Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Эпидемиология и клиническая диагностика рака почки 11
1.2. ДНК-диагностика наследственных форм рака почки 13
1.3. Молекулярно-генетические маркеры спорадического рака почки 22
1.4. Инактивация гена VHL при светлоклеточном раке почки 23
1.5. Аллельные делеции генов-супрессоров 27
1.6. Метилирование CpG-динуклеотидов у человека 33
1.7. Методы анализа метилирования 36
1.8. Метилирование генов-супрессоров при раке почки 38
1.9. Полиморфизмы генов предрасположенности 44
Глава 2. Материалы и методы 50
2.1. Клинический материал 50
2.2. Выделение ДНК из различного клинического материала 51
2.3. Анализ мутаций в кодирующей части гена VHL 52
2.4. Анализ потери гетерозиготносте 53
2.5. Обработка геномной ДНК метилчувствительной рестриктазой 54
2.6. Метилчувствительная ПЦР 55
2.7. Электрофорез в полиакриламидном геле 56
2.8. Тонкое окрашивание нитратом серебра 57
2.9. Электрофорез в агарозном геле 57
2.10. Секвенирование ПЦР-продуктов 57
2.11. Обработка геномной ДНК бисульфитом натрия 57
2.12. Бисульфитное секвенирование 58
2.13. Мультилокусная ПЦР полиморфизмов в генах АВСВ1, TGFBR1, IL10 и VDR 59
2.14. Определение SNP методом минисеквенирования 59
2.15. Статистический анализ данных 60
2.16. Программное обеспечение 61
Глава 3. Результаты и обсуждение 62
3.1. Изучение инактивации гена VHL при спорадическом раке почки 62
3.2. Исследование аллельных делеций генов VHL, RASSF1, FHIT и ТР53 74
3.3. Изучение метилирования генов-супрессоров VHL, RASSF1, FHIT, SFRP1 и CDH1 в опухолях почки 80
3.4. Метилирование гена-кандидата НОХВ13 при спорадическом раке почки 90
3.5. Анализ полиморфных вариантов генов АВСВ1, TGFBR1, ILJOn VDR 94
Заключение : 103
Выводы 105
Практические рекомендации 106
Список литературы 107
- ДНК-диагностика наследственных форм рака почки
- Полиморфизмы генов предрасположенности
- Изучение инактивации гена VHL при спорадическом раке почки
- Изучение метилирования генов-супрессоров VHL, RASSF1, FHIT, SFRP1 и CDH1 в опухолях почки
Введение к работе
Актуальность темы. Ежегодно в мире регистрируют около 200 тыс. новых случаев рака почки и почти 100 тыс. смертей от этого заболевания, что позволяет считать его одной из основных проблем современной онкоурологии. В России диагностируют до 9 тыс. случаев опухолей почки в год, более 90% которых приходятся на почечно-клеточные карциномы - рак почки (РП). По темпам прироста заболеваемости РП уступает только новообразованиям предстательной и щитовидной желез [Алексеев Б.Я., 2007].
В настоящее время диагностика и прогноз РП основываются на данных инструментальных методов исследования и патоморфологических критериях, что далеко не всегда позволяет правильно оценить прогноз заболевания и возможности лечения [Yin-Goen Q., 2006]. Это обусловливает необходимость создания эффективных тест-систем для проведения своевременной лабораторной диагностики, мониторинга и определения прогноза течения РП. Необходимым этапом создания системы маркеров РП является анализ наиболее характерных и часто встречающихся молекулярно-генетических нарушений в первичных опухолях почки. В качестве таких повреждений генома опухолевых клеток могут выступать мутации, потеря гетерозиготности и аберрантное метилирование ряда генов-супрессоров.
Ген VHL инактивируется в большинстве случаев самого распространенного морфологического типа РП - светлоклеточного рака почки (СРП) вследствие соматических мутаций, метилирования промотора и потери гетерозиготности [Banks R.E., 2006]. Также при СРП выявляют аллельные делеции других генов-супрессоров. Вопрос о влиянии мутаций и метилирования VHL и делений генов-супрессоров в области Зр (VHL, RASSF1, FHIT) на прогрессию первичной опухоли и прогноз заболевания остается открытым. Идентифицирован ряд генов-супрессоров, аберрантное метилирование которых наблюдается в различных морфологических типах опухолей [Lovisolo J.А., 2006]. Анализ наиболее часто метилируемых генов будет способствовать созданию системы диагностических и прогностических маркеров РП.
Опубликованы данные об исследованиях полиморфизмов различных генов при РП [Karami S., 2008]. Некоторые полиморфизмы могут представлять
интерес как потенциальные маркеры предрасположенности к спорадическому РП в популяции европейской части России или влиять на течение заболевания.
РП практически не чувствителен к лучевой и химиотерапии, поэтому хирургическое удаление опухоли является основным методом лечения РП. Определенные успехи связаны с внедрением в практику таргетных препаратов, механизм действия которых напрямую связан с генетическими нарушениями в опухолевых клетках [Costa L.J., 2007]. В связи с этим вопрос о лечении метастатического РП и местнораспространенных форм заболевания требует максимально точной оценки прогноза развития первичной опухоли, знания ее особенностей на молекулярно-генетическом уровне.
Таким образом, комплексное исследование соматических мутаций, потери гетерозиготности, метилирования 5'-регуляторных областей генов-супрессоров и полиморфных вариантов генов, задействованных в развитии РП, будет способствовать формированию системы новых молекулярно-генетических маркеров РП.
Целью исследования является комплексный молекулярно-генетический анализ при РП, направленный на выявление и характеристику диагностических и прогностических маркеров заболевания.
Задачи исследования:
Изучить мутации, аллельные делеции и метилирование промотора гена VHL и провести сравнительный анализ выявленных изменений относительно патологических параметров первичной опухоли и клинических особенностей заболевания.
