Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы g
1.1 Характеристика протеиназ рыб g
1.1.1 Активность протеиназ g
1.1.2 Влияние температуры на активность протеиназ рыб 13
1.1.3 Влияние рН на активность протеиназ рыб \j
1.2 Протеиназы беспозвоночных \д
1.2.1 Характеристика протеиназ беспозвоночных 21
1.2.2 Влияние природных факторов на активность протеиназ беспозвоночных. 24
1.3 Влияние цинка и меди на организм рыб и их потенциальных объектов питания. 28
1.3.1 Источники цинка и меди 29
1.3.2 Потребность рыб в цинке и меди 30
1.3.3 Пути и механизмы поступления цинка и меди в организм рыб з 1
1.3.4 Содержание цинка и меди в организме рыб - потенциальных объектах питания ихтиофагов 32
1.3.5 Содержание цинка и меди в организме потенциальных объектов питания бенто- и планктофагов 33
1.3.6 Влияние абиотических и биотических факторов на поступление и
содержание цинка и меди в организме потенциальных жертв рыб 34
1.3.7 Механизмы детоксикации тяжелых металлов 37
1.3.8 Влияние цинка и меди на пищевое поведение рыб 39
1.3.9 Влияние тяжелых металлов на процессы пищеварения у рыб 40
1.4 Заключение 42
Глава 2. Материал и методы исследования 45
2.1 Материал исследования 45
2.2 Методы исследований 52
2.2.1 Приготовление ферментативно-активных препаратов 52
2.2.2 Определение ферментативной активности 52
2.2.3 Статистическая обработка данных 54
Глава 3. Раздельное и комплексное влияние температуры, рН и ионов тяжелых металлов (цинк, медь) на активность протеиназ пищеварительного тракта рыб 55
3.1 Раздельное и комплексное влияние температуры, рН и ионов тяжелых металлов на активность пепсиноподобных протеиназ слизистой оболочки желудка типичных и факультативных ихтиофагов 55
3.2 Раздельное и комплексное влияние температуры, рН и ионов тяжелых металлов на активность протеиназ слизистой оболочки кишечника типичных и факультативных ихтиофагов
3.3 Раздельное и комплексное влияние температуры, рН и ионов тяжелых металлов
на активность протеиназ слизистой оболочки кишечника бентофагов 62
3.4 Раздельное и комплексное влияние температуры, рН и ионов тяжелых металлов на активность протеиназ слизистой оболочки кишечника типичных планктофагов 55
3.5 Раздельное и комплексное влияние температуры, рН и ионов тяжелых металлов на активность протеиназ слизистой оболочки пищеварительного тракта факультативного планктофага тюльки gg
3.7 Заключение 70
Глава 4. Раздельное и комплексное влияние температуры, рН и ионов тяжелых металлов (цинк, медь) на активность протеиназ целого организма потенциальных объектов питания рыб 77
4.1 Раздельное и комплексное влияние температуры, рН и ионов тяжелых металлов на активность казеинлитических протеиназ целого организма рыб 77
4.2 Раздельное и комплексное влияние температуры, рН и ионов тяжелых металлов на активность гемоглобинлитических протеиназ целого организма рыб g 1
4.3 Раздельное и комплексное влияние температуры, рН и ионов тяжелых металлов на активность казеинлитических протеиназ у представителей разных таксонов беспозвоночных g4
4.4 Раздельное и комплексное влияние температуры, рН и ионов тяжелых металлов на активность гемоглобинлитических протеиназ у представителей разных таксонов беспозвоночных g7
4.5 Заключение 92
Глава 5. Влияние ионов тяжелых металлов на температурные характеристики протеиназ консумента и жертвы (на примере тюльки Clupeonella cultriventris (Nordmann)) 96
5.1 Температурные характеристики протеиназ пищеварительного тракта и целого организма тюльки 96
5.2 Влияние ионов тяжелых металлов на температурные характеристики протеиназ тюльки 101
5.3 Заключение 109
Общее заключение U4
Выводы 117
Список литературы И 9
Приложение 147
- Характеристика протеиназ беспозвоночных
- Приготовление ферментативно-активных препаратов
- Раздельное и комплексное влияние температуры, рН и ионов тяжелых металлов на активность протеиназ слизистой оболочки кишечника типичных планктофагов
- Раздельное и комплексное влияние температуры, рН и ионов тяжелых металлов на активность казеинлитических протеиназ целого организма рыб
Введение к работе
Одна из острейших проблем современности - глобальное, прогрессирующее антропогенное загрязнение гидросферы. Под влиянием антропогенного пресса водные экосистемы претерпевают существенные изменения, которые приводят к снижению биоразнообразия, трансформации структуры сообществ, нарушению трофических связей и другим негативным последствиям. Одними из приоритетных химических загрязнителей являются тяжелые металлы, многие из которых обладают высокой биологической активностью и способны аккумулироваться в различных тканях гидробионтов, не подвергаясь биодеградации (Строганов, 1968; Лукьяненко, 1983; Линник, Ыабиванец, 1986; Алабастер, Ллойд, 1984; Мур, Рамамурти, 1987; Решетников, Шатуновский, 1997; Моисеенко, 1999; Кашулин, Терентьев, 2004; Немова, Высоцкая, 2004; Комов и др., 2004; Немова, 2005).
