Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 15
1.1. Актуальное состояние проблемы. 15
1.2. Взаимодействие генов, регулирующих клеточный цикл и механизмы канцерогенеза . 17
1.3 Повреждения генов, ответственных за канцерогенез при раке мочевого пузыря. 23
1.4. Современные представления о механизмах развития инвазивного и поверхностного раков мочевого пузыря. 28
1.5. Экспериментальные модели развития рака мочевого пузыря. 32
1.6. Уротелиальные стволовые клетки и пути прогрессии рака мочевого пузыря . 37
1.7. Современные представления о происхождении рецидивных и первично- множественных опухолей поверхностного рака мочевого пузыря. 39
Глава 2. Материалы и методы 45
2.1. Характеристика клинического материала 45
2.2. Забор крови и операционного материала 46
2.3. Выделение геномной днк. 47
2.4. Микросателлитный анализ как метод выявления аллельного дисбаланса . 47
2.5. Микросателлитный анализ как способ выявления гомозиготных мутаций. 49
2.6. Анализ метилирования CpG-островков исследуемых генов. 50
2.7. Определение мутаций методом SSCP. 52
2.8. Секвенирование. 53
2.9. Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ). 53
2.10. Программное обеспечение. 54
2.11. Статистическая обработка данных. 54
Глава 3. Результаты и обсуждение 55
3.1. Исследование молекулярно-генетических повреждений в поверхностных опухолях мочевого пузыря и их ассоциация с клинико-морфологическими характеристиками опухолей.
3.1.1 Молекулярные повреждения в образцах первичного поверхностного рака мочевого пузыря в зависимости от скорости рецидивирования . 56
3.1.2. Сравнение частот исследуемых маркеров в образцах поверхностного
рака мочевого пузыря в зависимости от степени инвазии (категория Т). 61
3.1.3. Сравнение частот исследуемых маркеров у пациентов с разной
степенью дифференцировки опухоли (G1-G3) 63
3.1.4. Использование многомерного разведочного анализа. 67
3.2. Сравнение частот молекулярно-генетических повреждений в группах поверхностного и инвазивного рака мочевого пузыря. 71
3.3. Молекулярно-генетические изменения в качестве системы маркеров течения рака мочевого пузыря. 79
3.4. Изучение клонального происхождения рецидивных и множественных опухолей мочевого пузыря. 84
3.4.1. Исследование молекулярных повреждений в материале первичных и
рецидивных опухолей мочевого пузыря. 87
3.4.2. Исследование молекулярных повреждений в материале первично множественных опухолей мочевого пузыря 89
3.4.3. Исследование молекулярных повреждений в материале условно нормальной и опухолевой ткани мочевого пузыря. 93
3.5. Общая схема развития рака мочевого пузыря. 97
Заключение 99
Выводы 103
Список литературы 105
- Взаимодействие генов, регулирующих клеточный цикл и механизмы канцерогенеза
- Уротелиальные стволовые клетки и пути прогрессии рака мочевого пузыря
- Микросателлитный анализ как метод выявления аллельного дисбаланса
- Молекулярные повреждения в образцах первичного поверхностного рака мочевого пузыря в зависимости от скорости рецидивирования
Введение к работе
Актуальность проблемы. Ежегодно в России регистрируется до 13 тысяч новых случаев рака мочевого пузыря (РМП) (Чиссов В.И. с соавт., 2010). Поверхностный рак мочевого пузыря (ПРМП) составляет 80% всех впервые выявленных случаев РМП, остальные 20% приходятся на инвазивный рак мочевого пузыря (ИРМП). К ПРМП относят неинвазивную папиллярную карциному (Та), карциному in situ (Tis) и опухоли с минимальной инвазией в пределах субэпителиальной соединительной ткани (Т1). К ИРМП относят опухоли, имеющие различную глубину поражения мышечных слоев стенки мочевого пузыря (МП) и прилежащих органов (Т2-Т4). По сравнению с ПРМП, ИРМП характеризуется более агрессивным течением и высокой смертностью (Pasin E. et al., 2008).
ПРМП характеризуется высокой частотой развития рецидивных и множественных опухолей. Частота рецидивирования после хирургического лечения ПРМП составляет до 85%, причем в 30% случаев развиваются диссеминированные и инвазивные формы РМП (Pasin E. et al., 2008). Прогнозирование клинического течения ПРМП и его трансформации в инвазивные формы является важной задачей клинической и молекулярной онкологии.
Клиническая и морфологическая гетерогенность опухолей МП обусловлена их генетической разнородностью. Предполагается существование двух независимых молекулярных путей развития ПРМП и ИРМП. На молекулярно-генетическом уровне ПРМП характеризуется мутациями в протоонкогенах H-RAS, FGFR3, PIK3CA, тогда как ИРМП, напротив, демонстрирует преимущественное повреждение основных генов-супрессоров опухолевого роста, таких как ТР53, RB1 и PTEN (Cordon-Cardo C. et al., 2008; Cheng L. et al., 2011). Данная схема молекулярного патогенеза РМП отражает лишь общие закономерности и оставляет открытыми некоторые вопросы. Остается неясным, развиваются ли ПРМП и ИРМП из общего опухолевого предшественника путем приобретения различных молекулярно-генетических повреждений на более поздних этапах канцерогенеза, или эти два типа РМП возникают и развиваются независимо друг от друга, а также являются ли минимально инвазивные Т1 опухоли самостоятельной группой или переходной стадией от ПРМП к ИРМП.