Провести анализ потери гетерозиготности областей локализации генов VHL, RASSF1, FHIT и ТР53 в парных образцах РП на различных стадиях заболевания и степенях дифференпировки первичной опухоли.
Оценить частоты аберрантного метилирования генов-супрессоров VHL, RASSF1, FHIT, SFRP1 и CDH1 в образцах РП и провести сравнительный анализ метилирования этих генов относительно патологических параметров первичной опухоли и клинических особенностей заболевания.
Исследовать метилирование CpG-динуклеотидов в промоторной области гена НОХВ13, построить карту аберрантного метилирования этого гена.
Определить частоты аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов АВСВ1, TGFBR1, IL10, VDR в норме и у больных РП. Провести сравнительный анализ полученных данных между группами пациентов и контроля, а также между различными клиническими группами больных РП.
Научная новизна. Идентифицированы 33 новые мутации в гене VHL. Впервые исследованы сочетанные делеций генов VHL, RASSF1, FHIT и ТР53 при СРП. Изучено метилирование 5'-регуляторных областей генов VHL, RASSF1, FHIT, SFRP1 и CDH1 с помощью мультилокусной метилчувствительной ПЦР. Впервые показана ассоциация аберрантного метилирования RASSF1 с прогрессией первичной опухоли на ранних стадиях РП (Р = 0.047). С помощью бисульфитного секвенирования построена карта метилирования промотора гена-кандидата НОХВ13 в первичных опухолях почки. С помощью нового метода - минисеквенирования с детекцией в режиме фрагментного анализа - изучены полиморфные варианты генов АВСВ1, TGFBR1, IL10 и VDR. Впервые в России определены в норме частоты генотипов исследуемых SNP генов IL10 и TGFBR1, получены данные о возможном влиянии полиморфизмов в генах VDR и TGFBR1 на развитие опухолей почки.
Практическая значимость. Проведено комплексное молекулярно-генетическое исследование 127 первичных опухолей почки (светлоклеточных, папиллярных и хромофобных карцином). Оптимизирован метод комплексной оценки молекулярно-генетических нарушений VHL (соматических мутаций, аберрантного метилирования и потери гетерозиготности) при СРП. Выявлена высокая частота повреждений гена VHL при СРП. Разработаны системы из двух STR-маркеров для тестирования аллельных делеций в областях локализации генов VHL, RASSF1, FHIT и ТР53 при РП. Определена ассоциация множественных аллельных делеций генов-супрессоров на Зр (Р = 0.036), а также метилирования генов RASSF1 и CDH1 с клинико-морфологическими характеристиками опухоли (Р = 0.001), что позволит использовать анализ этих генов в качестве маркеров прогрессии на различных стадиях РП. Результаты, полученные в представленной работе, могут быть использованы в разработке
системы молекулярно-генетических маркеров РП, в частности, определение мутаций и метилирования гена VHL - при оптимизации таргетной терапии. Положения, выносимые на защиту:
Мутации, потеря гетерозиготности и/или метилирование гена VHL происходят на ранних стадиях СРП в большинстве случаев заболевания.
Потеря гетерозиготности двух и более генов-супрессоров, локализованных в области Зр, отражает прогрессию первичной опухоли.
Аберрантное метилирование является существенным механизмом инактивации генов-супрессоров VHL, RASSF1, FHIT, SFRP1, CDH1 и наблюдается в 85% первичных почечно-клеточных карцином. Построена карта метилирования промотора гена-кандидата НОХВ13 при спорадическом РП.
Метилирование генов RASSF1 и CDH1 ассоциировано с прогрессией и метастазированием первичной опухоли, соответственно, что позволяет рассматривать их как составную часть системы молекулярных маркеров РП.
Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации. Все эксперименты и методики были разработаны и проведены автором лично. Автор провел статистический анализ всех полученных данных и сформулировал выводы. Описание собственных исследований, анализ и обсуждение результатов выполнены автором самостоятельно.
Апробация работы. Результаты исследования были представлены на ежегодных Европейских конференциях по генетике человека в 2007-2008 гг., на конгрессах Российского общества онкоурологов в 2006-2007 гг., на Российском онкологическом конгрессе в 2007 г., конференции «Генетика в России и в мире» в 2006 г., конференции по биологии и генетике в 2007 г., конференции «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» в 2008 г., а также на межлабораторных семинарах ГУ МГНЦ РАМН. Прочитана лекция на кафедре генетики Факультета усовершенствования врачей Российского государственного медицинского университета Росздрава.
Публикации. Результаты диссертационной работы отражены в 14 печатных работах соискателя, в том числе, 6 статей опубликовано в журналах,
рекомендованных ВАК МОН РФ соискателям ученой степени кандидата медицинских наук.
Внедрение результатов работы в клиническую практику. На основании результатов проведенной работы разработаны новые медицинские ДНК-технологии «Молекулярно-генетическая методика оценки прогрессии первичной опухоли при светлоклеточном раке почки» и «Молекулярно-генетическая методика оптимизации таргетной терапии при светлоклеточном раке почки» (Разрешения на применение новой медицинской технологии ФС № 2008/150 от 22.07.2008 и ФС № 2008/152 от 23.07.2008, соответственно). Методические подходы, разработанные в диссертационной работе, используются в Межклинической лаборатории молекулярных методов диагностики ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова: анализ терминальных мутаций в гене VHL при диагностики синдрома Хиппеля-Линдау, определение аллельных делеций генов-супрессоров в области Зр при спорадическом РП.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 123 страницах машинописного текста, состоит из оглавления, введения, списка сокращений, обзора литературы, подробного изложения использованных материалов и методов, описания собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы, включающего 143 ссылки. Диссертация иллюстрирована 18 таблицами и 18 рисунками.
