Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Клиническая характеристика злокачественных опухолей ЩЖ 11
1.1.1. Гистологическая классификация РЩЖ ...Л 1
1.1.2. Клинико-эпидемиологическая характеристика РЩЖ 12
1.2. Молекулярно-генетические аспекты патогенеза МРЩЖ 14
1.3. Молекулярно-генетические аспекты патогенеза опухолей ЩЖ фолликулярного происхождения 23
1.3.1. Рецептор тиреотропного гормона 24
1.3.2. Протоонкоген RET. 26
1.3.3. ПерестройкаPAX-8/PPARy 36
1.3.4. Протоонкоген ЛГ7Ж/ 38
1.3.5. Протоонкогены семейства RAS 40
1.3.6. Протоонкоген BRAF 43
1.3.7. Протоонкоген МЕТ. , 51
1.3.8. Гены-супрессоры роста опухолей 52
1.4. Резюме 55
Глава 2. Материалы иметоды 57
2.1. Характеристика клинического материала 57
2.2. Забор крови и операционного материала 57
2.3. Выделение геномной ДНК 58
2.4. Выделение РНК из крови и операционного материала 58
2.5. Спектрофотометрическое определение концентрации РНК 59
2.6. Синтез кДНК 59
2.7. Полимеразная цепная реакция 59
2.7.1. ПЦР кодирующих районов гена RET. 60
2.7.2. Сравнительный анализ экспрессии ЕС- и ТК- доменов RET методом полуколичественной RT-PCR 60
2.7.3. Идентификация перестроек RET/PTC1, RET/PTC2, RET/PTC3 и ARFP/RET методом RT-PCR 62
2.7.4. Аллель-специфическая амплификация мутантного аллеля BRAF 62
2.8. Рестриктный анализ 63
2.9. Электрофоретическое разделение ДНК 63
2.9.1. Электрофорез ДНК в неденатурирующем ПААГ 63
2.9.2. Электрофорез ДНК в агарозггом геле 64
2.10. Детекция точковых мутаций методом SSCP 64
2.11.Окрашивание ПААГнитратом серебра 64
2.12. Определение нуклеотидной последовательности 65
2.13. Программное обеспечение 65
Глава 3. Результаты и обсуждение 66
3.1. Молекулярно-генетический анализ гена RET у больных с наследственной и спорадической формами МРЩЖ 66
3.2. Перестройки RET/РТС в тканях ПРЩЖ и других узловых образований ЩЖ 76
3.3. Спектри частота соматических мутациий г&т BRAF при ПРЩЖ и других узловых образовниях ЩЖ 81
3.4. Молекулярно-генетический анализ протоонкогеїюв RETnBRAF у больных с семейным Заключение 102
Выводы 104
Список литературы 105
- Молекулярно-генетические аспекты патогенеза опухолей ЩЖ фолликулярного происхождения
- Гены-супрессоры роста опухолей
- Спектрофотометрическое определение концентрации РНК
- Молекулярно-генетический анализ гена RET у больных с наследственной и спорадической формами МРЩЖ
Введение к работе
Рак щитовидной железы (РЩЖ) является наиболее распространенной злокачественной опухолью эндокринных желез (90%) и составляет около 1% всех диагностируемых злокачественных новообразований. Ежегодно в России регистрируется более б тыс, новых случаев и отмечается тенденция к увеличению заболеваемости РЩЖ. Смертность в результате злокачественных новообразований ЩЖ превышает совокупную летальность от оикопатологий всех остальных эндокринных органов.
В настоящее время методом выбора при лечении злокачественных опухолей ЩЖ, диагностированных клинически и цитологически, является тотальная тиреоидэктомня в сочетании с хирургическим удалением лимфатических узлов, расположенных по путям возможного метастазирования опухоли, Эффективность терапии РЩЖ напрямую зависит от распространенности опухолевого процесса, поэтому первостепенное значение имеет проблема усовершенствования существующих и внедрения новых методов ранней дооперациопной диагностики РЩЖ. Несмотря на то, что РЩЖ занимает скромное место в общей статистике онкологических заболеваний человека, пальпируемые узловые образования ЩЖ различного генеза выявляются в популяции довольно часто (у -1% лиц в возрасте 20 лет и у ~5% лиц в возрасте 60 лет), а при скрининговом ультразвуковом исследовании частота обнаружения узлов ЩЖ достигает 20-50%. Онкологическая настороженность при наличии любого узла в ЩЖ обусловливает необходимость применения современных и более эффективных молекулярно-генетических методов исследования, позволяющих проводить раннюю и досимптоматическую диагностику злокачественных опухолевых образований, а также прогнозировать риск малигнизации узлового образования.
Существует четыре основных гистологических варианта РЩЖ, которые составляют 98% злокачественных опухолей ЩЖ: папиллярный РЩЖ (ПРЩЖ), фолликулярный РЩЖ (ФРЩЖ), анапластический (недифференцированный) РЩЖ и медуллярный (МРЩЖ).
Идентификация генетических факторов, ассоциированных с патогенезом каждого их перечисленных типов РЩЖ, является актуальной задачей современной молекулярной онкологии. С точки зрения фундаментальной науки, дифференцированные опухоли ЩЖ
фолликулярного происхождения {ПРЩЖ и ФРЩЖ) представляют собой уникальную модель для изучения закономерностей патогенеза различных морфологических и клинических типов опухоли, происходящих из одного типа клеток. Становится все более очевидным, что неопластическая трансформация тирсоцита, особенности гистогенеза опухоли, темпы её роста и прогрессия определяются структурными и функциональными нарушениями клеточного генома.
