Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературных данных 6
1.1. Некоторые аспекты раннего эмбрионального развития 6
1.1.1. Активация эмбрионального генома 7
1.1.2. Компактизация 9
1.1.3. Стадия бластоциста 12
1.2. Нарушения раннего эмбрионального развития 13
1.2.1. Остановки развития 15
1.2.2. Фрагментация доимплантационных эмбрионов 16
1.2.3. Клеточная гибель в раннем развитии млекопитающих 18
Характерные черты апоптоза и некроза 18
Апоптоз в раннем развитии млекопитающих 24
1.3. Антисмысловые олигонуклеотиды в генной терапии 27
1.3.1. Генная терапия 27
1.3.2. Способы подавления синтеза белков 28
1.3.3. Антисмысловые олигонуклеотиды 28
Химические модификации антисмысловых олигонуклеотидов 30
Проникновение и системы доставки олигонуклеотидов в клетки 31
АсОДН как действующие агенты для терапии клеток в культурах in vitro 33
3. Материалы и методы 40
3.1. Материалы 40
3.1.1. Животные и получение эмбрионов 40
3.1.2. Вьщеление и культивирование клеток из подкожной жировой ткани человека 41
3.1.3. Реактивы и среды для культивирования 42
3.1.4. Олигонуклеотидные последовательности 44
3.2. Эксперименты на животных 45
3.2.1. Манипуляции с доимплантационными эмбрионами 45
3.2.2. Оценка интактных эмбрионов и эмбрионов после культивирования in vitro на разных сроках развития 47
3.2.3. Оценка поведенческих и репродуктивных показателей мышей 49
3.3. Эксперименты на клетках в культуре in vitro 52
3.4. Статистическая обработка данных 53
4 Результаты 55
4.1. Спонтанные нарушения раннего развития у мышей линий SAM 55
4.1.1, Нарушения развития у мышей линии SAMP1 in vivo, доимплантационная гибель 56
4.1.2, Сравнение аномалий развития у мышей линий SAM, мышей ICR и гибридов BALB/DBA, C57B16/DBA на стадии 2.5 суток развития 58
4.1.3, Нарушения развития у мышей линий SAMP1, ICR и гибридов C57B16/DBA in vitro 60
4.2. Нарушения раннего эмбрионального развития мыши при проапоптотическом воздействии 61
4.3. Раннее развитие после введения в бластоцисты мыши низкодифференцированных клеток человека 77
4.3.1. Выживаемость суспензий НСК и МСК при различных условиях хранения и изменении состава суспензионной среды 77
4.3.2. Получение инъекционных химер с НСК и МСК при различных условиях хранения и изменении состава суспензионной среды 80
4.4. Исследование эмбрионального и постэмбрионального воздействия олигонуклеотидных последовательностей, добавляемых в среду при ультивировании//! vitro 88
4.4.1. Раннее развитие после культивирования эмбрионов мыши в среде с добавлением АсОДН, специфичных к мРНК генов HRK, FASL и ВАХ человека и бессмысленной олигонуклеотидной последовательности 88
4.4.2. Постимплантационное развитие после культивирования эмбрионов мыши в среде с добавлением АсОДН, специфичных к мРНК генов HRK, FASL и ВАХ человека 90
4.4.3. Оценка поведения и репродуктивных способностей мышей, полученных после культивирования эмбрионов в среде с добавлением АсОДН, специфичных к мРНК генов HRK и FASL человека 93
4.4.4. Влияние АсОДН, специфичных к мРНК гена PPARy, на адипогенную дифференцировку клеток, полученных из жировой ткани 96
4.5. Влияние АсОДН, специфичных к мРНК гена Hrk мыши, на динамику спонтанных и индуцированных нарушений раннего развития 100
5. Обсуждение результатов 102
5.1. Спонтанные нарушения раннего развития у мышей линий SAM 102
5.2. Нарушения раннего эмбрионального развития мыши при проапоптотическом воздействии ПО
5.3. Раннее развитие после введения в бластоцисты мыши низкодифференцированных клеток человека 112
5.4. Неспецифические и специфические эффекты антисмысловых олигодезоксинуклеотидов 114
5.5. Влияние АсОДН, специфичных к мРНК проапоптотических генов на раннее эмбриональное развитие 118
6. Заключение 122
7. Выводы 124
8. Список цитированной литературы
- Активация эмбрионального генома
- Вьщеление и культивирование клеток из подкожной жировой ткани человека
- Нарушения развития у мышей линии SAMP1 in vivo, доимплантационная гибель
- Раннее развитие после введения в бластоцисты мыши низкодифференцированных клеток человека
Введение к работе