Решением проблемы клинической гетерогенности РМП может стать выявление характерных для каждого типа РМП высоко специфических маркеров, использование которых в клинике позволило бы отличать опухоли с высоким риском рецидивирования и прогрессии от менее агрессивных новообразований и персонифицировать лечебный подход.
В настоящее время еще недостаточно исследованы причины повышенной частоты рецидивирования и мультифокальности ПРМП. Основным объяснением этого феномена ранее являлось предположение о наличии невыявленных опухолевых узлов на момент постановки диагноза, а также возможности имплантации опухолевых клеток в процессе диагностического или оперативного вмешательства. Считалось, что опухоль развивается из единственной клетки-предшественницы, распространение же ее потомков дает начало множественным опухолям моноклонального происхождения (Simon R. et al., 2001). Исследования последних лет показали, что развитие рецидивных и мультифокальных опухолей может быть объяснено наличием в слизистой МП независимых «полей канцеризации», каждое из которых способно дать начало новой опухоли (Paiss T. et al., 2002; Jones T.D. et al., 2005). Такие опухоли имеют различия, как в молекулярном патогенезе, так и в клиническом поведении. Существование «полей канцеризации» показано для многих видов опухолей человека. Вопрос о клональном происхождении опухолей РМП до сих пор до конца не решен. Его решение позволит оптимизировать медикаментозную и хирургическую тактики лечения РМП.
Необходимость определения дополнительных возможностей в диагностике, прогнозе и лечении РМП, в результате выявления новых молекулярно-генетических маркеров и исследования роли молекулярно-генетических событий в развитии РМП послужили основанием для проведения настоящего исследования.
Цель и задачи исследования. Целью работы явилось изучение молекулярно-генетических изменений, происходящих в процессах возникновения, прогрессии и рецидивирования рака мочевого пузыря, для использования их в качестве дополнительных факторов диагностики и прогноза у пациентов с раком мочевого пузыря.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
-
Определить наиболее значимые в патогенезе рака мочевого пузыря молекулярно-генетические события и их частоты, и сформировать панель молекулярно-генетических маркеров для дальнейшего исследования.
-
Выявить ассоциации между исследованными молекулярно-генетическими нарушениями в опухолевой ткани и клинико-морфологическими параметрами поверхностного рака мочевого пузыря (инвазивность, степень дифференцировки, количество узлов, метастазирование) для определения факторов, влияющих на клиническое течение заболевания. Использовать выявленные молекулярно-генетические маркеры для расширения панели прогностических факторов для поверхностного рака мочевого пузыря.
-
Выявить молекулярно-генетические нарушения в опухолевой ткани, определяющие различия молекулярного патогенеза поверхностного и инвазивного рака мочевого пузыря.
-
Провести анализ клонального происхождения множественных и рецидивных опухолей при поверхностном раке мочевого пузыря.
-
Исследовать молекулярно-генетические повреждения, характерные для рака мочевого пузыря в материале условно нормальной ткани слизистой мочевого пузыря с целью оценки ее вовлеченности в процессы злокачественного перерождения.
Научная новизна. В результате проведенного комплексного исследования впервые на российской выборке больных изучены молекулярно-генетические изменения (мутации в гене FGFR3, делеции локусов 3p14, 9p21, 9q34, 17p13, метилирование генов RASSF1A, P16, P14, CDH1, RAR2, LAMC3, DAPK), происходящие в опухолевой ткани мочевого пузыря и охарактеризованы их частоты. В результате проведенного исследования показана связь молекулярной патологии с клиническим течением заболевания. На основании полученных данных предложены новые молекулярно-генетические маркеры для расширения системы прогноза течения рака мочевого пузыря.
С использованием предложенной панели маркеров, состоящей из структурных и эпигенетических нарушений в геноме опухолевых клеток, показаны различия молекулярного патогенеза поверхностного и инвазивного рака мочевого пузыря.
Определено, что спектр молекулярной патологии в первичных и рецидивных опухолях, а также в мультифокальных опухолях не всегда является идентичным, что дает основание предположить независимое развитие опухолей мочевого пузыря из разных предшественников и подтверждает наличие «полей канцеризации» в слизистой мочевого пузыря. При исследовании паттернов молекулярно-генетических повреждений в образцах рецидивных и множественных опухолей мочевого пузыря показана практически равновероятная возможность развития этих опухолей как в результате моноклонального, так и поликлонального пути канцерогенеза.
Проведено исследование молекулярно-генетических изменений в образцах гистологически нормальной слизистой мочевого пузыря, пограничной с опухолевым очагом, что свидетельствует о вовлеченности пограничной, неопухолевой ткани в процессы канцерогенеза.
Практическая значимость. Проведено комплексное исследование широкого спектра молекулярно-генетических повреждений на материале от 163 пациентов с установленным диагнозом рак мочевого пузыря. Выявлены ассоциации молекулярно-генетических повреждений с такими клиническими характеристиками, как высокий рецидивный и инвазивный потенциал опухоли, низкая степень дифференцировки опухоли, что может позволить использовать анализ данных молекулярных изменений в качестве маркеров течения и прогноза рака мочевого пузыря.
В результате исследования определены дополнительные маркеры неблагоприятного прогноза течения рака мочевого пузыря. Делеции 3р14 и аномальное метилирование генов RAR2 и CDKN2A ассоциированы с низкой дифференцировкой опухолей, делеции локусов 17р13, 9q34 и метилирование гена CDKN2A у пациентов с поверхностным раком мочевого пузыря достоверно ассоциированы с высоким инвазивным потенциалом. Делеции 9р21 у пациентов с поверхностным раком мочевого пузыря ассоциированы с высоким рецидивным потенциалом опухоли. Напротив, мутации в гене FGFR3 могут являться маркером более благоприятного течения заболевания, так как ассоциированы с поверхностными опухолями и не встречаются при инвазивном раке мочевого пузыря. Предложенные ДНК-маркеры позволяют расширить систему, используемую для прогноза течения рака мочевого пузыря и могут использоваться в дополнение к применяемым диагностическим методам – гистологическому и биохимическому.