ДНК-диагностика наследственных форм рака почки
Примерно в 2% случаев наблюдают семейные формы РП и/или опухоли развиваются как часть клинической картины наследственного онкологического синдрома [99]. Изучение семейных форм РП позволило идентифицировать ряд генов, вовлеченных в канцерогенез почечно-клеточных карцином и расширить возможности ДНК-диагностики. В настоящее время описано около 10 форм семейного РП (табл. 1). Из них наиболее полно охарактеризованы синдромы Хиппеля-Линдау, наследственная папиллярная карцинома 1-го типа, синдром Берта-Хогга-Дьюба.
Синдром Хиппеля-Линдау (OMIM 193300) назван так по именам немецкого офтальмолога Иогана фон Хиппеля и шведского патолога Арвида Линдау, которые в начале ХХ-го века описали клиническую картину заболевания и установили его наследственный характер [104]. Это аутосомно-доминантный онкологический синдром с частотой 1:36000 новорожденных и пенетрантностью 80%. Опухоли могут развиваться в органах-мишенях в различном возрасте. Наиболее часто встречаются светлоклеточная карцинома почки, гемангиобластомы сетчатки и ЦНС, феохромацитома надпочечника, гораздо реже - опухоли эндолимфатического протока внутреннего уха, аденомы поджелудочной железы. Средний возраст манифестации заболевания при наличии гемангиобластом сетчатки и ЦНС составляет 25-30 лет, у пациентов с синдромом Хиппеля-Линдау (VHL-синдромом) 2-го типа наиболее ранним проявлением является развитие феохромацитомы - до 10 лет. Светлоклеточная карцинома почки представляет собой наиболее частое проявление VHL-синдрома, выявляемое у 50% пациентов в возрасте до 40 лет. Средняя продолжительность жизни больных синдромом Хиппеля-Линдау не превышает 50 лет. Причина смерти -осложнения и метастазы от почечноклеточных карцином и гемангиобластом ЦНС [41, 98].
VHL-синдром обусловлен мутациями в одноименном гене VHL, который локализован в области Зр25, содержит 3 экзона и кодирует белок длиной 213 аминокислотных остатков. Белковый продукт функционирует как компонент мультипротеинового комплекса, в котором осуществляется убиквитин-зависимая деградация гипоксией индуцируемого фактора HIF-la. Ген-супрессор VHL инактивируется в опухоли в соответствии с двухударной моделью Кнадсена. Один из аллелей этого гена несет терминальную мутацию во всех клетках организма, тогда как второй аллель повреждается при канцерогенезе в результате соматической мутации, протяженной делеции или метилирования. При отсутствии белка VHL в клетке накапливается фактор HIF-la, индуцирующий экспрессию факторов роста VEGF, PDGF, TNF-a и др., многие из которых являются стимуляторами клеточной пролиферации. Такой каскад событий рассматривают как основную модель влияния мутаций VHL на формирование клона опухолевых клеток. Почка больного с VHL-синдромом может содержать до 600 микроскопических кист и очагов неопластического роста [97,98]. В гене VHL найдены мутации различных типов: миссенс, нонсенс, сдвига рамки считывания.
Для VHL-синдрома характерны гено-фенотипические корреляции. В зависимости от вовлечения в опухолевый процесс различных органов-мишеней и особенностям мутации VHL-синдром условно подразделяют на несколько типов (табл. 2). Выделяют VHL-синдром 1-го типа (без феохромацитомы и с высоким риском СРП) и 2-го типа (с феохромацитомой). В первом случае на генетическом уровне определяют мутации сдвига рамки считывания (делеции, инсерции, комплексные мутации), нонсенс-мутации, реже — миссенс-мутации, препятствующие формированию зрелого белка VHL. Для VHL-синдрома 2-го типа, напротив, характерны точковые миссенс-мутации, кластеризующиеся в участках гена, кодирующих участки связывания VHL с HIF-la или элонгином С. Кроме того, описаны миссенс-мутации, встречающиеся только у пациентов с семейной феохромацитомой без развития опухолей в других органах-мишенях. В указанных случаях требуется проведение дифференциального диагноза с синдромом множественной эндокринной неоплазии 2-го типа и нейрофиброматозом 1-го типа. В связи с этим можно предположить, что для развития СРП характерна потеря всех функций гена, тогда как при феохромацитоме происходит утрата и/или изменение лишь некоторых из них [54, 98, 116, 132]. Анализ миссенс-мутаций при VHL-синдроме 2-го типа показал, что развитие СРП связано с аминокислотными заменами, нарушающими фолдинг белка VHL, тогда как мутации при синдроме Хиппеля-Линдау типа 2С приводят к заменам определенных поверхностно расположенных аминокислотных остатков и не влияют на способность VHL инактивировать HIF-la в экспериментах с клеточными культурами. В развитии VHL-ассоциированных феохромацитом, по-видимому, задействованы принципиально иные механизмы, чем при развитии СРП [111].
Анализ герминальных мутаций VHL позволяет, во-первых, выявить мутацию у пробанда и его родственников, что служит основным диагностическим тестом при медико-генетическом консультировании больного с подозрением на синдром Хиппеля-Линдау. Во-вторых, вследствие гено-фенотипических корреляций тип мутации указывает на органы-мишени, наиболее подверженные риску развития опухолей при этом синдроме.
