и через 10 мин инкубации при комнатной температуре измеряли оптическое поглощение при 492 нм.
Концентрации антигенов в исследуемых пробах определяли по калибровочной кривой, построенной в координатах Х=К,У=ОПс-ОПо, где К-концентрация стандартного антигена, ОПс- соответствующая оптическая плотность раствора стандартного антигена, ОПо-оптическая плотность "отрицательного " контроля. Оптическая плотность "отрицательного " контроля (бланка) также учитывалась при определении оптической плотности исследуемого образца. При этом использовались среднеарифметические значения оптической плотности дубликатов. 3.9.6. Определение перекрестной реактивности МСЛ-Т сМСЛ-К, о также с маннан-связывающими лектинами сыворотки крови человека и мыши
В качестве ряда использовали следующую ориентацию лунок на планшете: 1А-Н, 2А-Н и так далее по 12А-Н. Готовили двухкратные разведения МСЛ-Т и МСЛ-К от 0,0125 мг/мл и вносили в триплетах в лунки А-G рядов 1-3 для МСЛ-Т и 4-6 для МСЛ-К по убывающей концентрации. Параллельно готовили двукратные разведения сыворотки крови человека и мыши от 0,0125 мг/мл и также вносили в триплетах в лунки A-G рядов 7-9 и 10-12, соответственно, по убывающей концентрации. В последнюю лунку Н ряда вносили по 100 мкл буфера (3) (бланк).
Планшет инкубировали 1 час при +37С , затем отмывали, как описано выше. После этого во все лунки планшета вносили по 100 мкл коньюга-та IgG-анти-МСЛ-Т-ПХ в разведении 1/600 в буфере (3), инкубировали 1 час при +37С0, затем отмывали, как описано выше. Во все лунки планшета вносили по 150 мкл субстрата ОФДА и через 10 мин инкубации при комнатной температуре останавливали реакцию внесением 5% H2S04 и измеряли оптическое поглощение при 492 нм. Связывание IgG-анти-МСЛ-К с МСЛ-Т исследовали аналогичным образом.
Иммуноэлектрофорез проводили на предметных стеклах в 1% агаро-зе, приготовленной на 0,05М вероналовом буфере, рН 8.6, по методике (Grabar and Williams, 1953). В качестве электродного буфера для иммуно-электрофореза использовали тот же буфер. Маркером электрофоретиче-ской подвижности являлся раствор бромфенолового синего. Электрофорез проводили при градиенте напряжения 10 в/см в течение 2-3 ч. После добавления антисывороток пластинки инкубировали в течение суток во влажной камере. Отмывку пластинок проводили в течение 3-4 суток физиологическим раствором, после чего преципитаты окрашивали раствором Кумасси G-250. Для удаления фона после окраски пластинки отмывали раствором Н20:АсОН:ЕЮН в соотношении 80:12:8.
Для определения степени очистки лектина, а также его молекулярной массы и субьединичности мы использовали градиентный 7.5-30%-ный разделяющий гель. Для приготовления 30 мл (на 4 пластины) 7.5%-ного разделяющего геля смешивали 11.6 мл Н20; 7.5 мл 0,5М трис-НС1 (рН 6,8); 7.5 мл 30%-ного акриламида (содержащего 1/30 часть метилен-бис-акрила-мид ); 0,6 мл 0,1 М ЭДТА; 1.5 мл глицерина; 0,3 мл 10%-ного ДСН; 10 мкл TEMED. Полимеризацию инициировали добавлением 1 мл 1,5%-ного персульфата аммония. Для приготовления 30 мл 30% разделяющего геля смешивали 7.5 мл 1.5М трис-НС1 (рН 8.8); 19.5 мл 44%-ного акриламида (содержащего 1.17% метилен-бис-акриламида); 0.3 мл 10%ДСН; 0.6 мл 0.1 М Na2 ЭДТА; 1.5 мл глицерина, 1 мл 1.5% персульфата аммония и 10 мкл ТЕ-МЕД. Полученный раствор через градиентатор заливали в вертикальный блок между стеклянными пластинками. Сверху наслаивали раствор концентрирующего геля, содержащий 4.2 мл Н20; 2.5 мл 0,5М трис-НС1 (рН6.8), 1.5 мл 30%-ного раствора акриламида (содержащего 1/30 часть метилен-бис-акриламида), 0.2 мл 0,1 М Na2 ЭДТА; 0.5 мл глицерина; 0,1 мл 10%-ного ДСН, 15 мкл TEMED. Для инициации полимеризации непосредственно перед заливкой добавляли 1 мл 1,5%-ного персульфата аммония.