Закономерности раннего эмбрионального развития активно изучают, начиная с 60-ых годов прошлого столетия, когда была разработана методика культивирования ранних эмбрионов in vitro [Biggers et al, 1965]. Высокая исследовательская активность в изучении доимплантационного периода развития млекопитающих связана не только с изучением фундаментальных закономерностей и познавательным интересом, но имеет большое медико-биологическое и социальное значение. Практические задачи этого направления исследований связаны с усовершенствованием методов искусственного оплодотворения, сохранением биоразнообразия и генофонда, племенным разведением сельскохозяйственных животных [Pope, 2000; Solti et al, 2000; Allen, 2005]. Проблема лечения бесплодия человека в настоящее время приобретает не только медицинское, социально-демографическое, но и экономическое значение. Результативность лечения бесплодия, мето дами экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) во многом зависит от способности полученных ооцитов к оплодотворению in vitro и последующему развитию. Одним из отягчающих факторов при лечении бесплодия является возраст пациенток - после 30 лет резко снижается жизнеспособность эмбрионов и частота рождения детей после программы ЭКО [Templeton etal, 1996; Боярский, Василевская, 1998].
Жизнеспособность ранних эмбрионов обусловлена многими факторами, в том числе, зрелостью и генетическим статусом гамет, активацией эмбрионального генома, стадиоспецифичной экспрессией генов, межклеточными взаимодействиями. У всех млекопитающих некоторая часть эмбрионов погибает на доимплантационных стадиях развития. При культивировании эмбрионов in vitro нарушения могут быть вызваны как генетическим статусом развивающегося зародыша, так и влиянием ряда внешних факторов (например, нехваткой факторов роста, увеличением количества токсичных метаболитов, окислительным стрессом) [O'Neill, 1998; Agarwal etal, 2005]. Эмбрионы млекопитающих до компактизации обладают наибольшей чувствительностью к изменениям микроокружения и внешним воздействиям [Ribas et al, 2006; Zander et al, 2006]. Культивирование in vitro замедляет темпы развития [Fischer, 1987; Van der Auwera, D'Hooghe, 2001],
изменяет уровень экспрессии ряда регуляторных факторов [Lee et al, 2001; Zheng et al, 2005; Chandrakanthan et al, 2006], нарушает экспрессию импринтированных генов [Исаев и др., 2005; Gardner, Lane, 2005], снижает количество жизнеспособных и увеличивает число гибнущих и фрагментированных клеток в эмбрионах [Hardy, 1999]. Но в условиях культивирования in vitro трудно разграничить аномалии, вызванные условиями культивирования, и нарушения, связанные с генетикой объекта. Поэтому представляется актуальным исследование нарушений раннего развития, обусловленных генетикой объекта.
Качество развивающихся эмбрионов оценивают по ряду морфологических признаков, учитывающих степень фрагментации, форму и размеры бластомеров. Многие исследователи связывают нарушения раннего развития с апоптотической гибелью клеток в эмбрионах [Exley et al, 1999; Van Blerkom et al, 2001; Jurisicova et al, 2003], поэтому перспективным представляется изучение возможности коррекции спонтанных и индуцированных нарушений раннего развития путем воздействия на проапоптотические факторы. В последнее время для специфического блокирования экспрессии генов все чаще применяют антисмысловые олигодезоксинуклеотиды (АсОДН), представляющие собой короткие дезоксирибонуклеотидные последовательности. АсОДН присоединяются к специфической мРНК, препятствуют трансляции и, следовательно, выработке белка [Stein, Cohen, 1988]. Эта технология дает возможность временно и направленно воздействовать практически на любой процесс в клетке с высочайшей специфичностью, не затрагивая целостность генома. Создание препаратов на основе антисмысловых олигонуклеотидов - одно из новейших направлений лекарственных разработок для лечения ряда заболеваний, например в онкологии [Mullen et al, 2004], для лечения гипертонической болезни [Phillips, Kimura, 2005], аллергических расстройств [Ball et al, 2004], некоторых вирусных и бактериальных инфекций [Geller, 2005].