Особая роль в молекулярной этиологии медуллярной и папиллярной тиреокарцином принадлежит протоонкогену RET. Активирующие точковые мутации RET являются причиной 95% случаев семейных форм МРЩЖ. В связи с этим стала возможной досимптоматическая и пренатальная диагностика заболевания в семьях с отягощенной наследственностью методами молекулярной генетики. ДНК-диагностика наследственного МРЩЖ широко применяется во многих медицинских центрах мира, однако не достаточно распространена в практике отечественных эндокринологических и онкологических клиник.
Значительный интерес представляет изучение соматических нарушений генома, маркирующих злокачественные опухоли ЩЖ. Среди таких нарушений наибольшего внимания заслуживают онкогенные перестройки гена RET {RET/PTC) и соматические мутации протоонкогена BRAF, которые, по данным исследований последних лет, специфичны для наиболее распространенного варианта злокачественных опухолей ЩЖ - ПРЩЖ. Настоящее исследование посвящено разработке методических подходов к их выявлению, а также оценке диагностической значимости этих нарушений как потенциальных маркеров ПРЩЖ для российских больных.
Принимая во внимание медицинскую, социальную и научную значимость проблемы злокачественных новообразований ЩЖ, изучение генетических нарушений в опухолевой клетке представляется крайне перспективным направлением в молекулярной и клинической онкологии и позволит расширить наши знания о природе РЩЖ на генетическом уровне.
Цель и задачи исследования
Цель работы - изучение наследственных и соматических молекулярно-генетических изменений, ассоциированных с развитием наиболее частых вариантов РЩЖ и разработка экспериментальных подходов к ранней и досимптоматической диагностике злокачественных новообразований ЩЖ.
Достижение поставленной цели предусматривает решение следующих экспериментальных задач:
Провести поиск и характеристику терминальных мутаций протоонкогена RET у пациентов с различными формами МРЩЖ.
Разработать скрининговый метод выявления химерных онкогенов RET/РТС в тканях узловых образований ЩЖ на основе определения гиперэкспрессии тирозин киї іазного домена RET с помощью полуколичественной RT-PCR.
Определить частоту химерных онкогенов RET/РТС в узловых образованиях ЩЖ и провести идентификацию наиболее распространенных вариантов перестроек в RET/PTC-положительных образцах.
Определить частоту мутаций протоонкогена BRAF в тканях различных узловых образований ЩЖ.
Оценить диагностическую значимость перестроек RET/РТС и соматических мутаций BRAF в качестве потенциальных маркеров злокачественности новообразований ЩЖ.
Научная новизна
В результате проведенного исследования изучен спектр мутаций протоонкогена RET у больных с семейной и спорадической формами МРЩЖ. Выявлено 11 различных мутаций протоонкогена RET у 46 человек из 25 семей. Впервые идентифицирована комплексная терминальная мутация (делеция с инсерцией без сдвига рамки считывания) 1895_1907 delins4 в 11 экзоне RET и впервые в России обнаружена редкая геминальная трансверсия G1891T (D631Y). Установлено, что преобладающим типом терминальных мутаций в гене RET у
российских больных с наследственными формами МРЩЖ являются миссенс-мутации внеклеточного цистеин-богатого домена. Впервые выявлена "молчащая" мутация G2673A (S891S) в семье с наследственным ПРЩЖ.
Впервые в России охарактеризована частота соматических перестроек RET/РТС и мутаций гена BRAF в выборке спорадических узловых образований ЩЖ и показана специфичность этих нарушений для ПРЩЖ. В двух случаях ПРЩЖ выявлены редкие или не охарактеризованные варианты перестроек RET/РТС, а также обнаружен новый онкоген ARFP/RET в ткани радиациоино-индуцированного ПРЩЖ. Помимо стандартной замены Т1796А, впервые при ПРЩЖ описаны две новые соматические мутации гена BRAF: GI753A
(Е585К) и деления dellSOO I SI 1. Механизм онкогенного действия последней мутации,
затрагивающей "активирующий сегмент" киназы B-RAF может представлять теоретический интерес для изучения регуляции ее активности.
Практическая значимость
В результате проведенного исследования разработаны подходы для молекулярной диагностики и характеристики микроструктурной патологии гена RET при наследуемых формах МРЩЖ. Проведена ДНК-диагностика у 72 больных с МРЩЖ из 64 неродственных семей, а также у 30 их здоровых родственников. Практическая значимость работы связна с возможностью досимптоматической диагностики МРЩЖ среди лиц повышенного риска, а также выявления новых семейных случаев МРЩЖ. У 13 человек герминальные мутации RET обнаружены до начала клинической манифестации заболевания, а профилактическое хирургическое лечение проведено четырем из них. У 17 обследованных здоровых родственников носительство мутации было исключено. Наследственный характер заболевания установлен для пациентов со "спорадическим" МРЩЖ из 10 семей.
Высокая частота перестроек RET/РТС и мутаций гена BRAF в обследованных тканях ПРЩЖ (75.8%), а также их абсолютная специфичность для ПРЩЖ делает эти генетические нарушения перспективными молекулярными маркерами злокачественности для дооперационной дифференциальной диагностики ПРЩЖ. Именно ПРЩЖ составляет
большинство случаев РЩЖ (60-80%) и поражает людей трудоспособного возраста (30-50 лет). С этим связана социально-экономическая згшчимость результатов настоящего исследования.