На основании полученных результатов разработана и зарегистрирована медицинская ДНК-технология «Молекулярно-генетическая методика оценки риска неблагоприятного течения заболевания у больных поверхностным раком мочевого пузыря» ФС№2009/311 от 04.09.2009. Данная медицинская технология предназначена для анализа молекулярно-генетических нарушений при раке мочевого пузыря и позволяет проводить скрининг и оценивать прогноз заболевания на ранних этапах его возникновения, определять риск рецидивирования в период лечения и корректировать тактику терапии в случае инактивации определенных генов.
Возможность олигоклонального происхождения опухолей мочевого пузыря и вовлеченность нормальной слизистой позволяют рассматривать рак мочевого пузыря как комплексное заболевание слизистой мочевого пузыря и обосновывают необходимость разработки новых способов комплексной терапии рака мочевого пузыря.
Апробация работы. Материалы исследования докладывались на ежегодных конференциях Европейского общества генетики человека в 2008 г. (г. Барселона, Испания), в 2009 г. (г. Вена, Австрия), в 2010 г. (г. Гетеборг, Швеция), в 2012 г. (г. Нюрнберг, Германия); на Европейской мультидисциплинарной конференции по урологическим ракам в 2009 г. (г. Барселона, Испания); на конференции «Биомедицина и биобезопасность» в 2008 г. (г. Москва, Россия); на V Конференции молодых ученых России с международным участием в 2008 г. (г. Москва, Россия); на российских онкоурологических конгрессах в 2008-2011 г. (г. Москва, Россия); на Пироговской студенческой научной медицинской конференции в 2008-2009 г.г. (г. Москва, Россия).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 научных работ: одна медицинская технология, 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ, 9 работ в материалах конгрессов и конференций в РФ и 6 зарубежом.
Внедрение результатов исследования в клиническую практику. Результаты проведенных научных исследований внедрены в практическую работу лаборатории эпигенетики Федерального государственного бюджетного учреждения «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук. Использование основных положений диссертации позволило дополнить и расширить общепринятую систему клинико-морфологических факторов прогноза течения рака мочевого пузыря молекулярно-генетическими маркерами.
По результатам диссертационной работы разработана и зарегистрирована медицинская ДНК-технология «Молекулярно-генетическая методика оценки риска неблагоприятного течения заболевания у больных поверхностным раком мочевого пузыря». ФС№2009/311 от 04.09.2009.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 121 странице машинописного текста, состоит из оглавления, списка сокращений, введения, обзора литературы, подробного изложения использованных материалов и методов, описания собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 162 ссылки. Диссертация иллюстрирована 12 таблицами и 22 рисунками.
Взаимодействие генов, регулирующих клеточный цикл и механизмы канцерогенеза
Регуляция процессов роста и дифференцировки клеток находится под строгим контролем двух разнонаправленных систем – системы протоонкогенов и генов-супрессоров клеточного цикла. Для нормального функционирования клетки необходимо поддержание строгого динамического равновесия между двумя этими системами. Нарушение этого равновесия способно привести к инициации процессов злокачественной трансформации клетки. Канцерогенный эффект протоонкогенов (позитивных регуляторов) может проявиться при появлении активирующей мутации в гетерозиготном состоянии. Канцерогенный эффект повреждения генов-супрессоров (негативных регуляторов) проявляется только при наличии повреждений в гомозиготном состоянии. Также возможно появление мутаций в генах репарации повреждений ДНК. Это, в свою очередь, может привести к накоплению мутаций в протоонкогенах и в генах-супрессорах.
Процесс превращения нормальной клетки в злокачественную является многостадийным и происходит при накоплении в геноме клетки достаточного количества повреждений генов, контролирующих клеточную пролиферацию, дифференцировку, морфогенетические реакции и апоптоз [Залетаев с соавт., 2009]. При этом могут повреждаться не только отдельные составляющие регуляторных каскадов, но и ключевые перекрестные звенья нескольких сигнальных путей.
Одним из ключевых событий в процессе приобретения злокачественного фенотипа является избегание клеткой точки G1 chekpoint control (контрольной точки рестрикции в G1). Точка рестрикции G1 является крайне важным моментом контроля повреждений ДНК. На ранних стадиях клеточного цикла здоровые клетки могут распознавать повреждения ДНК и реагировать на них задержкой прохождения клеточного цикла в фазе G1 до репарации повреждений, если повреждения не могут быть устранены, клетка вступает в апоптоз. Для преодоления точки рестрикции G1/S клеткам необходима активация транскрипции ряда генов, работающих в ранней S фазе, таких как ген тимидилатсинтетазы, ДНК-полимеразы , циклинов А и Е и др. Транскрипция этих генов осуществляется при активации транскрипционного фактора Е2F. Ключевым звеном системы регуляции G1/S перехода является ген RB1. Действие RB1 тесно связано с функционированием множества других генов-супрессоров и протоонкогенов, продукты которых влияют на активность гена (рис. 1).