В связи с этим, изучение генетически обусловленных и индуцированных нарушений раннего развития эмбрионов млекопитающих и возможность их коррекции посредством обратимых воздействий является актуальным вопросом, как биологии развития, так и практической репродуктивной медицины.
б 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ
Активация эмбрионального генома
Эмбриональное развитие является сложным многофакторным процессом. Нарушения и сбои могут происходить на различных этапах эмбриогенеза. По всей видимости, способность к оплодотворению у ооцита остается ненарушенной дольше, чем сохранность механизмов, обеспечивающих нормальное развитие эмбриона [Janny, Menezo, 1996]. Часто снижение фертильности предшествует утрате репродуктивной функции. У мышей и крыс с увеличением возраста самки уменьшается число особей в помете, что вызвано нарушениями развития зародышей на до- и постимплантационных стадиях [Jurisicova et al, 1998b]. У женщин с увеличением возраста резко усиливается дегенерации ооцитов и снижается жизнеспособность эмбрионов [Templeton et al, 1996; Боярский, Василевская, 1998].
В доимплантационный период развития нарушения, влияющие на жизнеспособность эмбрионов, связаны с процессами активации генома, компактизации и кавитации. Нарушения развития в этот период выявляют по следующим морфологическим признакам: отставание по стадии развития, малое количество клеток в эмбрионе, изменение формы эмбриона, наличие фрагментации. Если своевременно не пройдет активация генома зародыша, то развитие останавливается на этапах дробления [Schultz et al, 1999]. При нарушениях компактизации часть бластомеров может не участвовать в формировании морулы и исключаться из развития. Темпы компактизации коррелируют с частотой имплантации. У человека при степени фрагментации цитоплазмы бластомеров менее 10% объема эмбриона, быстрая компактизация свидетельствует о хорошей способности к имплантации. Когда фрагментация превышает 10% объема эмбриона, быстрая компактизация, напротив, указывает на снижение его жизнеспособности [Skiadas et al, 2006]. В процессе кавитации может сформироваться несколько полостей, ВКМ бластоцист может состоять из малого числа клеток или отсутствовать, трофэктодерма может образоваться из нескольких крупных клеток [Alikani et al, 2000].
Нарушения раннего эмбрионального развития могут иметь разную природу. Причинами аномалии или остановки развития могут быть нарушения гаметогенеза, оплодотворения, доимплантационного развития, гормональный статус самки, инфекционные заболевания. Доимплантационное развитие млекопитающих регулируют паракринные факторы материнской половой системы и аутокринные факторы, продуцируемые самими эмбрионами. Например, при культивировании in vitro фактор некроза опухоли a (TNFa) снижает скорость пролиферации клеток ВКМ и увеличивает число резорбций [Wuu et al, 1999], а трансформирующий фактор роста a (TGFa) и эпидермальный фактор роста (EGF), напротив, способствуют формированию полноценных бластоцист [Pampfer, Donnay, 1999; Hardy, Spanos, 2002].