Наследственная папиллярная карцинома 1-го типа (OMIM 605074) - аутосомно-доминантное заболевание, характеризующееся развитием мультифокальных папиллярных карцином 1 -го типа, причем часто обнаруживают билатеральные опухоли (рис. 1). Причина этой формы наследственного РП - активирующие мутации в протоонкогене МЕТ. Ген МЕТ кодирует рецептор для фактора роста гепатоцитов (HGF), который, несмотря на данное ему название, действует на различные типы клеток. При связывании лиганда рецептор претерпевает конформационные изменения, приводящие к активации его цитоплазматического домена и передачи сигнала вторичным мессенджерам, что, в свою очередь, направлено на стимуляцию пролиферации клеток.
Мутации гена МЕТ при папиллярной карциноме приводят к конститутивной активации цитоплазматического домена независимо от HGF и неконтролируемому размножению клеток. Примечательно, что гены MET, KIT, RET относятся к одному семейству генов тирозин-киназных рецепторов, а нуклеотидные последовательности этих генов, которые кодируют активирующие домены, обладают значительной гомологией. Точковые мутации в протоонкогене МЕТ при папиллярной карциноме приводят к аминокислотным заменам в тех же позициях, что и активирующие мутации в генах KIT и RET при других заболеваниях [29, 97, 98]. Прямая ДНК-диагностика при наследственной папиллярной карциноме 1-го типа заключается в идентификации мутаций в экзонах 15-21 гена МЕТ, кодирующих цитоплазматический домен рецептора.
Синдром Берта-Хогга-Дьюба (BHD-синдром, OMIM 135150) обязан своим названием трем канадским врачам, охарактеризовавшим его как нозологическую единицу и описавшим тип наследования. Это аутосомно-доминантный онкологический синдром, связанный с развитием множественных гамартом волосяных фолликулов кожи (фиброфолликулом и триходиском), примерно у 30% больных развиваются легочные кисты и возникает риск спонтанного пневмоторакса, у 20% пациентов развиваются опухоли почки. Новообразования почки при этом синдроме часто мультифокальные, билатеральные, принадлежат к разным гистологическим типам: папиллярной карциноме, онкоцитоме, хромофобной карциноме. Все указанные признаки BHD-синдрома могут встречаться у одного пациента (рис. 2) [97, 120].
BHD-синдром развивается вследствие терминальных мутаций в гене-супрессоре FLCN, локализованном в области 17р11.2. Этот ген содержит 14 экзонов и кодирует белок фолликулин длиной 579 аминокислотных остатков [109]. Экспрессия гена FLCN в норме отмечена во многих типах тканей, особенно выражена в дистальных нефронах почки, коже и ее производных, пневмоцитах 1-го типа в легких. Указанные области повышенной экспрессии этого гена в норме, в целом, согласуются с очагами патологических изменений и локализацией новообразований при инактивации FLCN. Фолликулин не содержит доменов, имеющих необходимую степень гомологии с уже охарактеризованными белками, чтобы можно было прогнозировать его функции на основе данных сравнительного анализа, функции фолликулина в настоящее время изучают.
Полиморфизмы генов предрасположенности
Повышенный риск развития спорадического РП у родственников пациента, влияние курения и неблагоприятных факторов внешней среды на увеличение риска заболевания позволяют рассматривать его как мультифакториальное с генетической предрасположенностью [99]. В последнее время расширяются исследования, связанные с поиском и характеристикой полиморфных вариантов ДНК в кодирующих и некодирующих районах генов, в той или иной степени вовлеченных в канцерогенез (CYP19, CYP1A1, CCND1, ММР1, ТР53, GSTP1 и многие другие).
Генетический полиморфизм выражается в эволюционно закрепленном существовании в популяции нескольких аллелей одного и того же гена. На молекулярном уровне полиморфизм означает наличие разных вариантов нуклеотидных последовательностей, которые совместимы с нормальной функцией генома в онтогенезе, но могут приводить к определенным вариациям в структуре белков. Полиморфные локусы локализованы преимущественно в некодирующих последовательностях, подобных сателлитным ДНК, интронам и межгенным спейсерам, т.к. любые изменения в кодирующих и регуляторных областях структурных генов подвержены жесткому давлению естественного отбора. Тем не менее, генетические полиморфизмы могут приводить к появлению белковых продуктов с измененными физико-химическими свойствами и/или ферментативной активностью.
Обнаруженные в исследованиях по программе HGD (Human Genome Diversity) особенности распределения полиморфизмов показывают, что на их встречаемость влияют, наряду с эффектом основателя, факторы естественного отбора. Например, полиморфизм фермента NAT2 (фермент второй фазы детоксикации ксенобиотиков) обуславливает наличие «быстрых» и «медленных ацетиляторов», установлена ассоциация полиморфизмов NAT2 с различными заболеваниями, в том числе и онкологическими [7]. Полиморфные участки могут влиять, в зависимости от локализации, и на активность транскрипции. Для этого полиморфизм должен затрагивать промоторную область гена, области энхансеров, сайленсеров или аттенюаторов.
Например, полиморфизм микросателлитного СА-повтора в промоторной области гена COL1A2, кодирующего коллаген 1 -го типа, влияет на эффективность транскрипции этого гена [102]. Даже если полиморфизмы расположены не в функционально значимых участках, ряд аллелей таких полиморфизмов зачастую оказывается сцепленным с участком ДНК, несущим функциональную нагрузку. Это позволяет использовать данные полиморфизмы в качестве удобного молекулярного маркера. Выделяют три вида генетического полиморфизма: замены отдельных нуклеотидов, количественные изменения в области локализации мини- и микросателлитных последовательностей ДНК и инсерции/делеции фрагментов генома. Однонуклеотидные замены (SNP - Single Nucleotide Polymorphism) встречаются во всех хромосомах с частотой приблизительно один сайт на 500 п.н., представляя собой наиболее распространенный вид генетического полиморфизма [7].