Методы, использованные в данной работе, вполне доступны и могут быть адаптированы к применению в клинических лабораториях. Результаты исследования внедрены в практику МРНЦ РАМН (Обнинск) и ЭНЦ РАМН.
Положения, выносимые на защиту
Определены частота и спектр мутаций протоонкогена RET при различных формах МРЩЖ; наибольшую диагностическую значимость имеют мутации цистенн-богатой области внеклеточного домена RET.
Разработан эффективный скрининговый метод выявления химерных онкогенов RET/РТС с помощью сравнительного анализа экспрессии внеклеточного и каталитического доменов RET.
Соматические перестройки RET/РТС и мутации гена BRAF - специфические молекулярные маркеры ПРЩЖ, которые представляют собой альтернативные механизмы активации RAS-RAF-MEK-ERK МАР-киназного каскада в этиогтатогенезе ПРЩЖ.
Соматические мутации гена BRAF при ПРЩЖ достоверно чаще встречаются у пациентов старшей возрастной группы.
Молекулярно-генетические аспекты патогенеза опухолей ЩЖ фолликулярного происхождения
Около 90% случаев карцином ЩЖ представляют собой хорошо дифференцированные опухоли, среди которых наиболее частым вариантом является папиллярный рак (ПРЩЖ) (80-85%) и фолликулярный рак (ФРЩЖ) (около 15-20% случаев) [Gimm, 2001].
Фолликулярный эпителий ЩЖ представлен высокодифференциро ванными клетками, наделенными эффективной системой захвата иодид-ионов для синтеза, хранения и высвобождения тиреоидных гормонов (тироксина Т4 и трийодтиронина Тз). Соседние тиреоциты запрограммированы на формирование фолликула, который является структурно-функциональной единицей ЩЖ. Такая организация требует строгой поляризации тиреоцита: базальная поверхность импортирует иодид-ионы, а апикальная специализируется на секреции тиреоглобулина в просвет фолликула [Zurzolo etal., 1991].
В отличие от многих других высокоспециализированных клеток, тиреоциты не являются необратимо и терминально дифференцированными, т.е. в нормальных условиях в ответ на определенные ростовые стимулы они способны пролиферировать, временно теряя способность к захвату йода и синтезу тиреоглобулина [Dumont et al., 1991]. Обновление эпителиоцитов ЩЖ за время взрослой жизни человека происходит около 6-ти раз, т.е. деление тиреоцита в среднем происходит 1 раз в 8 лет. В раннем детстве и юности наблюдается гораздо более активная пролиферация клеток ЩЖ [Conde et al., 1992] Существуют сведения о неоднородности степени дифференцировки и пролиферативного потенциала тиреоцитов даже в пределах одного фолликула [Studer et al., 1989].
Клетки, формирующие дифференцированные опухоли ЩЖ, сохраняют молекулярные и функциональные признаки зрелых фолликулообразующих тиреоцитов. Например, они синтезируют тиреоглобулин, тиреопероксидазу, Na/I симпортер, экспрессиругот рецепторы тиреотропного гормона, а также способны захватывать и концентрировать иодид-ноны. Последнее свойство лежит в основе радиойодтсрапии, часто используемой в схемах комплексного лечения дифференцированных РЩЖ после тиреоидэктомии. Принципиальным отличием клеток анапластических карцином является отсутствие у них способности накапливать иодиды, поэтому терапия АРЩЖ включает хирургическое лечение, комбинированную химиолучевую и адьювантную терапию. Согласно современным представлениям, возникновение и прогрессия опухоли -сложные и многостадийные процессы, сопряженные с нарушением структуры и/или функции большого числа генов. Накопление мутаций и других генетических изменений при канцерогенезе приводят к нарушениям регуляции клеточного цикла, апоптоза, морфогенетических реакций и дифференцировки клеток. Ключевую роль в приобретении неопластических свойств клетки играют нарушения функции протоонкогенов, опухолевых супрессоров и т.н. генов-модуляторов. На сегодняшний день уже известны некоторые из тех клеточных событий, которые вовлечены в опухолевую трансформацию тиреоцитов. Накапливается все больше информации о молекулярно-генетических характеристиках различных гистологических типов РЩЖ фолликулярного происхождения.
Тиреогрошшй гормон, секретируемый гипофизом, является основным регулятором дифференцировки тиреоцита и главным ростовым фактором фолликулярных клеток ЩЖ. ТТГ-связывающий гликопротеин (TSH-R, Thyroid Stimulating Hormone Receptor) принадлежит к семейству рецепторов, содержащих семь трансмембранных доменов и сопряженных с G-белками. Образование комплекса ТТГ со своим рецептором стимулирует активность аденилатциклазы/цАМФ-зависимой протеинкиназы (РКА) и [3-изоформ фосфолипазы С (PLC-P) благодаря сопряжению рецептора с ГТФ-азами Gs и Gq/ц соответственно [Vassart et al., 1992]. ТТГ-зависимое повышение концентрации внутриклеточного цАМФ активирует экспрессию тиреоцит-специфических генов и способствует тем самым реализации основных функций этих клеток (синтез тиреоглобулина, захват йода, секреция тиреоидных гормонов). Кроме того, циклический АМФ является положительным регулятором пролиферации и роста тиреоцитов. В связи с этим можно предполагать потенциально онкогенную роль белков-участников ТТГ-зависимого сигнального пути в тиреоцитах [Suarez, 1998; Sarlis, 2000].