Контроль клеточного цикла, своевременное обнаружение и исправление повреждений или элиминация дефектных клеток способствуют нормальному развитию эмбрионов. Клеточный цикл - это каскад биохимических процессов, в которых циклины в определенной последовательности активируют соответствующие циклин-зависимые киназы. Циклин-зависимые киназы Cdk2 и cdk4 регулируют начало репликации ДНК, cdkl (cdc2) запускает митоз. Циклины S фазы осуществляют G1/S переход, циклины М фазы - G2/M переход [Heichman, Roberts, 1994; King, et al, 1994; Zhou, Elledge, 2000]. В эмбрионе мыши сверочные точки, контролирующие основные переходные процессы клеточного цикла, начинают работать в первом митотическом делении зиготы. Циклин А2, регулирующий прохождение S-фазы и митоза, в начале дробления синтезирутся с мРНК, запасенных в оогенезе, позже активируется геном зародыша и идет замещение материнского белка эмбриональным [Fuchimoto et al., 2001]. Несмотря на активность сверочных точек на этапах дробления в бластомерах часто накапливаются ошибки, связанные с нарушениями в клеточных циклах. Такое противоречие может быть связано с постепенным становлением контрольных точек цикла в период дробления, переходом с материнских транскриптов на эмбриональные, или с тем, что эмбриональные сверочные точки пропускают больше ошибок, чем сверочные точки в соматических клетках. Ошибки и аномалии клеточных циклов в бластомерах чаще связаны с прохождением митоза, так как тут контрольная система сложнее, чем в интерфазе [Fulka et al, 1999]. Было показано, что за остановку клеточного цикла в G2/M сверочной точке при неполной репликации или повреждении ДНК отвечает белок Chkl (от checkpoint kinase). Отсутствие этого белка нарушает пролиферацию и дифференцировку бластомеров, приводит к апоптотической гибели клеток ВКМ бластоцист [Takai et al, 2000].
В доимплантационный период развития многие эмбрионы останавливаются на различных стадиях как in vitro, так и in vivo. После экстракорпорального оплодотворения ооцитов человека 70% эмбрионов проходят первые три деления дробления за 3 дня, менее половины эмбрионов вступает в процесс кавитации, и лишь треть формирует морфологически нормальные бластоцисты. Даже эмбрионы с нормальной морфологией могут иметь хромосомные аномалии, а примерно 60% остановившихся в развитии эмбрионов являются генетически неполноценными: анеуплоидными или мозаичными [Воробьева и др., 1998]. Хромосомные аномалии влияют на раннее развитие, нарушая количественное соотношение мРНК и белков: одних мРНК и белков эмбриону не хватает, другие присутствуют в избытке.
Вьщеление и культивирование клеток из подкожной жировой ткани человека
Эксперименты были выполнены на мышах инбредных линий SAM (senescence-accelerated mouse): SAMP1 (senescence-accelerated mouse prone) и SAMR1 (senescence-accelerated mouse resistant), любезно предоставленных проф. Т.Такедой и проф. М.Хосокавой (Университет Киото, Япония). С 1995 эти линии мышей разводят в виварии кафедры эмбриологии Биологического ф-та МГУ. В работе также использовали мышей линии СВА, аутбредной линии ICR и мышей-гибридов C57B16/DBA, BALB/DBA. Мыши ICR и гибриды C57B16/DBA BALB/DBA, отличающиеся нормальной продолжительностью жизни и хорошей плодовитостью, были взяты как контроль к мышам линий SAM. Бластоциста мышей линии СВА использовали для получения инъекционных химер с суспензиями ксеногенных низкодифференцированных клеток. Объектом исследования служили ранние эмбрионы мыши (от двухклеточной стадии до бластоциста), плоды на стадиях 17.5, 18.5 суток после спаривания - "days post-coitum" (dpc), мышата в возрасте 2-3 месяцев (табл. 3-1).
Разведение и содержание животных. Самцов и самок содержали в разных клетках в виварии на кафедре эмбриологии Биологического факультета МГУ. В виварии температура поддерживается на уровне 20-22С, световой день составляет 14 часов. Мыши получали комбикормом и воду ad libitum.
Получение датированной беременности. Для получения самок с известным сроком беременности в вечернее время суток производили подсадку половозрелых самок к половозрелым самцам возраста 11-20 недель. Факт спаривания устанавливали утром следующего дня (в 9-Ю часов) по наличию у самки вагинальной пробки - сгустка во влагалище, образующегося при коагуляции эякулята. Так как мыши обычно спариваются в середине темного периода суток, в день обнаружения вагинальной пробки срок беременности считали 0.5 суток.
Выделение эмбрионов. Самок со сроками беременности 1.5, 2.5, 3.5, 17.5 и 18.5 dpc умерщвляли дислокацией шейных позвонков. Вскрытие брюшной полости и вымывание доимплантационных эмбрионов (двух-, четырехклеточных - из яйцевода, морул и бластоцист - из рогов матки) осуществляли по стандартной методике [Майк, 1990; Hogan el al, 1994]. У самок со сроками беременности 17.5 и 18.5 dpc вскрывали брюшную полость, извлекали матку вместе с яйцеводами и яичниками по стандартной методике [Белоусов и др., 1990].