В настоящее время достаточно подробно изучены формы взаимодействия популяций разных видов, в основе которых лежат трофические связи, обеспечивающие осуществление биологического круговорота как генеральной функции экосистем (Одум, 1986; Шилов, 2000). Однако молекулярные основы этих взаимодействий исследованы недостаточно. Вместе с тем известно, что трофические связи в биоценозах в значительной мере базируются на способности консументов переваривать и усваивать биополимеры, входящие в состав тканей жертвы (Уголев, 1985). Поскольку в тканях объектов питания рыб преобладают белковые компоненты (Love, 1970; Шатуновский, 1980; Кузьмина, 1982, 2005), важную роль в их ассимиляции играют многочисленные протеиназы пищеварительного тракта рыб, объектов питания и энтеральной микробиоты (Уголев, Кузьмина, 1993; Кузьмина, 2005). При этом, несмотря на разное соотношение активности протеиназ пищеварительного тракта (Fange, Grove, 1979; Уголев, Кузьмина, 1993; Кузьмина, 2005) и активности лизосомальных гидролаз, разрушающих те же субстраты в тканях объектов питания рыб (Немова, 1996), вклад ферментов жертвы в процессы пищеварения рыб значителен (Кузьмина, 2000; Скворцова, 2002; Кузьмина и др., 2003а; Kuz'mina, Golovanova, 2004; Кузьмина и др., 2004).
Особо следует отметить, что тяжелые металлы, поступающие в организм рыб преимущественно с пищей (Handy, 1996; Kamunde et al., 2002; Bury et al, 2003), способны снижать активность протеиназ пищеварительного тракта как в условиях in vivo (Sastry, Gupta, 1979; Gupta, Sastry, 1981; Kuz'mina et al., 1999), так и в условиях in vitro (Golovanova et al., 1999; Туктаров, 2002; Кузьмина и др., 20036; Неваленый и др., 2003). При этом ранее в большинстве работ исследовались не являющиеся жизненно необходимыми, так называемые неэссенциальные металлы, в частности ртуть и кадмий. Влияние эссенциальных или биогенных (термин, наиболее часто встречающийся в современных работах) металлов, в том числе цинка и меди, на ферменты, участвующие в деградации белковых компонентов пищи рыб, исследовано недостаточно. Вместе с тем изучение их влияния на активность протеиназ пищеварительного тракта рыб и их
потенциальных объектов питания исключительно важно, поскольку они, будучи жизненно необходимыми (Алабастер, Ллойд, 1984; Watanabe et al., 1997; Остроумова, 2001), в определенных концентрациях становятся токсичными (Алабастер, Ллойд, 1984; Мур, Рамамурти, 1987).