Активирущие соматические мутации генов TSHR и GSP (кодирующего о субъединицу гстеротримерного Gs-белка) обнаруживаются, как правило, в тканях автономно гиперфункционирующих аденом ЩЖ. Мутации гена TSHR преимущественно локализуются в той части рецептора, которая контактирует с Gs-белком, а именно в третьей внутриклеточной петле и в шестом трансмембранном домене [Russo et al., 1996; Van Sande et al., 1995]. Их выявляют в 3-82% токсических аденом ЩЖ [Parma et al., 1995; Russo et al., 1996]. Suarez, суммировав свои собственные данные с результатами других авторов, показал, что средняя частота мутаций TSHR в "горячих" узлах ЩЖ составляет около 25% [Suarez, 1998]. Для гена GSP известно два критических кодопа, поражаемых наиболее часто - 201 и 227. Частота обнаружения мутаций GSP варьирует в пределах 7-38%, а в среднем составляет 26% [O Sullivan et al., 1991; Suarez et al., 1998]. При исследовании тканей "холодных" узлов ЩЖ, включая папиллярные и фолликулярные карциномы, мутации TSHR и GSP выявляются крайне редко (0-10%) [Spambalg et al„ 1996; Esapa et al., 1997; Matsuo et al„ 1993]. Так, мутации в кодонах 623 и 632 TSHR были выявлены в карциномах ЩЖ [Russo et al., 1995] и доказаны их трансформирующие свойства на мышиных клетках ЗТЗ [Du Villard, 2000]. Есть мнение, что мутации гена TSHR, в зависимости от локализации, могут стимулировать аденилатциклазу или белки RAS (или их вместе), но активации одной только аденилатциклазы и повышения уровня цАМФ не достаточно для малигнизации тиреоцита [Said et al., 1994; Suarez, 1998].
Еще предстоит выяснить роль других участников TSHR-зависимого сигнального пути в канцерогенезе ЩЖ. Мутаций гена протеинкиназы А в опухолях ЩЖ до сих пор выявлено не было [Ноеking et al., 1993]. Активность фосфолипазы С, по некоторым наблюдениям, повышена в новообразованиях ЩЖ, причем уровень этой активности коррелирует со степенью дедифференцированности опухоли [Hoelting et al., 1993; Kobayashi et al., 1993]. He имеется данных и о роли других G-бслков (Gl} Gj2, G13), сопряженных с рецептором ТТГ [Laugwitz et al., 1995].
TSH-R представляет собой важный маркер дифференцировки фолликулярного эпителия ЩЖ. Хотя активирующие соматические мутации TSHR, несомненно, этиологически связаны с развитием автономно функционирующих тиреотоксических аденом ЩЖ, роль экспрессии TSH-R в других новообразованиях ЩЖ продолжает изучаться. Потеря экспрессии TSH-R была показана в некоторых случаях хорошо дифференцированных карцином ЩЖ [Bronnegard et al., 1994; Cai et al., 1992]. Интересным представляется тот факт, что после трансплантации nude-мышам клеток анапластичсской карциномы человека, предварительно трансфицироваиной кДНК гена TSHR, наблюдался сниженный темп роста опухоли по сравнению с контрольными (петрансфицированными) клетками [Gustavsson et al., 1996].
Гены-супрессоры роста опухолей
Структурные и функциональные нарушения антионкогенов (геиов-супрессоров опухолевого роста), участвующих в контроле клеточного цикла и ограничивающих в норме пролиферацию клеток, нередко выявляются в различных типах злокачественных опухолей. Возникновение и развитие новообразований ЩЖ, однако, относительно редко сопровождаются мутациями антионкогенов.
Wynfordhomas с соавт. [1993] при исследовании классического гена-супрессора RBI в различных сериях опухолей ЩЖ методом Саузерн блот-гибридизации не выявили каких-либо структурных нарушений RBI ни в одном из случаев. Аналогичные результаты были получены Suarez [1998] после обследования выборки из 40 доброкачественных и злокачественных опухолей ЩЖ, Farid и др. [1994], ссылаясь на собственные неопубликованные результаты, сообщают о выявлении мутаций RB1 в 55% карцином ЩЖ. Большинство этих аномалий, по утверждению авторов, представляют собой делеции 21 экзона в кДНК гена RB1, обусловленные нарушением сплайсинга мРНК и не сопровождающиеся мутациями в геномной ДНК. Делеции 21 экзона RB1 на уровне РНК, обусловленные однопуклеотидной заменой G-»A в донорном сайте сплайсинга (21 интрон RB1), были описаны ранее в печеночном метастазе немелкоклеточного рака легких и в клеточной линии DU-145 рака простаты [Weirhompson et al., 1991; Tricoli et al., 1996]. Однако сведения Farid и др. [1994] о высокой частоте соматических мутаций RB1 в опухолях ЩЖ в публикациях других авторов до сих пор подтверждения не получили.
Повреждения опухолевого сулрессора ТР53 играют центральную роль в канцерогенезе многих типов опухолей человека. Инактивирующие мутации ТР53 редко обнаруживаются в дифференцированных карциномах ЩЖ, включая ПРЩЖ, но гораздо чаще выявляются в низкодифференцированных и анапластических тнрео карциномах (25-71%) [Ito, 1992; Donghi, 1993; Fagin, 1993; Zou, 1993]. Согласно результатам Ito (1992) и Zou (1993), мутации относительно равномерно распределены вдоль кодирующей последовательности гена ТР53. В работе Fagin (1993) все выявленные мутации ТР53 представляли собой транзиции CGT-»CAT (Arg-»His) в 273 кодоне. Большинство мутаций 77 55 в анапластической карциноме ЩЖ, согласно обобщению Farid (1994), локализованы в 5-8 экзонах гена, кодирующих консервативный ДНК-связывающий домен р53, а "горячими точками" ТР53, являются ко доны 273 и 278. Интересно заметить, что оба этих кодона содержат CpG-дииуклеотиды, а 90% точковых мутаций ТР53 в апапластическом РЩЖ представлены транзициями G/C— АЛ. Именно такие замены нуклеотидов наиболее часто возникают по механизму спонтанного или ферментативного дезаминирования метилированного цитозина в составе динуклеотидов mCpG [Zou et al., 1993; Farid et al., 1994]. Значение мутаций TP53 в процессе дедифференцировки опухолей ЩЖ было подтверждено экспериментами La Perle [2000]: дифференцированный ПРЩЖ у мышей, экспрессирующих онкоген RET/PTC1, после инактивации р53 приобретал фенотип более инвазивной анапластической тиреокарщшомы.