В частности, важными регуляторами функции pRb являются белковые продукты генов хромосомного локуса 9р21. Особенностью этого района является то, что он содержит гены, кодирующие три негомологичных ядерных белка – p16/INK4a, p15/INK4b и р14/ARF (продукты альтернативных рамок считывания), выполняющие в клетке супрессорные функции. Ядерный белок p16/INK4a обладает способностью связывать циклинзависимые киназы Cdk, инактивируя тем самым комплексы циклинзависимых киназ Cdk с циклинами D, которые фосфорилируют RB1 и вызывают высвобождение фактора транскрипции E2F из комплекса с белком RB1. В результате происходит активация E2F, активизируется транскрипция E2F-зависимых генов (рис. 2), и инициируется переход клетки в S фазу клеточного цикла. Механизм инактивации циклинзависимых киназ с помощью Р16, является наиболее изученным способом негативной регуляции активности RB1 в клетке. Негативная регуляция вступления клетки в S фазу осуществляется геном-супрессором ТР53. Белок р53 активирует р21, который в свою очередь ингибирует Cdk4, что делает невозможным фосфорилирование pRb и, как следствие, высвобождение E2F. p14/ARF способен стабилизировать и активировать ген-супрессор ТР53 при экспрессии некоторых вирусных и клеточных онкогенов. Совместное функционирование р53 и RB1 необходимо для регуляции апоптоза [Shiio et al., 1992].
Активность p16 и pARF в свою очередь повышается при экспрессии ряда протоонкогенов (Myc, Ras, Raf), что в норме предотвращает дальнейшее размножение клеток, в которых произошла активация одного из представителей онкогенов. Нарушение этого защитного механизма возможно при мутациях, гиперметилировании или делеции локуса INK4a/ARF, приводящих к инактивации одного из белковых продуктов (Р16, Р15, Р14). Подобные молекулярно-генетические события были обнаружены при различных злокачественных опухолях человека, например, в наследственных и спорадических меланомах, а также при раке поджелудочной железы, пищевода, мочевого пузыря, глиобластомах, острых лимфолейкозах [Залетаев с соавт., 2005]. Помимо инактивации генов-супрессоров опухолевого роста не менее значимым событием в процессе канцерогенеза является активация протоонкогенов и усиление пролиферативых сигналов с клеточной поверхности.
Центральную роль в передаче внутреннего митогенного сигнала играет один из наиболее известных клеточных протоонкогенов - протоонкоген Ras. Запуск киназного каскада Raf-Mek-Erk, инициируемого геном Ras, осуществляет передачу сигнала пролиферации от мембраны к ядру клетки (рис. 1). Это еще один путь влияния этого онкогена на активность RB1. При активации протоонкогена Ras происходит распределение импульсов по отдельным сигнальным путям через эффекторные белки. Наиболее изученными являются Ras-Mek-Erk и PI3-киназные каскады. Ras-Mek-Erk каскад через каскад МАР-киназ приводит к индукции циклина D1 и активации комплекса циклин D - CDK4, который высвобождает E2F из связанного состояния с pRb. PI3-киназный путь через активацию Akt приводит к торможению процессов апоптоза путем ингибирования каспазы 9, а посредством активации mTOR – к повышению активности комплекса циклинов и циклин-зависимых киназ. что также ведет к вступлению клетки в S фазу.
Другим механизмом, опосредованно влияющим на функционирование системы CDK-RB1, является путь, вовлекающий ген-супрессор APC. -катенин - один из факторов транскрипции, активность которого регулируется путем связывания с Е-кадгерином. Продукт гена CDH1, Е-кадгерин, участвует в кальций-зависимой клеточной адгезии и обеспечении контактного торможения пролиферации в эпителиальных тканях, в том числе в эпителии мочевого пузыря. Снижение функциональной активности этого гена может вести к опухолевой прогрессии, активной пролиферации, инвазии и метастазированию первичной опухоли [Qian et al., 2007]. Показано, что некоторые белки, участвующие в формировании различных типов межклеточных контактов, могут функционировать как супрессоры опухоли, а экспрессирующие их гены могут рассматриваться как гены-супрессоры [Tsukita et al., 1993]. К таким белкам относят Е-кадгерин-катениновый комплекс, рассматриваемый как мощный супрессор инвазии в экспериментальных и человеческих карциномах [Vermeulen et al., 1996].
Инактивация гена APC или мутации в гене -катенина (CTBN1) уменьшают связывание этого транскрипционного фактора с Е-кадгерином, стимулируя образование комплексов -катенин/Tcf4, мишенью которого является ген циклина D1 и протоонкоген Myc. В результате этого процесса происходит активация циклин-зависимых киназ (комплексов циклин D/cdk4,6 и циклин E/cdk2) и соответственно, фосфорилирование RB1, обусловлавающее переход клетки в S-фазу. Мутации в генах CDH1 (Е-кадгерин), -катенина и APC были обнаружены в наследственных и спорадических опухолях желудочно-кишечного тракта, а также при спорадических опухолях молочной железы и яичников. Предполагается, что онкогенный эффект мутаций CDH1 связан с нарушением морфогенетических реакций клетки (разобщением межклеточных контактов), что может, в свою очередь, оказывать влияние на функциональную активность гена TP53.
Считается, что повреждение генов, ответственных за адгезию, ангиогенез и ремоделлинг внеклеточного матрикса (таких как гены миозина, Е-кадгерина, ламинина, коллагена) играет важную роль при развитии опухоли от дисплазии до инвазивных и метастатических форм рака. Столь тесная взаимосвязь множества клеточных генов в регуляции процессов пролиферации, дифференцировки и апоптоза позволяет предположить возможность их комплексного повреждения в ходе канцерогенеза. Комплексное повреждение генома трансформированных клеток фенотипически проявляется в приобретении ряда свойств, таких как иммортализация, снижение или полная потеря дифференцировки клеток, способность к росту без прикрепления к субстрату, уменьшение требований к сывороточным ростовым факторам, потеря контактного торможения, исчезновение ряда поверхностных макромолекул, позволяющих клеткам уходить из-под надзора иммунной системы.