На сегодняшний день опубликовано около 15 работ, посвященных сравнительному анализу частот аллелей и генотипов различных полиморфизмов между группами больных РП и популяционного контроля, а также в различных клинических группах пациентов со злокачественными опухолями почек (табл. 4). Исследованные гены относятся к различным семействам и сигнальным путям, влияющим на развитие РП. Это гены детоксикации ксенобиотиков (CYP1B1, АВСВ1), цитокинов и их рецепторов (NFKB1, ILJO, IL4R, TNFA), матриксных металлопротеиназ {ММР1, ММРЗ), компонентов сигнальных путей регуляции клеточного цикла (ТР53, MDM2, BCRP, TGFBR1) и др. Некоторые из найденных ассоциаций могут быть характерны лишь для определенной этнической группы [72, 73, 90, 119, 129], в ряде исследований объемы выборок и чувствительность используемых статистических критериев не позволяли сделать однозначные выводы при сравнении частот аллелей и генотипов [30]. Если рассматривать совокупность полиморфизмов, которые могли бы быть изучены как потенциальные маркеры предрасположенности в популяции Европейской части России, то целесообразно акцентировать внимание на ранее выявленных положительных ассоциациях. При этом полученные результаты, предпочтительно, относились бы к европеоидной расе и/или полиморфизмам, непосредственно влияющим на экспрессию (функцию) генов. Названным критериями могут соответствовать SNP генов АВСВ1, TGFBR1, IL10, VDR.
Ген АВСВ1 (7q21.1; другое название - MDR1) кодирует трансмембранный гликопротеин (Р-гликопротеин), который осуществляет АТР-зависимый транспорт ксенобиотиков. Этот ген интенсивно экспрессируется в тканях, осуществляющих экскреторную функцию различных органов: тонкого кишечника, почки, плаценты. В почке наибольшая активность Р-гликопротеина отмечена в эпителии проксимальных канальцев, где он выполняет протективную функцию, ограничивая поступление токсических веществ в клетки. Генотип ТТ полиморфизма С3435Т в гене АВСВ1 ассоциирован со сниженной экспрессией Р-гликопротеина и повышенным риском РП [55,122].
Один из ключевых путей регуляции клеточного цикла - сигнальный каскад, запускаемый трансформирующим фактором роста р (TGF-p). Рецептор 1-го типа для TGF-P представляет собой необходимое звено в цепи передачи сигнала в этом регуляторном пути. Этот рецептор кодируется геном TGFBR1 (9q33), в котором описан полиморфный вариант int7G24A. Показано, что аллель А этого SNP ассоциирован с риском развития РП и рака мочевого пузыря. Влияние замены G/A в позиции +24 от донорного сайта сплайсинга на структуру первичного транскрипта в настоящее время изучается [40].
Интерлейкин-10, кодируемый геном IL10 (lq31), - плейотропный цитокин, концентрация которого в периферической крови повышена у больных РП. Интерлейкин-10 реализует комплекс провоспалительных эффектов. Также этот цитокин стимулирует экспрессию VEGF и, продуцируемый регуляторными Т-клетками, ингибирует действие дендритных клеток. Последние два эффекта могут способствовать возникновению и развитию опухоли. Установлена ассоциация генотипа АА полиморфизма G-1082А в гене IL10 с повышенным риском развития РП [66].
Активный витамин D3 (l,25(OH)aD3) имеет широкий спектр биологических эффектов, в том числе, влияет на процессы клеточной дифференцировки и канцерогенеза. Свое действие D3 реализует через связывание с рецептором, который относится к ядерным гормональным рецепторам, т.е. после связывания с лигандом интернализируется в ядро, где вместе с коактиваторами запускает транскрипцию генов-мишеней. Этот рецептор кодируется геном VDR (12ql3). Аллель Т полиморфизма Taql в этом гене ассоциирован со сниженным уровнем активного витамина D3 в сыворотке крови у больных РП, а генотип ТТ в одном из исследований был ассоциирован с повышенным риском развития РП и прогрессированием первичной опухоли [78]. Таким образом, анализ полиморфных вариантов генов АВСВ1, TGFBR1, ILJO, VDR в норме и у больных РП можно рассматривать как одну из актуальных задач поиска маркеров предрасположенности к этому заболеванию в европейской части России.
В целом, статус гена VHL в первичной опухоли, ПГ областей локализации генов-супрессоров, аберрантное метилирование их 5 -регуляторных областей и предрасполагающие аллельные варианты полиморфизмов различных генов могут быть интегрированы в общую схему молекулярно-генетических маркеров спорадического РП.
Изучение инактивации гена VHL при спорадическом раке почки
Инактивация гена VHL вследствие молекулярно-генетических нарушений выявляется в большинстве светлоклеточных карцином почки, при этом влияние инактивирующих событий на развитие опухоли неоднозначно. В настоящей работе определяли мутации, аллельные делеции и метилирование как причины инактивации гена VHL. В 4 образцах папиллярных и хромофобных карцином не выявлено мутаций, ПГ или метилирования VHL. Эти образцы были исключены из дальнейшего анализа нарушений VHL, которые изучали в выборке 123 СРП. С целью поиска мутаций в кодирующей части VHL амплифицировали 3 экзона и проводили SSCP-анализ с последующим секвенированием (рис. 10). Поскольку длина ПЦР-продукта первого экзона превышала оптимальный размер фрагментов при SSCP-анализе, проводили дополнительную обработку ПЦР-продукта рестриктазой NotI и анализировали фрагменты длиной 194 и 222 п.н. Учитывая частичную деградацию ДНК, выделенную из парафиновых блоков, при амплификации первого экзона архивных образцов анализировали 3 -область длиной 175 п.н., где мутации обнаруживают наиболее часто. Мутации VHL были определены в 31.7% (39/123) СРП (табл. 11). Все выявленные мутации соматические, т.е. присутствовали только в опухолевой ткани и не обнаружены в соответствующих им образцах нормальной почечной паренхимы, что, наряду с клиническими данными, позволило исключить синдром Хиппеля-Линдау и рассматривать имеющиеся образцы как выборку спорадического СРП. Архивные образцы опухолей унилатерального СРП также были получены от пациентов без семейной истории заболевания.