Одним из часто повреждаемых при злокачественных новообразованиях локусов является участок хромосомы 9р21, содержащий гены трех важнейших опухолевых супрессоров - р16;лИа, р\5,!нК4Ь и pl4/ARF. Супрессорные белки р15 и р16 являются ингибиторньши субъединицами циклинзависимых киназ Cdk4 и Cdk6. Связывая Cdk4 и Cdk6, они препятствуют образованию комплексов с циклинами D, необходимых для продвижения по Gi- и входа в S-фазу клеточного цикла. Нарушение функции р15 и р16 сопряжено с потерей контроля над клеточным циклом и опухолевой трансформацией некоторых типов клеток. Гомозиготные делеции локусов INK4a и INK4b и точковые нонсенс мутации INK4a обнаружены в некоторых клеточных линиях фолликулярного и анапластического РЩЖ, что указывает на участие этих генов в иммортализации тиреоцитов in vitro [Elisei et al., 1998; Ivan et al., 1996]. В опухолевых тканях ПРЩЖ Elisei и др. [1998] обнаружили единичный случай (1/12) точковой мутации Ala91Val и 30% (6/20) случаев гиперметилирования последовательности экзона 1. В работе Yane с соавт. [1996] не было выявлено мутаций INK4a ни в одном из 21 образцов ПРЩЖ. По-видимому, структурные нарушения генов INK4a и INK4b не играют существенной роли в инициации опухолей фолликулярного эпителия ЩЖ. В то же время нельзя исключить возможность эпигенетически обусловленного снижения экспрессии ріб в ряде случаев ПРЩЖ. Наряду с представителями семейства 1пк4 (белки p\6lNK4a и р\51Ж4Ь), важнейшая роль в негативной регуляции клеточного цикла принадлежит циклипзависимым киназам семейства СІр/КІр: р21 , р27 а и р57 . Эти белки связывают и ингибируют сформированные комплексы циклин D-Cdk4(6), циклин E-Cdk2 и циклин A-Cdk2. Кроме того, р21 Л f !Р способен блокировать комплекс циклин B-Cdc2, ответственный за продвижение по Gi-фазе и вход в митоз. Таким образом, белок р21, продукт гена WAF1, является универсальным ингибитором циклинзависимых киназ, Shi и др. [1996] обнаружили делеции WAFI в 10.2% (5/49) образцов ПРЩЖ, но ни в одной из 8 доброкачественных фолликулярных аденом ЩЖ. Поскольку р21Ж4Г/ является одной из основных мишеней трансактивационного действия р53, снижение его экспрессии следует ожидать в низкодифференцированных карциномах ЩЖ, содержащих мутации ТР53, Действительно, согласно результатам Zedenius и др. [1996], опухоли ЩЖ, в которых обнаружены мутации ТР53, демонстрировали существенно сниженный уровень экспрессии гена WAF1. Дальнейшие исследования помогут выяснить роль других негативных регуляторов клеточного цикла в канцерогенезе ЩЖ.
Успехи фундаментальной науки за последние 10-15 лет в значительной степени обогатили знания о молекулярно-генетической основе патогенеза различных типов опухолей ЩЖ. Изучение генетических нарушений позволили выделить наследственные (семейные) случаи МР1ДЖ в отдельную клинико-нозологическую единицу, превентивное выявление которых стало возможным на доклинической стадии заболевания. На сегодняшний день достаточно полно охарактеризован спектр мутаций протоонкогена RET, выявляемых более чем в 95% семей с наследственными формами МРЩЖ. Ранжирование мутаций в протоонкогене RET по ожидаемому потенциалу злокачественности и сроку возможного проявления заболевания позволило врачам разработать и успешно применять новый алгоритм лечения, который предполагает выполнение превентивной тиреоидэктомии у детей-носителей терминальной мутации как стопроцентно эффективного способа излечения МРЩЖ. Возможность досимптоматического выявления неопластического поражения ЩЖ у пациентов из группы риска в отношении наследственного МРЩЖ является ярким примером использования фундаментальных генетических исследований в повседневной онкологической практике. Молекулярный патогенез спорадических С-клеточных опухолей ЩЖ, однако, изучен недостаточно и является предметом дальнейших исследований.
Спектрофотометрическое определение концентрации РНК
В настоящей работе представлены результаты молекулярно-генетического обследования 102 человек, включая 72 пациента с различными формами МРЩЖ из 64 неродственных семей, а также 30 их ближайших родственников. Диагноз МЭН-2А (сочетание МРЩЖ с феохромоцитомой и/или пшерпаратиреозом хотя бы у одного из членов семьи) был поставлен в 7 семьях. У 3 неродственных пациентов МРЩЖ сочетался с фенотипическими аномалиями, характерными для синдрома МЭН-2Б. Наследственный характер заболевания (наличие МРЩЖ хотя бы у двух членов семьи без признаков феохромоцитомы и гиперпаратиреоза) был отмечен в 7 семьях. В семейном анашгезе остальных 47 пациентов указания на онкологическую патологию щитовидной железы отсутствовали.