Уротелиальные стволовые клетки и пути прогрессии рака мочевого пузыря
Высокая частота рецидивирования является одной из основных проблем, с которыми сталкивается врач при лечении пациентов с ПРМП. Рецидивные опухоли после ТУР возникают с частотой до 85%, причем могут располагаться как на месте резекции, так и в любом другом месте слизистой МП.
Классическим объяснением данного феномена является предположение о наличии не выявленных на момент операции опухолевых узлов, возможности имплантации опухолевых клеток в процессе ТУР.
Несмотря на простоту и логичность данной теории, часть ученых рассматривают развитие рецидивов РМП как проявление комплексного повреждения слизистой МП. Данное предположение основано на сравнении рецидивных и первичных опухолей МП. Рецидивы ПРМП, как и сосуществующие мультифокальные опухоли МП, встречающиеся при РМП с высокой частотой, могут иметь как сходные, так и различные клинико-биологические характеристики.
В связи с этим возникает вопрос об источнике происхождения рецидивных и мультифокальных опухолей МП. Среди основных теорий можно выделить теории моноклонального и олигоклонального происхождения [Parsons et al., 2008].
Согласно теории моноклонального происхождения, потомки единственной трансформированной клетки в процессе пролиферации способны распространяться в уротелии и давать начало множественным опухолям. Все опухоли, таким образом, являются потомкам единственной клетки-родоначальницы. В результате все клетки несут характерный для клетки-родоначальницы паттерн молекулярных повреждений (рис. 5А). Приобретение дополнительных молекулярных повреждений возможно в процессе дальнейшего развития опухоли. Однако изначальный паттерн повреждений сохраняется и наследуется всеми клетками опухолей моноклонального происхождения [Sidransky et al., 1992; Harris et al., 1992]. Таким образом, сосуществующие мультифокальные опухоли МП и рецидивные опухоли при ПРМП являются потомками одной злокачественной клетки, а высокая частота рецидивирования ПРМП после ТУР объясняется наличием невыявленных опухолевых очагов. Теория полей канцеризации была разработана Slaughter в 1944, за десять лет до появления самого термина «поле канцеризации», а также до открытия двуспиральной структуры молекулы ДНК. В своей работе 1944 года Slaughter писал «Рак не является феноменом, развивающимся из единичной клетки, скорее развивается как анапластический процесс, затрагивающий множество клеток одномоментно» («Cancer does not arise as an isolated cellular phenomenon, but rather as an anaplastic tendency involving many cells at once»). Автором было замечено, что клетки, не являющиеся опухолевыми, но расположенные в непосредственной близости от опухоли, гистологически не являются нормальными, представляя собой претрансформированные клетки определенного поля канцеризации, и, следовательно, являющиеся источником локальных рецидивов [Slaughter et al., 1944]. Более поздние исследования на молекулярном уровне выявили генетические свидетельства в пользу теории Slaughter.
Решение вопроса об источнике происхождения рецидивных опухолей имеет большое практическое значение для определения хирургической тактики и подходов к дальнейшему лечению пациентов. Однако данные различных исследовательских групп крайне противоречивы. Моноклональное происхождение уротелиальных карцином с последующим интраэпителиальным или интралюминальным расселением опухолевых клеток было показано в ранних работах Sidransky с соавт. в 1992 [Sidransky et al., 1992], а также ряде более поздних исследований [Bender et al., 1998; Takahashi et al., 1998; Simon et al., 2001]. Тем не менее, в исследованиях Paiss с соавт. и Hartmann с соавт. было однозначно показана возможность существование более одного опухолевого клона, особенно на ранних стадиях развития уротелиальных карцином. Paiss с соавт. выявили олигоклональное происхождение в 36% случаев рТа опухолей мочевого пузыря, Hartmann с соавт. – в 10% случаев среди мультифокальных опухолей мочевого пузыря стадии рТа G1 [Hartmann et al., 2000; Paiss et al., 2002]. Напротив, в работе Li с соавт. для всех 35 рТа опухолей (степень дифференцировка G1 и G2) было показано моноклональное происхождение [Li et al., 1999]. Однако в целом ряде последующих работ приводятся убедительные свидетельства в пользу олигоклональной теории развития РМП [Hartmann et al., 2000; Hafner et al., 2001; Hartmann et al., 2002; Stoehr et al., 2000; Takahashi et al., 2001]. Большинство проводимых исследований по изучению клональности уротелиальных карцином проводятся на материале опухолей собственно мочевого пузыря. Takahashi с соавт. провели крупномасштабное исследование по изучению клональности синхронных и метахронных опухолей верхних и нижних мочевых путей [Takahashi et al., 2001]. При подобном подходе за счет значительного расстояния между опухолевыми очагами верхних и нижних мочевых путей вытеснение одного опухолевого клона другим, также как и интраэпителиальное распространение опухоли, маловероятны. Всего исследование включало 94 синхронных и метахронных опухолей верхних и нижних мочевых путей 19 пациентов. Каждый пациент имел как минимум одну опухоль верхних (почечные лоханки, мочеточники) и нижних (мочевой пузырь, уретра) мочевых путей. Для установления клональности был проведен анализ микросателлитной нестабильности, изучены потери гетерозиготности короткого и длинного плечей хромосомы 9 (9p и 9q) и гена TP53 (локус 17p13), а также мутации гена ТР53 (экзоны 5-9). В результате показано, что лишь для 14 пациентов из 19 изучение клональности информативно. В 9 из 14 (64%) показано моноклональное происхождение опухолей. Оставшиеся пять из 14 (36%) демонстрировали наличие, по крайней мере, двух различных опухолевых клонов. Интересно, что у четырех из этих пяти пациентов с опухолями олигоклонального происхождения, опухоли почечной лоханки или мочеточника развились после появления опухоли мочевого пузыря [Takahashi et al., 2001].