Образцы растворяли в смеси, содержащей 1 мл 0,5М трис-HCl (рН 6,8); 0.8 мл глицерина; 30 мкл 0,6М ЭДТА (рН 7-8); 1,6 мл 10%-ного ДСН, 0.2 мл раствора бромфенолового синего (0.5 мг/мл); 0,4 мл (3-меркаптоэта-нола. В работе использовали стандарты молекулярных масс на 14, 20, 30, ЭГ) 43, 67, 90 kDa (Pharmacia Fine Chemicals). Конечная концентрация белка в солюбилизирующей смеси была 1-2 мг/мл. Растворение проводили кипячением образцов 3 мин в закрытых пробирках для микропроб. Препараты наносили по 5-10 мкл в каждый карман геля, подслаивая под электродный буфер (рН 8.34), содержащий 1.5 г Трис, 14,4 г глицина на литр и 1% ДСН. Электрофорез в концентрируещем геле проводили при 5 мА при стандартизованном напряжении (200V). Силу тока при электрофорезе в разделя-щем геле поддерживали на уровне 20 мА (на приборе ПЭФЗУ42).
Исследование перекрестной реактивности МСЛ-Т и МСЛ-К с другими маннан-связывающими лектинами
С целью обнаружения общих антигенных детерминант в молекулах лектинов проводили иммуноферментный анализ, как описано в разделе 3 Л1. Процент перекрестной реактивности устанавливали относительно интенсивности реакции с контрольным антигеном (МСЛ-Т). Результаты этих экспериментов представлены в таблице 10. Как было упомянуто выше, антитела к МСЛ-Т взаимодействуют с МСЛ-К со 100%-ной перекрестной ре-активностью.Кроме того, антитела к МСЛ-Т связывают лектин, выделенный из ЦЖ морского ежа Strongylocentrotus nudus (35% перекрестной реактивности), и маннан-связывающие лектины сыворотки крови человека (28%) и мыши (30%)). Этот факт указывает на наличие в молекулах вышеперечисленных лектинов общих антигенных детерминант, что свидетельствует о частичной структурной гомологии данных лектинов.
Распределение МСЛ-Т и МСЛ-К изучали методами иммуноцитохи-мии (раздел 3.14.) на срезах различных образцов тканей трепанга - стенки тела, продольных мышечных лент, кишечника, клоаки, аквафарингеально-го комплекса, водных легких, а также яичников и семенников. Результаты этого исследования представлены на рис.23-24.
Антитела к МСЛ-Т маркируют базальные мембраны, ограничивающие гемальные синусы, причем наиболее интенсивно - в водных легких (рис.23), и в меньшей степени, в кишечнике трепанга (рис.23). Интенсивно окрашивалась соединительнотканная оболочка семенника (рис.23), тогда как содержимое семенников не проявляло сродства к антителам. Установлено, что яйцеклетки дальневосточного трепанга также содержат данный лектин, который локализуется преимущественно в оболочке (рис.23). Из блуждающих клеток (целомоцитов) трепанга интенсивно окрашивались только морулоподобные клетки, независимо от тех тканей и органов, в которых они присутствовали (рис.23). Остальные ткани дальневосточного трепанга антителами не маркировались.