Кроме того, твердо установлено, что одним из важнейших факторов, не только регулирующих интенсивность питания (Поддубный, 1971; Иванова, 1966), но и оказывающих существенное влияние на активность пищеварительных гидролаз (Егорова и др., 1974; Каїас, 1978а,б; Кузьмина, 1985; 19906, 2005; Simpson, Haard, 1985; Пономарев, 1993; Уголев, Кузьмина, 1993; Dimes et al., 1994; Kristjansson et al., 1995; Hidalgo et al., 1999; Bendiksen et al., 2003), является температура. Важно отметить, что в последние годы на фоне естественных флуктуации температуры наблюдается тепловое загрязнение водоемов, провоцирующее хронический стресс у гидробионтов. Помимо этого, активность ферментов, в том числе и протеиназ, в значительной мере зависит от концентрации ионов водорода (Kalac, 1978а, б; Simpson, Haard, 1985; Уголев, Кузьмина, 1993; Dimes et al., 1994; Kristjansson et al., 1995; Hidalgo et al., 1999; Chong et al., 2002a; Deguara et al., 2003; Улитина, 2005), которая может значительно варьировать в разных отделах пищеварительного тракта в зависимости от его анатомической организации и физиологического состояния рыб (Deguara et al., 2003). Изменение рН энтеральной среды может вызывать и наблюдающееся в последние десятилетия закисление водоемов, которому способствует интенсивное развитие промышленности (Комов, 2007).
Особо следует отметить, что ранее, как правило, исследовалось влияние отдельных природных и антропогенных факторов на активность протеиназ. Известна лишь единственная попытка изучения комплексного влияния температуры, рН и кадмия на активность протеиназ у трех видов пресноводных костистых рыб (Кузьмина, 1997). Сведения о раздельном и комплексном влиянии температуры, рН и эссенциальных тяжелых металлов на активность протеиназ пищеварительного тракта рыб, а также целого организма их потенциальных объектов питания до начала нашей работы отсутствовали.
Цель работы: изучение раздельного и комплексного влияния температуры, рН и тяжелых металлов (цинк, медь) на активность протеиназ, функционирующих в слизистой оболочке пищеварительного тракта рыб, значительно различающихся по характеру питания, и в целом организме их потенциальных объектов питания, а также влияния этих металлов на температурные характеристики протеолитических ферментов консументов и жертв.
Задачи исследования: 1. Сравнить активность протеиназ слизистой оболочки пищеварительного тракта рыб, значительно различающихся по характеру питания (ихтиофаги, планктофаги и бентофаги), и целого организма их потенциальных объектов питания (рыбы младших возрастных групп и представители типов Mollusca, Annelida и Arthropoda).
Исследовать раздельное и комплексное влияние ионов тяжелых металлов (цинк или медь), температуры и рН на активность протеиназ слизистой оболочки пищеварительного тракта рыб и целого организма их потенциальных объектов питания.
Изучить влияние ионов цинка и меди на температурные характеристики протеолитических ферментов пищеварительного тракта консумента и целого организма жертвы (на примере тюльки).
Научная новизна. Впервые в единых методических условиях получены и сопоставлены данные, касающиеся активности протеиназ, функционирующих в пищеварительном тракте рыб и в целом организме их потенциальных объектов питания в широком диапазоне значений температуры и рН, а также в присутствии ионов цинка и меди в концентрациях, встречающихся в естественной пище рыб и не превышающих допустимые остаточные концентрации. Показано, что токсическое действие ионов цинка и меди зависит как от температуры, так и от рН среды. При этом взаимодействие температуры, рН и тяжелых металлов (цинк, медь) видоизменяет их раздельные эффекты на активность протеиназ, функционирующих в слизистой оболочке пищеварительного тракта рыб, а также в целом организме их объектов питания. Установлено, что раздельные и комплексные эффекты исследованных факторов у представителей разных таксонов животных различны. Впервые изучены температурные характеристики протеолитических ферментов пищеварительного тракта и целого организма рыб на примере массового вида-вселенца водоемов Верхней Волги - тюльки, а также исследовано влияние на них ионов тяжелых металлов. Показано, что протеиназы пищеварительного тракта тюльки адаптированы к функционированию в широком диапазоне температур, что позволяет рыбам активно питаться при низкой температуре. Продемонстрировано значительное изменение температурных характеристик протеиназ пищеварительного тракта и целого организма рыб в присутствии ионов цинка и меди.