Результаты данной работы подтверждают гипотезу о развитии полей канцеризации уротелия в результате воздействия экзогенных канцерогенов. Yamamoto с соавт. экспериментально подтвердили олигоклональное происхождения уротелиальных карцином при воздействии канцерогенов на уротелий. В своей работе они изучали воздействие экспериментального канцерогена N-бутил-N-(4-гидроксибутил)нитрозамина на мышей линии C3H/HeN – BALB/c. В результате воздействия у 30% мышей были обнаружены мультифокальные опухоли различного происхождения [Yamamoto et al., 1998]. Важной вехой в изучении клональности опухолей РМП явилась работа Jones с соавт. В своей работе авторы демонстрируют возможность сосуществования полей канцеризации и моноклональных опухолей у одного пациента, не смотря на то, что в подавляющем большинстве исследованных случаев показано олигоклональное происхождение множественных опухолей [Jones et al., 2005]. В пользу теории полей канцеризации и олигоклонального происхождения множественных опухолей МП свидетельствуют и данные об обнаружении молекулярно-генетических изменений в гистологически нормальном уротелии МП [Habuchi et al., 2001; Cianciulli et al., 2003; Junker et al., 2003; Paterson et al., 2003; Hoeglund et al., 2012]. Также при ИРМП на определенном расстоянии от опухоли часто обнаруживают наличие предраковых изменений уротелия, таких как клеточная атипия, гипер- и дисплазия, CIS.
Микросателлитный анализ как метод выявления аллельного дисбаланса
Геномную ДНК из лимфоцитов периферической крови и из ткани опухоли выделяли с помощью протеиназы К и последующей фенол-хлороформенной экстракции. С целью выделения геномной ДНК из архивного материала срезы парафиновых блоков депарафинизировали в ксилоле, полученный материал обрабатывали протеиназой К с последующей фенол-хлороформенной экстракцией. Выход ДНК составлял 25-50 мкг на 1мл крови или 1г ткани. После полного растворения ДНК измеряли ее концентрацию на спектрофлуориметре фирмы Hoefer и снимали спектр поглощения в диапазоне от 220 до 320 нм с целью определения чистоты ДНК. При этом проверяли выполнение следующих условий: отношение поглощения на длинах волн 230 нм/260 нм 0.5, 260 нм/280 нм 1.8. Максимум поглощения наблюдался в районе 260 нм. С целью выявления аллельного дисбаланса и потери гетерозиготности (ПГ) генов-супрессоров опухолевого роста и генов, вовлеченных в канцерогенез, проводили микросателлитный анализ. Принцип метода состоит в выявлении снижения или полного исчезновения сигнала от одного из аллелей микросателлитного маркера при проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующей детекцией продуктов реакции в полиакриламидном геле (ПААГ). Для амплификации фрагментов подбираются праймеры к уникальным последовательностям ДНК, фланкирующим микросателлитный повтор, что требует предварительного знания их нуклеотидной последовательности. Высокий уровень полиморфизма микросателлитов, относительно равномерное их распределение в эухроматиновой части геномов и широкая представленность сделали их чрезвычайно популярными. На практике для повышения точности и информативности косвенной ДНК-диагностики с помощью микросателлитного анализа обычно используют несколько маркеров, расположенных в изучаемой хромосомной области. Идеальным является использование внутригенных маркеров в комбинации с тесно сцепленными маркерами, фланкирующими изучаемый ген с теломерной и центромерной сторон.
ПЦР проводили по следующей схеме: к 0.1мкг геномной ДНК добавляли 0.05мкМ каждого праймера, 200мкМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата, 1-2ед. Taq-полимеразы, 2,5мкл десятикратного буфера для ПЦР следующего состава: 50 мМ KCl, 10 мМ Трис-HCl (pH 8,4), 5 мМ MgCl2. Затем добавляли 30 мкл вазелинового масла, прогревали смесь при 95С в течение 10 мин и проводили 33 цикла по следующей программе: денатурация при 95С – 30с, отжиг и элонгация при 58-60С – 2мин 30с. Продукты ПЦР разделяли в 8%-ном полиакриламидном геле и окрашивали нитратом серебра. ПГ оценивали как ослабление или отсутствие полосы одного из аллелей относительно контроля (рис. 6).
Анализ метилирования CpG-островков промоторных районов исследуемых генов проводили при помощи метил-чувствительной ПЦР (МЧ-ПЦР). Метод МЧ-ПЦР основан на способности метилчувствительных рестриктаз гидролизовать ДНК, не содержащую модифицированных оснований, и оставлять негидролизованными участки, содержащие метилцитозин. В качестве матрицы для ПЦР использовали гидролизованную метилчувствительной рестриктазой HpaII (сайт узнавания CCGG) ДНК. Геномную ДНК (1 мкг) обрабатывали 10 ед. акт. рестриктазы в 10 мкл инкубационной смеси в течение 20 часов при 37С. Для амплификации использовали 150 нг гидролизованной ДНК. При проведении ПЦР учитывали присутствие сайтов узнавания используемой рестриктазы в амплифицируемом фрагменте, который содержал не менее трех-четырех HpaII сайтов. В случае модификации цитозинов в метилцитозин ДНК не расщепляется, и продукт ПЦР может быть выявлен в геле. В отсутствие метилирования ДНК полностью гидролизуется, и продукт ПЦР не образуется .