Среди мутаций 69.2% (27/39) составляли делеции, протяженность которых варьировала от 1 до 42 п.н., 18.0% (6/39) - инсерции, дупликации и комплексная мутация, оставшиеся 12.8% (5/39) приходятся на однонуклеотидные замены. Обозначения мутаций даны в соответствии с международными рекомендациями HGVS (Human Genome Variation Society), размещенных на сайте http://www.hgvs.org/mutoomen/.
Все мутации сопоставлены с банком данных мутаций UMD и HGMD и опубликованными работами по поиску мутаций VHL. Впервые идентифицированные мутации определены в 84.6% (33/39) образцов СРП. Большинство делеций и инсерций, а также дупликации и комплексная мутация, составляющие 56.4% (22/39) мутаций, приводили к сдвигу рамки считывания и формированию новых стоп-кодонов. Три делеции в первом экзоне и одна в 3 -области второго экзона не меняли рамку считывания, но сопровождались потерей сайтов связывания HIFl-a и элонгина С, соответственно. Делеция c.340+2 340+4del повреждала донорный сайт сплайсинга в первом интроне, а делеция c.464-l 469del - акцепторный сайт сплайсинга во втором интроне.
Анализ влияния мутаций на структуру транскрипта проводился с помощью интерактивной программы поиска сайтов сплайсинга (http://www.fi uitfly.org/seq tools/splice.html). Делеция c.336 340del формировала стоп кодон вместо остатка тирозина в позиции 112. Соматические мутации в виде однонуклеотидных замен представляли» собой миссенс мутации p.Asn78Lys (2 случая), p.Tyr98Phe, p.Leul58Val и нонсенс-мутацию p.Glu51X. Первые три миссенс-мутации изменяли структуру участка связывания HIFl-a в р-домене белка VHL, тогда как p.Leul58Val затрагивала участок связывания элонгина С в а-домене VHL. Оба домена необходимы для выполнения белком VHL своей функции.
Выявленные в настоящем исследовании соматические мутации представлены, в основном, делециями со сдвигом рамки считывания, что согласуется с данными других авторов [28, 87]. Более 80% обнаруженных нами мутаций идентифицированы впервые. Существует предположение, что спорадический СРП развивается при полной инактивации VHL («грубых» изменениях нуклеотидной последовательности гена), тогда как для опухолей при синдроме Хиппеля-Линдау характерны точковые мутации, влияющие на определенные функции белка VHL [116]. При спорадическом РП тип мутации VHL может иметь значение для клинической практики, например, при назначении антиангиогенных препаратов. Существуют данные, что опухоли с мутациями VHL типа «loss of function» (нонсенс, сдвига рамки считывания) более чувствительны к ингибиторам VEGF, чем с мутациями других типов [42]. Однако соотношение частот мутаций различных классов при СРП за последние три года корректируется в связи с использованием метода ПЦР в реальном времени для обнаружения делеций. Описаны делеции VHL, протяженность которых превышает один экзон, но не распространяется на весь ген и смежные с ним области. Такие делеции не доступны для исследования методом SSCP или с помощью STR-маркеров, но могут быть выявлены с помощью ПЦР в реальном времени [65, 74].
Аллельные делеции гена VHL при СРП определяли по STR-маркерам D3S1317 и D3S1038. Проанализированы 94 образца замороженных тканей опухолей и соответствующих им образцов нормальной почечной паренхимы, взятых на расстоянии не менее 1.5 см от края новообразования. Информативность используемых микросателлитных локусов составила 47.9% (45/94) для D3S1317 и 77.7% (73/94) - для D3S1038. Система из двух STR-маркеров позволяла определять аллельные делеции в 91.5% (86/94) случаев. ПГ обнаружена в 27.9% (24/86) парных информативных образцов СРП. Полученная частота аллельных делеций меньше, чем в некоторых других работах [5, 134]. Эти различия можно объяснить тем, что клинические образцы светлоклеточных карцином в настоящей работе помимо опухолевых клеток содержали клетки стромы, затрудняющие выявление ПГ. Кроме того, инактивация VHL может быть обусловлена биаллельными делециями и ПГ в неинформативных случаях, доля которых составила 8.5% (8/94) образцов. Тем не менее, полученная частота ПГ отражает возможность выявления аллельных делеций VHL непосредственно в операционном материале или в архивных образцах (срезы с парафинового блока).
Метилирование промотора VHL исследовали с помощью МЧ-ПЦР (рис. 11). Исследовали 94 образца замороженных тканей опухолей и соответствующих им образцов гистологически не измененной почечной паренхимы и 29 парафиновых блоков с архивными образцами СРП (всего 123 опухоли). Метилирование промотора гена определено только в образцах СРП и не выявлено в гистологически нормальной ткани. Частота аберрантного метилирования составила 14.6% (18/123) выборки СРП. Наблюдаемая частота близка к данным литературы [31, 52]. Чтобы сравнить участки CpG-островка, анализируемого в представленной работе и у других авторов, была составлена схема CpG-островка VHL и на ней отмечены положения праймеров (рис. 12). Ранее цитированные литературные источники [28, 31, 52], в которых рассматривалось метилирование VHL, при указании последовательности праймеров для МС-ПЦР ссылались на работу [67]. Опубликованы также праймеры, дизайн которых осуществлен независимо в работе по изучению метилирования генов-супрессоров, локализованных на коротком плече хромосомы 3, при плоскоклеточном раке пищевода [91]. Показано, что все праймеры для МС-ПЦР локализованы внутри участка, изученного в настоящей работе. Один из праймеров всегда содержал CpG-динуклеотиды в позициях -162, -164 и -168, два из которых (-162 и -168) входят в сайты узнавания метилчувствительной рестриктазы BstHHI. Методом МС-ПЦР изучали метилирование восьми остатков цитозина в области с-24-168. В настоящей работе проведен анализ метилирования с помощью МЧ-ПЦР семи CpG-динуклеотидов на том же участке VHL. Причем четыре участка с максимальной плотностью CpG-динуклеотидов были доступны для анализа МЧ-ПЦР, тогда как МС-ПЦР могла определять метилирование только двух таких участков. Таким образом, МЧ-ПЦР и МС-ПЦР могут служить альтернативными методами определения промотора VHL.