Для обнаружения трех наиболее частых мутаций в 634 цистеиновом кодоне был выполнен рестрикционный анализ 11 экзона RET. В результате однонуклеотидных замен Т1900С (C634R), G1901A (C634Y) и T1900G (C634G) появляются сайты расщепления для рестриктаз Ніпбі, Rsal и Haelll соответственно. Пример выявления мутации Т1900С в семье с МЭН-2А с использованием рестрикционного анализа показан на рис 9.
Тестирование 634 кодона на наличие других миссенс-мутаций и поиск мутаций в 609, 611, 618, 620 цистеиновых кодонах проводили с помощью автоматического секвенирования 11 и 10 экзонов. На рис. 10 представлен результат секвенирования мутации G1901C в 634 кодоне у пациента с СМРЩЖ.
В 6 из 7 обследованных семей с МЭН-2А были обнаружены однонуклеотидные замены в 634 кодоне, причем самая частая из описанных мутаций Т1900С встретилась в 4 семьях. В остальных 2 семьях обнаружена замена G190IT. Из 7 семей с СМРЩЖ мутации в 634 кодоне выявлены в 4, а мутация G1859A в 620 кодоне (C620Y) - в 1 семье.
Известно, что существует определенная зависимость клинической картины заболевания от локализации и характера мутации. Так, у лиц с мутацией в 634 кодопе риск развития феохромоцитомы составляет около 50%, а при мутации в 10 экзоне -10% [Bachelot et al., 2002]. В ряде исследований показана четкая взаимосвязь между мутациями в 634 кодоне и наличием феохромоцитомы и/или гиперплазии паращитовидных желез [Eng et al., 1996; Frank-Raue et al,, 1996].
Действительно, по результатам нашего исследования, фенотип МЭН-2А наиболее часто ассоциирован с мутациями в 634 кодоне, особенно с заменой C634R. Эта мутация обнаружена в 4 из 7 обследованных семей с МЭН-2А. Кроме того, замена C634R была выявлена в 2 семьях без очевидных клинических признаков МЭН-2А. Интересно заметить, что, по данным литературы, ни в одной из обследованных до сих пор семей с СМРЩЖ замены C634R обнаружено не было [Hansford et al., 2000]. В связи с этим всем нашим пациентам с указанной мутацией было рекомендовано провести тщательное обследование на предмет выявления феохромоцитомы и гиперпаратиреоза.
Генотип-фенотшшческие ассоциации при синдроме МЭН-2А, по-видимому, отражают различия в поведении и функционировании различных мутантных вариантов белка RET. В ряде экспериментов было показано, что изоформы RET с мутациями в 609, 618 и 620 кодопах, наименее ассоциированными с риском развития феохромоцитомы и гиперпаратиреоза, с гораздо меньшей эффективностью транспортируются на клеточную поверхность, чем полноценный белок и чем другие мутаптпые формы RET [Ito et al., 1997], Кроме того, высказывается мнение о различной чувствительности поражаемых при МЭН-2А тканей к трансформирующему действию мутаций RET. Поскольку МРЩЖ сопровождает все случаи МЭН-2А, С-клетки щитовидной железы, как полагают, более подвержены опухолевой трансформации по сравнению с паращитовидными железами и хромаффинной тканью надпочечников. По этой причине для развития медуллярной тиреокарциномы достаточно любой мутации в одном из цистеиновых кодонов, а возникновение феохромоцитомы и гиперплазия паращитовидных желез возможны лишь при наличии определенного количества мутантных рецепторов RET па клеточной поверхности [Eng, 1999]. Патологию паращитовидных желез при МЭН-2А, однако, иногда считают следствием хронического гипокальциемического эффекта кальцитонина, продуцируемого МРЩЖ [Herfarth et al., 1996]. Вопрос о первичности или вторичности гиперпаратиреоза при МЭН-2А продолжает дискутироваться.
Помимо стандартных мутаций в 620 и 634 кодонах, нами обнаружена редкая однонуклеотидная замена G189IT (D631Y) в нецистеиновом 631 кодоне. Замена аминокислот Asp- Tyr в этом случае происходит между соседними цистеиновыми остатками (соответствующими кодо нам 630 и 634), в результате чего локально меняется конформация рецептора и, вероятно, нарушается образование внутримолекулярных дисульфидных связей, О терминальной мутации в 631 кодоне при МРЩЖ уже сообщалось в одной из работ [Berndt et al., 1998].
Среди необычных мутаций при МЭН-2А и СМРЩЖ известны 2 случая дупликаций в экзоне 11 (протяженностью 9 и 12 п.н.) [Hoppner et al., 1997; Hoppner et at, 1998] и 1 случай дупликации 9 п.н. в экзоне 8 [Pigny et al., 1999]. Каждая из трех этих мутаций приводит к вставке 3 или 4 аминокислот, одна из которых - цистеин. В настоящей работе мы сообщаем о новом типе мутаций при МЭН-2А: у 2 пациентов из семьи с диагнозом МЭН-2А в 11 экзоне была обнаружена делеция 13 и инсерция 4 нуклеотидов (1895_1907delinsTGCG). Мутация нарушает структуру кодонов с 632 по 636, но сдвига рамки считывания при трансляции не происходит. Результаты секвенирования и схема мутации представлены на рис 11. Ранее была обнаружена похожая мутация 1895_1918delinsTGCGGC в ткани медуллярной тиреокарциномы, однако в ДНК из крови пациента она отсутствовала, т.е. была соматической [Marsh et al., 1998]. Описываемая нами делеция с инсерцией является первым случаем терминальной мутации такого типа.