Активирующие мутации в 7 экзоне гена FGFR3, кодирующего рецептор фактора роста фибробластов, для образцов рака мочевого пузыря проводили методами SSCP-анализа и прямого секвенирования.
Метод обнаружения мутаций путем оценки конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ДНК (SSCP - single-stranded conformation polymorphism) основан на том, что отдельные цепи денатурированных фрагментов ДНК образуют вторичную структуру, особенности которой зависят от последовательности нуклеотидов. Конформация одноцепочечных фрагментов ДНК, образовавшаяся во время их рефолдинга (сворачивания после тепловой денатурации и быстрого охлаждения, при котором большинство фрагментов остается в одноцепочечной форме), влияет на электрофоретическую подвижность фрагментов. Наличие в анализируемом фрагменте ДНК одной или нескольких мутаций приводит к формированию специфической вторичной структуры, которая будет отличаться от структуры фрагментов ДНК дикого типа, что обнаруживается по изменению электрофоретической подвижности фрагментов (рис. 9). Метод оценки конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ДНК позволяет выявлять до 80% мутаций, но не дает возможности точно их локализовать.
Электрофорез продуктов ПЦР проводили в 8% ПААГ при 22С в течение 1,5-5 часов с последующим ультратонким окрашиванием нитратом серебра. Визуальный контроль пробега проб ДНК проводили по ксиленцианолу и бромфеноловому синему. Для фиксации результатов ПААГ проводили ксерокопирование или сканирование гелей. 2.10. Программное обеспечение. Компьютерный анализ ДНК проводился с использованием следующих программ: поиск полноразмерной нуклеотидной последовательности генов с использованием программ Blast и Fasta; анализ ДНК на наличие сайтов ферментов рестрикции при помощи программ Genebank Pustell, Genepro, WIN-SUN; компьютерное конструирование олигонуклеотидных праймеров и подбор условий для проведения ПЦР с использованием программы Oligo 4.0 и MethPrimer; анализ хроматограмм секвенированных последовательностей и распечатка результатов - с помощью программ Executor и Chromas.
Молекулярные повреждения в образцах первичного поверхностного рака мочевого пузыря в зависимости от скорости рецидивирования
Предполагается, что потеря гетерозиготности 9р21 связана с развитием поверхностного РМП с более агрессивным поведением по сравнению с опухолями без делеции, а также потеря указанного хромосомного района связана с ранней прогрессией заболевания и снижением безрецидивной выживаемости [Orlow et al., 1999; Orlow et al., 1994; Simoneau et al., 2000]. В нашем исследовании 8 первичных опухолей дали рецидив в течение первого года после ТУР. 3/8 (37,5%) имели делеции локуса 9р21, тогда как частота этого же молекулярного события в группе опухолей с безрецидивным течением за первый год составила всего 2 случая из 31 образца (6,5%). Таким образом, появление рецидивов в группе первичного поверхностного РМП ассоциировано с делецией локуса 9р21 (р=0.049. OR=8.70. 95% CI: 1.15-65.97). Это подтверждает предположение о делеции локуса 9р21 в качестве события, вовлеченного в процесс приобретения опухолью рецидивирующего фенотипа.
Полученные нами результаты согласуются с данными других исследователей. В исследовании Chapman et al. показана связь делеций локуса 9р21 и инвазии в собственную пластинку слизистой и глубже ( T1) [Chapman et al., 2005]. По данным Simoneau четыре района на 9 хромосоме (9ptr-p22, 9q22, 9q33, 9q34) связаны с увеличением риска развития рецидива независимо от других факторов (G, Т, размер и количество опухолей) [Simoneau et al., 2000]. Однако, не все исследователи согласны с наличием взаимосвязи между повреждением генов Р16 и Р14, расположенных в 9р21 и клинико морфологическими характеристиками опухоли, такими как рецидивирование, стадия и степень дифференцировки [Berggren et al., 2001; Droller et al., 2002]. Наиболее активно обсуждается роль делеции (в особенности гомозиготной делеции) локуса 9р21 в качестве маркера рецидивирования.
Показано, что примерно 50% опухолей МП имеют гомозиготные делеции локуса 9р21, приводящие к полной потере расположенных здесь генов на обеих хромосомах [Cairns et al., 1993]. Для других типов опухолей, таких как В-клеточные лимфомы и лимфобластные лейкемии, гомозиготные делеции локуса 9р21 ассоциированы с неблагоприятным прогнозом [Jardin et al., 2010; Kim et al., 2009], Однако, для РМП такое утверждение неоднозначно. Есть мнение, что наличие гомозиготных делеции не оказывает влияния на проявление инвазивных свойств опухолей МП, а может иметь отношение к проявлению других опухолевых характеристик, таких как, например, частота рецидивирования [Berggren et al., 2006]. Показано, что частота гомозиготных делеций указанного локуса значительно выше в группе рецидивирующих опухолей по сравнению с нерецидивирующими и установлена связь между наличием гомозиготных делеций 9р21 с рецидивирующим характером опухоли [Chapman et al., 2005].