В настоящее время проводится поиск молекулярно-генетических маркеров СРП, в частности, метилирования, выявляемых в биологических жидкостях пациента [4, 31, 61, 75]. Создание панели маркеров метилирования открывает перспективу для неинвазивной диагностики СРП. Высокая специфичность метилирования VHL при СРП позволяет рассматривать это инактивирующее событие как перспективный маркер РП, несмотря на относительно низкую частоту аберрантного метилирования [31, 52]. Следует отметить, что метилирование VHL при этом выступает не как индивидуальный маркер канцерогенеза, а в качестве компонента панели метилируемых генов при РП. Например, комбинированный анализ метилирования панели из десяти генов-супрессоров показал, что в 93% случаев РП метилирован хотя бы один из них, частота аберрантного метилирования VHL в этой работе составила 8% [52]. В связи с этим остается актуальным вопрос о совокупности генов, которая включала бы VHL, характеризовалась наибольшей частотой метилированных локусов при различных гистологических типах РП и, вместе с этим, выраженным дифференциальным метилированием в опухолевой и нормальной ткани.
Изучение метилирования генов-супрессоров VHL, RASSF1, FHIT, SFRP1 и CDH1 в опухолях почки
В настоящем исследовании изучено метилирование 5 -регуляторных областей генов-супрессоров, локализованных в области Зр (VHL, RASSF1 и FHIT), а также генов SFRP1 и CDH1. Метилирование определено МЧ-ПЦР с предварительным гидролизом геномной ДНК метилчувствительной рестриктазой BstHHI (рис. 14). Исследованы 98 парных образцов светлоклеточных, папиллярных и хромофобных карцином, 29 парафиновых блоков СРП. В образцах гистологически не измененной почечной парнехимы гиперметилирование генов-супрессоров не выявлено, что позволило рассматривать метилирование в образцах опухолевой ткани как аберрантное. В опухолях аберрантное метилирование VHL определено в 14.2% (18/127), RASSF1 -52.8% (67/127), FHIT - 54.3% (69/127), SFRPJ - 33.1% (42/127) и CDH1 - 41.7% (53/127) случаев. Результаты, полученные методом МЧ-ПЦР, подтверждены БС анализируемых участков генов (рис. 15). Как уже было отмечено, аберрантное метилирование VHL специфично для СРП и его частота близка к данным литературы [28, 124]. Аберрантное метилирование других генов-супрессоров, локализованных на Зр, встречается с большей частотой и обнаружено в образцах опухолей различных гистологических типов. RASSF1 метилирован в 53.7% (66/123) светлоклеточных и в 1 из 2 папиллярных карцином, FHIT - в 54.5% (67/123) светлоклеточных, в 1 из 2 папиллярных и в 1 из 2 хромофобных карцином.
Недавно появились данные о том, что метилирование FHIT было исследовано с помощью МС-ПЦР в 22 образцах СРП, и частота аберрантного метилирования совпадает с установленной в настоящем исследовании — 54.5%. Это может указывать на высокую воспроизводимость и взаимозаменяемость методов МС- и МЧ-ПЦР при анализе CpG-островка гена FHFT при СРП, что позволяет рассматривать его, наряду с VHL, как надежный компонент панели гиперметилированных генов при РП [93].
Метилирование двух указанных генов можно рассматривать как распространенное событие в канцерогенезе опухолей почки. Однако при анализе метилирования RASSF1 в качестве маркера РП необходимо учитывать особенности метилирования этого гена. Во-первых, RASSF1 имеет два альтернативных промотора, которые отвечают за синтез изоформ RASSF1A и RASSF1C. Промоторы локализованы в отдельных CpG-островках, и при РП аберрантное метилирование характерно для CpG-островка полноразмерного гена RASSF1A, который в литературе подразумевается под названием RASSF1 и был исследован в настоящей работе [69]. Во-вторых, ряд исследовтелей обращает внимание на метилирование некоторых CpG-динуклеотидов промотора RASSF1 в нормальной почечной паренхиме, иными словами, в опухолевых клетках происходит гиперметилирование RASSF1 относительно нормы, которое сопровождается подавлением экспрессии гена. Интересно, что полученная частота аберрантного метилирования RASSF1 в настоящей работе соответствовала частоте гиперметилирования этого гена при РП в исследовании цитированных выше авторов. Видимо, этот факт связан с условиями обработки рестриктазой BstHHI и последующей МЧ-ПЦР в этом исследовании и особенностями метода COBRA (combined bisulfite restriction analysis) в работе Tokinaga К. et al. [131]. Методические особенности анализа метилирования могут также влиять на ассоциацию этого инактивирующего события с гистологическими типами РП. Так, при оценке частоты метилирования RASSF1 с помощью МС-ПЦР было показано, что аномальное метилирование этого гена встречается с частотой от 25 до 45% в светлоклеточных и папиллярных карциномах, но не ассоциировано с определенным типом опухоли [106]. Другие авторы исследовали метилирование RASSF1 в образцах светлоклеточной, папиллярной карцином и онкоцитомы с помощью МС-ПЦР в реальном времени. Количественная оценка метилирования позволила определить нормализованный индекс метилирования (NIM).