Все пациенты с диагнозами МРЩЖ и СМРЩЖ, у которых не обнаружено мутаций в 10 и 11 экзонах, были протестированы методом SSCP на наличие мутаций в экзонах 13, 14, 15 и 16.
Однонуклеотидные замены T2307G (L769L), С2508Т (S836S), C2712G (S904S), обнаруженные в экзонах 13, 14 и 15 соответственно, оказались полиморфными вариантами, не приводящими к аминокислотным заменам в кодируемом белке. Интересно, что редкий полиморфизм С2508Т в 14 экзоне, по некоторым сведениям, встречается достоверно чаще у пациентов со спорадическим МРЩЖ в сочетании с соматической мутацией М918Т [Gimm et al., 1999].
У двоих неродственных пациентов со спорадическим МРЩЖ выявлена трансверсия А2372Т в 791 кодоне RET (экзон 13), приводящая к замене аминокислот Туг—»Phe. Результат секвенирования представлен на рис. 12.
Несмотря на то, что тестирование 13 экзона RET при МРЩЖ проводится во многих медицинских центрах мира, на сегодняшний день мутация А2372Т (Y791F) описана лишь в двух странах Европы - Германии и Чехии [Berndt et al., 1998; Fitze, 2002; Jindrichova, 2004]. Два случая мутации Y791F, описанные в настоящей работе, являются первыми в России. Следует отметить, что оба обследованных нами неродственных пациента с мутацией Y791F являются гомозиготными носителями редкого полиморфного варианта T2307G (G/G), также локализованного в 13 экзоне RET В одном из ранее описанных случаев мутации Y791F у пациента был обнаружен этот полиморфный вариант в гетерозиготном состоянии T/G [Fitze et al., 2002]. Возможно, сцепленное наследование аллеля 2307G и мутации 2372Т свидетельствует в пользу гипотезы Eng [1999] об "эффекте основателя", объясняющей ограниченное распространение мутации Y791F. К сожалению, имеющихся литературных данных о состоянии других полиморфных маркеров гена RET у пациентов с мутацией Y791F не достаточно для подтверждения этой гипотезы.
Молекулярно-генетический анализ гена RET у больных с наследственной и спорадической формами МРЩЖ
До недавнего времени единственным ранним биохимическим маркером С-клсточной гиперплазии как облигатного предшественника медуллярной тиреокарциномы и показанием для тиреоидэктомии считали повышенный уровень кальцитонина в сыворотке крови пациента. Регулярное определение базального и стимулированного уровня кальцитонина (в провокационном тесте с глюконатом кальция или/и пентагастрином) было обязательной процедурой для всех пациентов с подозрением на МРЩЖ и лиц с потенциальным риском его возникновения. Среди недостатков пентагастринового теста отмечается значительная частота ложно-положительных результатов, поскольку повышенная секреция кальцитонина имеет место и при других заболеваниях, а С-клеточная гиперплазия, как теперь известно, может быть вариантом нормы [Marsh et al., 1995; Brandi et al., 2001], Другими словами, положительный результат пентагастринового теста не является патогномоничным для МРЩЖ и может стать поводом для неоправданного хирургического вмешательства. С другой стороны, повышение уровня как базального, так и стимулированного кальцитонина в ряде случев происходит лишь на развернутой стадии заболевания, что не позволяет своевременно приступить к профилактическому лечению filer et al., 1999]. Необходимость проведения повторных исследований в связи проблемой интерпретации пограничных результатов пентагастринового теста и методическими трудностями его выполнения (особенно у детей младшего возраста) делает такой подход дорогостоящим и малоэффективным [Delbridge et al., 1998; Bachelot et al., 2002]. Невозможность однозначного исключения заболевания у здоровых членов семьи с МЭН-2А на основании отрицательных результатов кальцитонин-стимулирующих тестов также является их несомненным недостатком.
Кальцитониновые тесты, тем не менее, продолжают использоваться при диспансерном обследовании семей, в которых результаты тестирования RET оказались отрицательными, а наследственный характер заболевания очевиден или высоко вероятен. Кроме того, ежегодное определение уровня кальцитонина проводится для ранней диагностики С-клеточной гиперплазии и МРЩЖ у здоровых родственников с выявленной мутацией RET, которые имели противопоказания для Перестройки RET/PTC в тканях ПРЩЖ и других узловых образований ЩЖ.
В настоящей работе проведена идентификация перестроек RET/РТС в выборке различных узловых образований ЩЖ, включающей 91 образец ПРЩЖ, 3 ФРЩЖ, 11 фолликулярных аденом ЩЖ (ФАЩЖ), четыре многоузловых (МУЗ) и 9 одноузловых (ОУЗ) зобов.