Серии экспериментов кол-во животных кол-во эмбрионов линия животных Изучение нарушений раннего развития in vivo 109 853 SAMP1 131 SAMR1 144 ICR 356 C57B16/DBA 358 BALB/DBA Исследование спонтанных и индуцированных нарушений раннего развития in vitro; влияние АсОДН к мРНК гена Hrk 82 280 SAMP1 90 ICR 317 C57B16/DBA Изучение раннего развития после введения ксеногенных клеток 53 339 СВА Исследование влияния АсОДН к мРНК генов HRK, FASL и ВАХ человека на раннееэмбриональноеразвитие 131 623 C57B16/DBA на постимплан-тационноеразвитие 110 плодов C57BI/DBA на поведение ирепродукцию 70 C57B16/DBA 11 C57B16/DBA
Выделение и культивирование клеток из подкожной жировой ткани человека
Подкожная жировая ткань человека была получена в хирургических отделениях городских больниц при плановых операциях с добровольного согласия пациентов. Для получения культуры клеток из подкожной жировой ткани фрагменты материала в стерильных условиях измельчали механически в растворе Хэнкса с 1% цефазолина и подвергали ферментативной дезагрегации 0,075% раствором диспазы и коллагеназы II (40-60 минут, 37С). Полученную суспензию клеток центрифугировали (5 минут, 1000 об/мин) с раствором Хэнкса, осадок ресуспензировали в ростовой среде, фильтровали через сито (BD Falcon, cell stamer, 40 urn) и рассевали на чашки Петри (d-60 мм, "Nunc"), посевная концентрация составляла не менее 1 млн кл/мл. При достижении культурой клеток конфлюэнтного состояния осуществляли пассирование, используя 0,25% раствор трипсина.
Для вымывания и кратковременной инкубации доимплантационных эмбрионов использовали среды KSOM HEPES с бычьим сывороточным альбумином (рН=7.2-7.4) и Flashing. Для культивирования эмбрионов использовали среду Т6 с бычьим сывороточным альбумином (БСА) [Quirtn et ah, 1982], Клетки, полученные из подкожной жировой ткани, культивировали в ростовой среде DMEM / F12 (1:1) с добавлением L-глютамина (2мМ), гентамицина (50 мкг/мл) и 10% эмбриональной телячьей сыворотки, среду меняли каждые 3 суток. Список основных реактивов, использованных при выполнении работы, представлен в таблице 3-2.
Нарушения развития у мышей линии SAMP1 in vivo, доимплантационная гибель
Эмбрионы мышей линии SAMP1 были исследованы на разных сроках развития - через 1.5, 2.5 и 3.5 суток после спаривания (days post-coitum, dpc). Иллюстрации морфологических особенностей эмбрионов на стадии 1.5dpc представлены на рисунках 4-3 и 4-7. При отсутствии нарушений развития к 1.5dpc в яйцеводах были обнаружены двухклеточные эмбрионы, состоящие из равных по величине бластомеров (рис. 4-3, А), а также трехклеточные (рис. 4-3, Б) и четырехклеточные (рис. 4-3. В) эмбрионы. Проницаемость мембран бластомеров, и редукционных телец у таких эмбрионов не была нарушена, и они не окрашивались красителем кита LIVE/DEAD (рис. 4-7, А, Б). На этой стадии развития дегенеративные изменения эмбрионов проявлялись в следующих признаках: сжатие бластомеров, изменение формы бластомеров и изменение структуры цитоплазмы. Наряду с успешно развивающимися (рис. 4-3, А-В) и аномальными эмбрионами (рис. 4-3, Г, Д; рис. 4-7, В, Г) в яйцеводах к 1.5dpc часто присутствовали дегенерирующие неоплодотворенные ооциты (рис. 4-3, Д, Е; рис. 4-7, Д-3).