Теоретическая и практическая значимость работы. Выявленные закономерности позволяют оценить неизвестные ранее аспекты молекулярных основ трофических взаимоотношений рыб и их потенциальных объектов питания при меняющихся условиях окружающей среды. Данные, свидетельствующие о том, что взаимодействие природных и антропогенных факторов существенно отличается от их раздельных эффектов, могут быть использованы при разработке новых подходов к определению нагрузок на водные экосистемы. Результаты, касающиеся негативного влияния тяжелых металлов на активность протеиназ консументов и их потенциальных жертв, важны для оптимизации составов кормов и параметров среды при выращивании рыб в условиях аквакультуры. Полученные данные могут быть использованы в лекционных курсах и практикумах по экологии, а также экологической, сравнительной и эволюционной физиологии.
7 Защищаемые положения:
Цинк и медь в концентрациях, встречающихся в естественной пище и не превышающих ДОК, значительно снижают активность протеиназ пищеварительного тракта консументов и целого организма их потенциальных жертв.
Эффекты цинка и меди на активность протеиназ в значительной мере зависят от температуры и рН.
Активность протеиназ слизистой оболочки желудка в меньшей степени подвержена влиянию ионов цинка и меди, а также температуры и рН, чем активность протеиназ, функционирующих в кишечнике.
Цинк и медь значительно влияют на температурные характеристики протеиназ пищеварительного тракта консументов, а также целого организма их жертв.
Публикации: По теме диссертации опубликовано 14 статей, в том числе 7 в рецензируемых журналах, и 6 тезисов.
Апробация работы: Материалы были представлены и доложены на Международной конференции «Современные проблемы водной токсикологии» (Борок, 2005); XIII Международном совещании по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2006); Всероссийской конференции с международным участием «Актуальные проблемы физиологии пищеварения и питания» (Санкт-Петербург, 2006); IV и V Всероссийские конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2005, 2007, 2008); Международной конференции «Проблемы иммунологии, патологии и охраны здоровья рыб и других гидробионтов - 2» (Борок, 2007); Международной конференции «Естественные и инвазионные процессы формирования разнообразия водных и наземных экосистем» (Ростов-на-Дону, 2007); II научной конференции с участием стран СНГ «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов» (Петрозаводск, 2007); III Всероссийской конференции по водной токсикологии «Антропогенное влияние на водные организмы и экосистемы» (Борок, 2008); Всероссийской конференции с международным участием «Водные и наземные экосистемы: проблемы и перспективы исследований» (Вологда, 2008).
Выражаю глубокую благодарность: д.б.н. В. В. Кузьминой за предоставленную тему диссертации, руководство на всех этапах ее выполнения и доброжелательную поддержку, д.б.н. Г.М. Чуйко, д.б.н. И.Л. Головановой, д.б.н. Г.И.Извековой, к.б.н. Ю.В. Герасимову, к.б.н. Е.И. Извекову, к.б.н. Непомнящий В.А. и к.б.н. Д.В. Гариной за ценные советы и замечания при обсуждении результатов работы, СМ. Ждановой и Н.Н. Жгаревой за помощь в сборе и определении видового состава зоопланктона и зообентоса, а также М.А. Наумовой за техническую помощь при выполнении некоторых этапов работы.
Характеристика протеиназ беспозвоночных
Активность протеиназ. Данные, касающиеся активности протеиназ в разных органах пищеварительной системы беспозвоночных единичны, причем большинство из них получены при исследовании членистоногих. Показано, что активность протеиназ желудочного сока лангуста калифорнийского Panulinis interruptus и красно-клешневого рака Cherax quadricarinatus выше, чем в тканях желез средней кишки (Figueiredo et al., 2001; Celis-Guerrero et al., 2004). При этом уровень ферментативной активности может существенно варьировать в зависимости как от ряда внутренних, так и от некоторых внешних факторов. У ракообразных ферментативная активность в значительной степени зависит от стадии жизненного цикла. Так, при исследовании различных личиночных стадий ряда вида креветок установлено, что с возрастом активность трипсина существенно снижается (обзор: Jones et al., 1997). Однако активность трипсина на ранних стадиях развития артемии Artemia sp. (от цисты до науплиуса) достоверно не различается (Garcia-Ortega et al., 1998). У половозрелых особей креветки Pleoticus muelleri активность трипсина и химотрипсина гепатопанкреаса между линьками ниже, чем таковая непосредственно после линьки (Fernandez Gimenez et al., 2001). У другого вида креветки Penaeus vannamei достоверных изменений протеолитической активности пищеварительного тракта в период линьки, напротив, не выявлено (Muhlia-Almazan, Garcria-Carreno, 2002). Известно также, что активность протеиназ пищеварительного тракта криля Eiiphausia superba зависит от сезона (выше летом), что связано в первую очередь с сезонной динамикой численности фитопланктона (Yoshitomi, 2005). Кроме того, есть сведения, что скорость протеолиза у моллюсков может коррелировать с отливно-приливным и другими естественными ритмами (Reid, Raucher, 1972).