В нашем исследовании гомозиготные делеции локуса 9р21 были показаны в 40% случаях всех делеций 9р21, тем не менее, ассоциаций гомозиготных делеций с глубиной инвазии, рецидивным потенциалом или другими клиническими характеристиками опухолей выявлено не было.
Также нами было показано, что метилирование гена RARb достоверно выше в группе опухолей, не рецидивировавших в течение года по сравнению с быстро рецидивирующими опухолями (р=0.038). Для более тщательного анализа вклада метилирования генов-супрессоров в процессы рецидивирования мы рассчитали индекс метилирования (ИМ) генов RASSF1A, RARb, P16, P14, CDH1 для каждого образца как отношение числа метилированных генов к общему числу исследованных на предмет метилирования генов в соответствии с формулой:
При сравнении разброса ИМ в группах рецидивировавших и нерецидивировавших опухолей при помощи U-критерия Манна-Уитни было показано статистически достоверное различие этих групп в зависимости от индекса метилирования (р=0.047). Медианные значения в группах составили 0.0 и 0.2 соответственно (рис. 12), что отражает более высокий уровень метилирования генов-супрессоров в нерецидивировавших в течение 1 года опухолях по сравнению с рецидивировавшими.
Примечание: рц нет – опухоли с безрецидивным течение в течение первого года после удаления опухоли; рц да – опухоли, рецидивировавшие в течение первого года после удаления первичной опухоли. Таким образом, выявлена обратная зависимость между общим уровнем метилирования генов-супрессоров и рецидивным потенциалом опухоли ПРМП: более высокий уровень метилирования ассоциирован с низким рецидивным потенциалом.
3.1.2. Сравнение частот исследуемых маркеров в образцах поверхностного рака мочевого пузыря в зависимости от степени инвазии (категория Т).
При исследовании связи молекулярно-генетических повреждений с наличием минимальной инвазии в группе ПРМП показано, что в группе неинвазивных карцином (Та) достоверно повышена частота активирующей мутации гена FGFR3 (7 экзон) по сравнению с группой минимально инвазивных опухолей (Т1) (p=0.004. OR=5.0. 95% CI: 1.7-14.7) (табл. 5, рис. 13).
Примечание: в ячейках с численными значениями указано количество определенных изменений по отношению к количеству информативных случаев в группе. р - сравнение групп с помощью двустороннего точного критерия Фишера (уровень значимости =0.05). 40,0% -і 35,0% 30,0% x 25,0% 1 20,0% 1 15,0% x 10,0% 1 5,0% 1 T Г7 izpi пТа ПТ1 V L, і Ш „- ] г . p53 X3FR 3p 9p 9q RASSF RARb p16 p14 CDH1 Рисунок 13. Сравнение частот исследуемых маркеров в образцах поверхностного рака мочевого пузыря в зависимости от степени инвазии (категория Т). Примечание: Та – неинвазивные опухоли; Т1 – минимально инвазивные опухоли; красным овалом отмечены молекулярно-генетические изменения, для которых выявлены статистически достоверные ассоциации.
Мутация гена FGFR3 выявляется наиболее часто в двух видах карцином – при раке мочевого пузыря и раке шейки матки, причем наибольшая частота наблюдается в эпителиальных опухолях мочевого пузыря – 30-80% случаев [Cappellen et al., 1999; Sibley et al., 2001]. Среди всех мутаций гена FGFR3, встречающихся при РМП, активирующая мутация S249C в 7 экзоне, приводящая к замене аминокислоты серина на цистеин в 249 положении, является наиболее часто встречающейся [Cappellen et al., 1999]. Подобная замена определяет появление во внеклеточном домене рецептора цистеина, что в свою очередь ведет к образованию дисульфидных мостиков между двумя мутантными FGFR3 мономерами и, как следствие, к конститутивной активации всего рецепторного комплекса [Tavormina et al., 1995]. Нарушение структуры и повышение функции рецепторных тирозинкиназ является характерным молекулярным изменением для РМП [Карякин с соавт., 2006]. В нашем исследовании также показано увеличение частоты встречаемости активирующей мутации в 7 экзоне гена FGFR3 в группе неинвазивных поверхностных опухолей (группа рТа). Это отчасти подтверждает предположение о роли мутации в гене FGFR3, как об одном из событий, вовлеченных в развитие рТа опухолей. Активирующие мутации FGFR, по данным литературы, ассоциированы с группой высоко дифференцированных (G1) опухолей и со стадией pТа [Billerey et al., 2001; Kimura et al., 2001; Knowles et al., 2006; Mhawech-Fauceglia et al., 2006; Tomlinson et al., 2007] и считаются индикатором благоприятного прогноза [Hernandez et al., 2006; van Rhijn et al., 2001]. В исследованиях Junker с соавт. и van Rhijn с соавт. было показано отсутствие мутаций FGFR3 в группе опухолей с неблагоприятным течением (G3 и Т1) и низким риском развития рецидива [Junker et al., 2008; van Rhijn et al., 2001].
Наряду с делецией хромосомы 9, делеции гена Р53 являются наиболее частыми событиями при РМП и определяют неблагоприятный прогноз течения опухоли, ее инвазивность и раннее метастазирование [Карякин с соавт., 2006; Prat et al., 2001]. Полученные нами результаты, несмотря на отсутствие статистически значимых корреляций, в целом согласуются с описанными выше данными: нами выявлено значительное снижение частоты потери гетерозиготности гена ТР53 у пациентов со стадией Та (4,5%), тогда как при стадии Т1 частота делеций составила 13,1%.