Иллюстрации морфологических особенностей эмбрионов на стадии 2.5dpc представлены на рисунках 4-4 и 4-5. К 2.5dpc нормально развивающиеся эмбрионы состояли из 8-16 клеток, в них начиналась компактизация. В нижней части яйцеводов на 2.5dpc наряду с нормально развивающимися эмбрионами (рис. 4-4, А) были обнаружены фрагментирующиеся и дегенерирующие зародыши, эмбрионы, остановившиеся в развитии в период дробления (рис. 4-4, Б-Г). Аномалии развития в период дробления характеризовались нарушением размеров бластомеров, фрагментацией - вплоть до полной деструкции клеток. При окрашивании йодидом пропидия эмбрионов, остановившихся в развитии в период дробления, в отдельных погибших бластомерах было обнаружено по два ядра, то есть цитотомия в них не была завершена (рис. 4-2, А, Б, Ж, 3). На 2.5dpc происходил процесс компактизации, приводящий к формированию морулы (рис. 4-5, А). В процессе компактизации были отмечены следующие нарушения: компактизация не из 8-16 (норма), а из 4-5 клеток (рис. 4-5, В); появление нескольких центров компактизации (рис. 4-5, Б); компактизация, в которой не участвовала часть бластомеров (рис. 4-5, Г). Неполная компактизация могла быть проявлением нарушения компактизации, а также могла свидетельствовать об отставании в развитии.
К 3.5dpc, нормально развивавшиеся эмбрионы достигали стадии бластоцисты (рис. 4-6, А-В; рис. 4-8, А, В). У морфологически нормальных бластоцист мышей линии SAMP1 окрашивание витальным флуоресцентным красителем Хехст 33258 выявило присутствие в муральной трофэктодерме ядер с кольцевой пристеночной конденсацией хроматина (рис. 4-1, Д, Е, И-М, Р). На этой стадии отчетливо проявлялось отставание в развитии. На рисунках 4-2 (И, Л) и 4-6 (И) видно, что в бластоцистах клетки, не вошедшие в компактизацию и не участвующие в развитии, вытеснены в пространство между эмбрионом и блестящей оболочкой. Такие бластомеры не окрашивались красителем кита LIVE/DEAD и йодидом пропидия (рис. 4-2, К, М). В целом нарушения развития проявлялись в замедлении его темпов, остановке в период дробления с последующей фрагментацией (рис. 4-8, Д, Ж, рис. 4-6, Л), в дегенеративных изменениях (рис. 4-6, М). Во фрагментирующихся эмбрионах были обнаружены погибшие клетки и клеточные фрагменты, окрашивающиеся красителем кита LIVE/DEAD (рис. 4-8, Е, 3). В процессе кавитации у эмбрионов были отмечены следующие аномалии: отсутствие внутренней клеточной массы (ВКМ) (рис. 4-6, И), небольшое (1-3) число клеток в трофэктодерме (рис. 4-6, 3), формирование нескольких полостей (рис. 4-6, Г-Е), образование бластоцист из небольшого числа клеток (рис. 4-6, Ж, И, К). Последнее свидетельствует об аномалиях в процесса компактизации, приводящих к исключению части бластомеров из последующего развития.
Обобщенные данные, характеризующие процентное соотношение эмбрионов разного качества на разных стадиях развития у мышей линии SAMP1 представлены на рисунке 4-9 (исходные данные по количеству полученных эмбрионов приведены в таблице 1 приложения). Стадии 1.5dpc и 2.5dpc не различались по количеству полученных у одного животного эмбрионов, по количеству нормальных эмбрионов и эмбрионов с нарушениями развития. На 3.5dpc, по сравнению с 1.5dpc, у большего количества эмбрионов были зарегистрированы различные нарушения (р 0,000). Анализ спектра нарушений не выявил различий по количеству дегенерирующих эмбрионов и эмбрионов с фрагментацией цитоплазмы бластомеров на стадиях 1.5, 2.5 и 3.5dpc. По сравнению с 2.5dpc на 3.5dpc было обнаружено увеличение числа эмбрионов с остановками развития в период дробления (р 0,000). Оценка функциональной значимости выявленных нарушений была произведена путем сопоставления общего количества аномальных эмбрионов, обнаруженных у мышей на стадиях 1.5, 2.5, 3.5dpc и доимплантационной гибели эмбрионов, определенной на стадии 18.5 dpc (данные по количеству плодов и резорбций у мышей линии SAMP1 на 18.5dpc приведены в таблице 2 приложения). Сравнение показывает, что лишь на стадии 3.5dpc количество эмбрионов с нарушениями развития превышало кол-во эмбрионов, погибших в доимплантационныи период (р 0,000; рис. 4-10).