Аналогичную картину распределения МСЛ-К наблюдали в тканях японской кукумарии (рис.24). Лектин обнаружен в составе базальных мембран стенки водных легких и кишечного эпителия, а также мембран, ограничивающих гемальные синусы стенки кишечника (рис.24). Обнаружено интенсивное окрашивание соединительнотканной оболочки семенника (рис.24). Антитела интенсивно окрашивали содержимое секрета и гранул морулоподобных целомоцитов (рис.24). Отмечено присутствие лектина в яйцеклетках кукумарии, где он входил состав оболочки яйцеклетки (Рис.24).
Для изучения гуморальных и клеточных компонентов иммунитета А. japonicus использовали четыре группы животных. Животным первой груп опы вводили бактерии Y. pseudotuberculosis в дозе 10 мк/мл, второй группе - лизат бактерий по 570 и 57 мкг, третьей группе - термостабильный летальный токсин (ТСТ) по 230 и 23 мкг белка на животное, объемом около 100 мкл; четвертая группа была представлена контрольными интактными животными (раздел 3.15).
У животных брали образцы целомическои жидкости до заражения, и на различных сроках после заражения. Общую лектинную активность определяли методом РПГА, а содержание МСЛ-Т - иммуноферментным методом, описание которых приведено в разделах 3.2 и 3.9, соответственно. К 100 мкл каждого образца добавляли 10 мкл ОДМ Na-ЭДТА для предотвращения коагуляции и производили подсчет клеток целомическои жидкости в камере Горяева. Результаты этих экспериментов приведены на рис.33-38.
Введение живых Y. pseudotuberculosis вызывало потерю подвижности у подопытных животных. Затем в кожно-мускульном мешке трепангов появлялись язвы. Со временем (к 4-5 сут) отмечали усиление признаков «заболевания» и животные, как правило, погибали. Лизат бактерий псевдотуберкулеза и токсин также вызывали снижение двигательной активности, а иногда и нарушение целостности наружных покровов у подопытных животных, но в конечном итоге трепанги справлялись с патогенным воздействием этих биомолекул иерсиний.
Установлено, что общая лектинная активность и содержание лектина в целомическои жидкости у интактных особей дальневосточного трепанга колеблется незначительно (рис.25) При этом уровень общей лектиннои активности и содержание лектина в целомическои жидкости у разных особей имели значительные индивидуальные различия и различались в 2 - 10 раз.
Живые Y. pseudotuberculosis вызывали существенные колебания уровня общей лектиннои активности в целомическои жидкости трепангов (рис.26-27). Через 1-4 сут после введения бактерий титр общей лектиннои активности возрастал в 2-4 раза и, затем либо возвращался к значениям, близким к исходным, либо снижался. Содержание МСЛ-Т также в течение первых суток снижалось. Затем количество лектина достигало значений. близких к исходным. В последующие сроки (от 2 до 6-8 сут) наблюдали резкие колебания общей лектинной активности и содержания МСЛ-Т в целомическои жидкости. Динамика общей лектинной активности и содержания МСЛ-Т у каждой особи, была сходной, однако, у разных особей отмечались значительные индивидуальные различия хода кривых, отражающих суммарную лектинную активность и содержание лектина в целомическои жидкости. Через 8-12 сут после заражения животные чаще всего погибали. Перед гибелью у большинства особей отмечали снижение уровня общей лектинной активности и содержания МСЛ-Т в целомическои жидкости.
Определение лектинной активности целомической жидкости дальневосточного трепанга и японской кукумарии
По данным японских исследователей (Matsui et al., 1994), целомическая жидкость дальневосточного трепанга обладает низкой агглютинирующей активностью по отношению к эритроцитам всех групп крови человека. Действительно, в нашем исследовании нативные эритроциты групп крови А, В и АВ агглютинировались незначительно - с титрами 1/2 - 1/4. Для эритроцитов 0-й группы крови титр гемагтлютинации в наших экспериментах был выше, достигая значения 1/64. Трипсинизация приводила к увеличению титра до значения 1/256. Сходные результаты были получены при изучении гемагглютинирующей активности целомической жидкости японской кукумарии, которая агглютинировала нативные и трипсинизированные эритроциты групп А и В с относительно низкими титрами, а трипсинизированные эритроциты 0-й группы - с наиболее высоким титром.