Возникновение химерных ЯГ/РТС-онкогенов сопровождается потерей в новообразованных мутированных генах района, содержащего промотор гена RET и фрагмента, кодирующего внеклеточный (экстрацеллюлярный ЕС) домен RET. При этом транскрипция участка, кодирующего тирозинкиназный (ТК) домен гибридного гена, попадает под контроль гораздо более сильного (по сравнению с RET в тирсоцитах) промотора активирующего гена-донора. В результате экспрессия (транскрипция) участка, кодирующего ТК-домен RET становится преобладающей по сравнению с экспрессией фрагмента, кодирующего ЕС-домен. Соотношение RET-EC и RETK транскриптов может быть оценено методом полуколичественной мультиплексной RT-PCR с применением двух пар праймеров, специфичных, соответственно, к одному и второму участку. Точки хромосомных разрывов во всех известных RET/PTC-ORKOгенах (кроме RET/PTC4) приходятся на область 11-го интрона RET протяженностью 1.8 тыс. п.н. [Tallini et al., 2001; Albert! et al., 2003]. Поэтому в настоящей работе для анализа экспрессии участка, кодирующего ЕС-домен, были выбраны праймеры, расположенные в 7 и 8 экзонах RET, а праймеры для обнаружения RETK мРНК соответствовали экзонам 12-13. В тканях нормальной ЩЖ и ЛЕГ/РГС-негативных опухолей ЩЖ уровень экспрессии мРНК ЕС- и ТК-доменов примерно одинаков (за счет примеси С-клеток и, возможно, слабой экспрессии RET в фолликулярных тиреоцитах [Bunone et al., 2000]). Существенно повышенная интенсивность сигнала, соответствующего RETK по сравнению с RET-EC указывает на наличие перестройки RET/PTC.
При сравнительном анализе экспрессии фрагментов ЕС- и ТК- доменов RET нами выявлены 12 Я7УР!ГС-положительных случаев ПРЩЖ из 85 исследованных, что составляет 14%. Ни в одном из образцов ФРЩЖ, ФАЩЖ, ОУЗ и МУЗ дисбаланса экспрессии RETK и RET-RC обнаружено не было (рис, 14).
Этот вариант ЖТУРГС-перестройки представляет собой результат сбалансированной транслокации t(6;10)(p21.3;qll.2), которая сопровождается слиянием участка, кодирующего тирозинкиназный домен RET с 5 -частью гена RFP (RET Finger Protein). Точки хромосомных разрывов в этом случае приходятся на 3 и 11 интроны генов RFP и RET соответственно. Таким образом, 5 -концевую часть химерного онкогена ARFP/RETдоставляют экзоны 1-3 RFP, а 3 -район представлен 12-21 экзонами RET, Активирующий ген-до нор RFP, подобно всем известным генам-партнерам RET по перестройкам RET/РТС, обильно экспрессируется в клетках нормальной ЩЖ и в опухолевой ткани ПРЩЖ. Кроме того, была продемонстрирована способность химерного белка ARFP/RET к олигомеризации благодаря наличию двух coiled-coil доменов, кодируемых 1-2 и 3 экзонами RFP [Saenko et al., 2003], Лиганд-независимая гомодимеризация химерных онкобелков RET/РТС обеспечивается структурой их N-концевого фрагмента и является необходимым условием конститутивной тирозин киназной активности. Опухолевая трансформация мышиных фибробластов линии NIH ЗТЗ при трансфекции вектором, содержащим полноразмерную кДНК химерного гена ARFP/RET, доказывает его онкогенные свойства [Saenko et al., 2003].
Интересно заметить, что первая RFP/RET перестройка была обнаружена еще в 1985 г. в классических экспериментах по трансфекции фибробластов мыши опухолевой ДНК и расценена как экспериментальный артефакт [Takahashi et al., 1985]. Именно тогда протоонкоген RET получил свое название (" arranged during Xransfection"). В отличие от нового ARFP/RET-oiiKOTznb, точки разрыва в генах RFP и RET затрагивали интроны 7 и 9 соответственно. Поэтому первоначально обнаруженный химерный онкоген RFP/RET ("АЕТ") имел большую протяженность с сохранением трансмембранного и частично ЕС доменов. Химерный онкоген ARFP/RET лишен участка, кодирующего трансмембранный домен и, подобно остальным Д7ХР7С-онкогенам, его продукт представляет собой цитоплазматический белок.
Существуют наблюдения относительно различий клинических и гистологических характеристик ПРЩЖ в зависимости от присутствия конкретного варианта перестройки RET/РТС. Эти различия, по-видимому, объясняются индивидуальными структурными особенностями N-концевой части каждого химерного онкобелка RET/РТС, привносимой тем или иным партнерским полипептидом. С другой стороны, такие различия могут быть обусловлены гаплонедостаточностью гена-партнера, одна из копий которого рекомбинирует с локусом RET.Мутация RET/ГТСЗ, как правило, ассоциируется с ранней клинической манифестацией ПРЩЖ и более агрессивным поведением опухоли по сравнению с RET/PTC1. RET/РТСЗ-поножтспьиыс опухоли характеризуются более инвазивным и быстрым ростом, а также частым метастазированием [Nikiforov et al., 1997а; Bongarzone et al., 1998], Кроме того, показана связь Д7У.Р70-перестроек с формированием особого, фолликулярно-солидного гистологического варианта ПРЩЖ [Thomas et al., 1999]. Действительно, оба обследованных нами пациента с мутацией RET/PTC3 на момент оперативного вмешательства имели развернутую стадию ПРЩЖ с метастазами, а их возраст составлял 11 и 25 лет. Существенное преобладание перестроек RET/PTC3 среди детей, пострадавших от загрязнения радиоактивными изотопами в результате Чернобыльской катастрофы [Thomas, 1999], указывает на исключительную роль радиации в патогенезе RET/PTC3-индуциро ванного ПРЩЖ. Однако сведений о возможном воздействии радиации в анамнезе этих двух пациентов не имеется.