Таким образом, для эмбрионов мышей линии SAMP1 в доимплантационныи период характерны аномалии, проявляющиеся в отставании по стадии развития, изменении формы эмбриона, наличии фрагментации и дегенеративных изменений. Дегенеративные изменения и фрагментация присутствовали в течение всего доимплантационного периода (на стадиях 1.5, 2.5 и 3.5dpc). С течением времени спектр нарушений закономерно расширялся: с 2.5dpc были выявлены различные нарушения процесса компактизации, а на стадии 3.5dpc были обнаружены нарушения кавитации (рис. 4-9, В). Чтобы понять, является ли описанная патология специфической особенностью мышей линии SAMP1, мы провели сравнение доимплантационных эмбрионов у разных линий животных.
Раннее развитие после введения в бластоцисты мыши низкодифференцированных клеток человека
У мышей линий SAM с укороченной средней продолжительностью жизни [Takeda et al, 1997а] признаки старения и различные нарушения проявляются как на уровне организма, так и на клеточном уровне [Hosokawa et al, 1997b]. В том числе у этих животных нарушена пролиферация низкодифференцированных клеток [Odagiri et al, 1998; Yegorov et al, 2001]. На кафедре эмбриологии биологического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова в течение 10 лет выполняются работы по изучению сперматогенеза у мышей линий SAM. У мышей линии SAMP1, склонной к ускоренному старению, сперматогенный процесс протекает относительно нормально, но с высоким уровнем генетической нестабильности [Захидов и др., 1999; Гопко и др. 2003; Кулибин и др., 2005]. Для линий SAMP характерно генетически обусловленное снижение плодовитости, репродуктивный период у этих мышей длится примерно до шести месячного возраста, за это время у одной самки может быть от одной до трех беременностей [Hosokawa et ah, 1997а]. На аутопсийном материале у старых мышей линий SAM часто обнаруживают кисты в яичниках и саркому матки [Takeda et ah, 1997b], что не может не влиять на репродуктивные показатели. Предполагают, что задержки раннего эмбрионального развития, снижение эффективности имплантации и уменьшение числа особей в помете у линий SAMP могут быть вызваны дисбалансом уровней эстрадиола и прогестерона. В первый день беременности в сыворотке крови уровень эстрадиола у самок SAMP на 18,2% выше, а прогестерона на 46,2% ниже, чем у SAMR [Miyamoto et ah 1995]. Другой причиной нарушений эмбрионального развития может быть нарушение функционирования митохондрий, приводящее к окислительному стрессу у мышей линий SAMP [Hosokawa, 2002]. Окислительный стресс увеличивает образования активных форм кислорода, что влияет на оплодотворяющую способность сперматозоидов, качество ооцитов и развивающихся эмбрионов как in vivo, так и in vitro [Agarwal et ah, 2005; Wang et ah, 2003].
У линии SAMP1 отмечена значительная гибели эмбрионов на постимплантационных стадиях развития [Semenova et ah, 2001]. Известно, что нарушения на ранних постимплантационных стадиях коррелируют с аномалиями на доимплантационных этапах [Fleming et ah, 2004]. В доимплантационный период у мышей линии SAMP1 (в соответствии с морфологическими особенностями) нами были выделены следующие аномалии: фрагментация и дегенерация (в течение всего доимплантационного периода), остановки развития в период дробления и нарушения компактизации (с 2.5 dpc), нарушения кавитации (с 3.5dpc), а также отставания в развитии (рис. 4-3, 4-4, 4-5, 4-6). Отставание в развитии не всегда считается аномалией, оно может быть вызвано естественным разбросом в сроках оплодотворения и скорости делений дробления. Однако период, в течение которого матка восприимчива к вылупившейся бластоцисте, ограничен во времени, позже эндометрий матки становится токсичным для бластоцисты [Yoshinaga, 1988]. То есть задержка развития снижает шанс эмбриона имплантироваться.