С использованием NIM было показано, что в светлоклеточных карциномах происходит моноаллельное, а в папиллярных - биаллельное метилирование, что может служить одним из маркеров в дифференциальной диагностике гистологических типов РП [62, 79]. При обсуждении методов выявления и частоты метилирования гена целесообразно руководствоваться задачами конкретного исследования. Если целью работы является дифференциальная диагностика различных типов РП, то изучение аллельного метилирования методом МС-ПЦР в реальном времени может привести к обнаружению новых дифференцирующих критериев этого заболевания. С другой стороны, если проводится поиск генов, наиболее часто подвергающихся метилированию при РП, как в настоящем исследовании, то предпочтение можно отдать менее трудоемким и дорогостоящим методам анализа метилирования, обладающим высокой чувствительностью, таким как МС-ПЦР или МЧ-ПЦР.
Кроме генов-супрессоров VHL, RASSF1, FHFT и CDH1 было изучено метилирование гена SFRP1. Метилирование этого гена наблюдалось с высокой частотой по результатам первого исследования SFRP1 при РП. В настоящем исследовании наблюдаемая частота метилирования SFRP1 отличалась от данных, опубликованных ранее (33% против 68%) [47]. Это может быть объяснено различными методическими подходами в анализе CpG-островка (МС- и МЧ-ПЦР) и репрезентативностью выборок (123 светлоклеточных карциномы в настоящем исследовании и 38 - у других авторов). Недавно опубликовано сообщение о том, что гиперметилирование другого CpG-островка SFRP1, расположенного вне промотора, может наблюдаться в большинстве случаев СРП [48]. Кроме того, частота метилирования может различаться в зависимости от морфологического типа опухоли. Так, ген SPINT2 метилирован при папиллярной карциноме чаще, чем при светлоклеточной. Этот ген кодирует бикунин, ингибирующий передачу сигнала от фактора роста HGF через рецептор МЕТ. Метлирование SPINT2 и снижение экспрессии гена согласуется с активацией сигнального каскада, связанного с рецептором МЕТ, в папиллярных карциномах почки [105].
Интересно, что То K.W. при исследовании РП обнаружили новый ген-кандидат, метилирование которого может быть перспективным маркером при назначении химиотерапии, аналогично метилированию гена MGMT при лечении глиом [114, 130]. Это ген ABCG2, который кодирует АТР-связывающий трансмембранный белок-транспортер и рассматривается, наряду с геном АВСВ1 (MDR1), в качестве гена множественной лекарственной устойчивости. Он способствует резистентности опухолевой клетки к таким препаратам, как топотекан, метатрексат и митоксантрон [50]. Показано, что в некоторых клеточных линиях РП, в частности, UOK121 и UOK143, экспрессия ABCG2 подавлена за счет метилирования [130]. Как указано выше (см. раздел 3.1.)» химиотерапия не эффективна при РП, однако опубликованные данные могут быть полезны для определения чувствительности к препаратам-мишеням при планировании химиотерапии опухолей других органов.
Частота метилирования другого исследованного в этой работе гена - CDH1 -близка к данным литературы [46]. Проведен сравнительный анализ частот метилирования в парных клинических группах в зависимости от стадии заболевания, степени дифференцировки первичной опухоли и метастазирования (табл. 14). Показана ассоциация метилирования CDH1 с прорастанием опухолью капсулы почки (Р = 0.024, OR = 2.40 95% СІ: 1.13-5.08) и наличием метастазов на момент постановки диагноза (Р = 0.001, OR = 5.98 95% СІ: 2.03-17.59). Продукт гена CDH1, Е-кадгерин, участвует в обеспечении контактного торможения пролиферации в эпителиальных тканях, в том числе, в эпителии почечных канальцев. Многократное снижение экспрессии Е-кадгерина в опухолях почки продемонстрировано с использованием экспрессионных микрочипов [123]. Инактивацию гена CDH1 вследствие метилирования можно рассматривать как событие, способствующее инвазивному росту и метастазированию первичной опухоли [46]. Анализ аберрантного метилирования CDH1 на сегодняшний день представляется одним из перспективных прогностических маркеров РП, чему соответствуют результаты настоящего исследования.
В контексте маркеров метастазирования целесообразно упомянуть еще один ген, кодирующий компонент межклеточных контактов и привлекший внимание исследователей генетических нарушений в опухолях почки, - ген-супрессор GJB1. Этот ген отвечает за синтез коннексина 32, который относится к семейству коннексинов, насчитывющему у человека 21 гомологичный белок. Функция коннексинов заключается в построении щелевых контактов для межклеточного транспорта таких мессенджеров, как сАМР, АТР и ионы Са2+. У коннексинов ярко выражены время- и тканеспецифичность экспрессии. В эпителии почечных канальцев экспрессируется коннексин 32, который образует GJIC-комплекс и формирует щелевые контакты, а также ингибирует Src-киназу, демонстрируя функции опухолевого супрессора. В дальнейшем функции гена GJB1 как опухолевого супрессора были подтверждены реверсией трансформированного фенотипа в экспериментах с культурами клеток метастатического РП. В этой работе показано, что коннексин 32 подавлял инвазию и метастазирование опухолевых клеток, возможно, через ингибирование Src-киназы и снижение уровня экспрессии факторов РАН и VEGF [139]. В различных клеточных линиях РП обнаружено аберрантное метилирование CpG-островка GJB1, которое сопровождалось подавлением экспрессии гена [71]. Можно предположить, что метилирование GJB1 имеет место в первичных опухолях почки и будет изучено в дальнейшем.