Это позволило нам использовать РПГА эритроцитов 0-й группы крови человека в качестве метода определения лектинной активности при разработке способа выделения и очистки лектинов этих голотурий и при изучении их свойств. Японские исследователи, выделившие два лектина из ЦЖ Stichopus japonicus. для определения лектинной активности использовали РПГА трипсинизированных эритроцитов кролика, фиксированных формалином (Matsui et al., 1994).
На первом этапе выделения - ионообменной хроматографии как для лектина A. japonicus, так и лектина С. japonica мы использовали один и тот же сорбент (DEAEoyopearl 650М), кроме того, условия сорбции и элюции лектинов были практически одинаковыми. Аффинная хроматография с применением иммобилизованных на инертном носителе углеводов, с которыми специфически связывается искомый лектин, является одним из наиболее эффективных методов выделения лектинов из многокомпонентной смеси биополимеров. Поэтому на следующем этапе очистки лектинов A. japonicus и С. japonica мы проводили аффинную колоночную хроматографию лек-тин-содержащих фракций на маннан-сефарозе, где в качестве лиганда использовали внеклеточный маннан дрожжевого типа, выделенный из культу-ральной жидкости морских галофильных бактерий Vibrio fluvialis (штамм AQ-00010), эффективно ингибировавший РПГА. Условия сорбции и элюции обеих лектинов также были идентичными.
Японские исследователи тоже применяли колоночную аффинную хроматографию, но лигандами для лектинов целомической жидкости Stichopus japonicus служили углеводные структуры муцина желудка свиньи, в состав которых не входят углеводные цепи с высоким содержанием маннозы. Принимая во внимание вышесказанное, совершенно закономерным представляется тот факт, что японские исследователи из совокупности лектинов целомической жидкости трепанга выделили лишь те, которые обладали специфичностью к галактозидам и уроновым кислотам. Кроме того, для определения лектинной активности они использовали РПГА эритроцитов кролика, которые практически не подвергались агглютинации ни МСЛ-Т, ни МСЛ-К, а значит, маннан-связываюпше лектины не выявлялись в системе тестирования лектинной активности, использованной японскими авторами. Именно поэтому маннан-связывающие лектины не попали в поле зрения японских исследователей. Несмотря на это, вполне возможно, что лектины SPL-1 и SPL-2, и выделенный нами МСЛ-Т представляют собой изолектины, обладающие разной углеводной специфичностью, вследствие незначительных структурных различий (в аминокислотной последовательности). В пользу этого предположения свидетельствует сходство молекулярной массы субъединиц SPL-1 и SPL-2 (около 17 кДа) и МСЛ-Т (около 16 кДа), а также ряда других свойств лектинов. Тем не менее, однозначно решить этот вопрос представляется возможным только после сравнения аминокислотной последовательности этих лектинов.
На последнем этапе очистки лектинов трепанга и кукумарии - гель-фильтрации, мы получили гомогенные препараты лектинов. Кроме того, методом гельфильтрации на калиброванной колонке нами было установлено, что относительная молекулярная масса нативного лектина трепанга составляет около 68 кДа, что совпадает с данными по лектину SPL-2, который обладает такой же молекулярной массой (Matsui et al., 1994). Японские исследователи также применяли гельпроникающую хроматографию для очистки и разделения нативных молекул лектинов SPL-1 и SPL-2. В этом эксперименте они установили, что SPL-1 имеет относительный молекулярный вес 400 кДа, a SPL-2 - около 68 кДа (Matsui et al., 1994).