Морфологические изменения бластомеров эмбриона не всегда однозначно свидетельствуют о его жизнеспособности, например, наиболее заметный признак - фрагментация цитоплазмы бластомеров в некоторых случаях носит обратимый характер [Van Blerkom et al, 2001]. Мы разработали достотачно эффективный метод анализа состояния доимплантационных эмбрионов с помощью комплекса флуоресцентных красителей. Использование комплекса флуоресцентных красителей позволило визуализировать погибшие клетки и их ядра (рис. 4-2), в гибнущих бластомерах обнаружить пикнотические ядра и ядра с пристеночной конденсацией хроматина, которые, возможно, вступают в апоптоз (рис. 4-1, Д, Е, И-М, Р). Подобные особенности были отмечены и в ранних эмбрионах человека [Hardy et al., 2003], что указывает на сходство генетически обусловленных нарушений у SAMP1 и аномалий раннего развития человека. Роль гибели отдельных клеток у нормально развивающихся зародышей не ясна, можно полагать, что этот процесс связан с элиминацией каких-то "дефектных" клеток или регуляцией количества клеток в бластоцисте.
Фрагментация с последующей дегенерацией идет как в неоплод отворенных ооцитах (рис. 4-3, Д), так и в ходе делений дробления (рис. 4-3, Г; рис. 4-4, Б-Г). У мышей линии SAMP1 в доимплантационный период развития уровень фрагментации не изменялся, на стадиях 1.5, 2.5 и 3.5dpc эмбрионы с фрагментацией составляли 6,2%, 5,4%, и 2,6% от общего числа эмбрионов (рис. 4-9). В эмбрионах с обширной фрагментацией некоторые цитоплазматические фрагменты окрашиваются красителем кита LIVE/DEAD, а некоторые ДНК-содержащие фрагменты и красителем кита LIVE/DEAD, и йодидом пропидия (рис. 4-2), что свидетельствует об изменении проницаемости мембран и гибели этих структур.
В раннем развитии идет переход синтеза белков с материнских матриц на эмбриональные, лишь своевременное и согласованное взаимодействие ядерных эмбриональных и цитоплазматических, запасенных в оогенезе, факторов обеспечивает полноценное развитие [Дыбан 1988]. В доимплантационный период развития у мышей линии SAMP1 примерно треть эмбрионов фрагментируется и дегенерирует, что, может быть вызвано нарушениями оогенеза или/и активации генома зародыша. До сих пор однозначной взаимосвязи между фрагментацией и гибелью эмбрионов не установлено. Одни авторы считают апоптоз причиной фрагментации, а сами фрагменты апоптозными тельцами [Jurisicova et ah, 1998b; Warner et ah, 1998; Exley et ah, 1999; Spanos et ah, 2002]. Другие придерживаются диаметрально противоположного мнения о том, что фрагментация запускает апоптоз в эмбрионах [Хи et ah, 2001]. Иногда фрагментация эмбрионов не является летальной, фрагменты лабильны и могут исчезать в ходе эмбриогенеза путем резорбции или лизиса [Antczak, Van Blerkom, 1999]. С одной стороны с цитоплазматическими фрагментами из бластомеров может удаляться избыток проапоптотических факторов, что будет поддерживать жизнеспособность эмбриона. С другой стороны удаление из бластомера в составе цитоплазматических фрагментов необходимых элементов и органелл может активировать программу гибели и снизить жизнеспособность эмбриона. Недавно было высказано компромиссное предположение о существовании, по крайней мере, двух вариантов фрагментации: (1) необратимой - связанной с гибелью эмбрионов и (2) обратимой - не влияющей на эмбриогенез [Jurisikova et ah, 2003]. По нашим данным процент эмбрионов с признаками фрагментации в доимплантационный период развития у мышей SAMP1 in vivo практически не меняется (рис. 4-9), видимо регистрируемая фрагментация носит необратимый характер.
Похожие диссертации на Анализ нарушений раннего эмбрионального развития и их коррекция с помощью антисмысловых олигодезоксинуклеотидов