Зависимость активности протеиназ от типа питания. Активность протеиназ пищеварительного тракта беспозвоночных коррелирует с типом питания животного. Так, у хищного моллюска Cardiomya planetica протеолитическая активность пищеварительного тракта значительно выше, чем у типичного фитофага моллюска Saxidomus giganteus. У детритофага Yoldia thraciaeformis активность протеиназ желудка также выше (2 раза), чем у типичного фитофага S. giganteus (Reid, 1977). Однако при сравнении уровня протеолитической активности пищеварительного тракта у личинок и у половозрелых особей декапод с разным типом питания получены парадоксальные данные. Показано, что активность протеиназ у всеядных видов креветок Penaeus vannamei (Litopenaeus vannamei) и Penaeus monodon выше по сравнению с таковой у хищных видов Penaeus californiensis (Farfantepenaeus californiensis) и Pleoticus muelleri (Fernandez Gimenez et al., 2001). Аналогичная тенденция характерна и для личинок ракообразных: у фитофагов (Тетога и Centropages, а также у креветок на стадии зоэа) уровень активности трипсина выше, чем у всеядных видов (Artemia, Carcinus), а у хищных видов (Caridina, Homarus, Nephrops) активность трипсина минимальна. При исследовании ряда видов декапод показано, что, несмотря на преобладание фитопланктона в рационе некоторых стадий развития личинок, активность трипсина у них значительно выше, чем активность амилазы, липазы или эстеразы. С этими данными согласуется и тот факт, что максимальное значение коэффициента активность гликозидаз/активность протеиназ характерно для хищного вида Homarus americanus. С возрастом значение этого коэффициента у всех видов увеличивается, что связано, вероятно, не только с изменением состава пищи, но и с генетически обусловленными перестройками (Jones et al, 1997).
Влияние на активность ферментов биохимического состава пищи. При исследовании ракообразных установлено, что активность трипсина может зависеть и от качественного состава корма (Ezquerra et al., 1997; Fernandez Gimenez et al., 2001). Так, у креветок Penaeus vannamei, в течение 21 сут потреблявших корм с разной концентрацией казеина, активность и количество синтезируемого трипсина достоверно увеличивается при повышении концентрации белка от 25 до 40%, активность химотрипсина при этом не изменяется (Le Moullac et al., 1996). Вместе с тем у креветок Crangon crangon, в течение 10 сут находившихся на разных рационах (мидии или водоросли), а также голодавших, достоверных различий, как в общей протеолитической активности, так и в активности трипсина не отмечено (Teschke, Saborowski, 2005). Однако согласно другим данным голодание у креветки Penaeus vannamei приводит к снижению активности, как трипсина, так и химотрипсина (Muhlia-Almazan, Garcrfa-Carreno, 2002). Кроме того, установлено, что у моллюсков рода Масота скорость гидролиза белков также связана с составом и количеством доступной пищи (Reid, Riiucher, 1972).
Межвидовые различия. Активность протеиназ значительно варьирует не только у животных, относящихся к разным типам, но и у близкородственных видов. При сопоставлении активности трипсиноподобных протеиназ в целом организме ряда видов пресноводных гидробионтов, относящихся к типам Mollusca, Annelida и Artropoda, показано, что у представителей бентоса она существенно ниже, чем у представителей зоопланктона (Dabrowski, Glogowski, 1977; Кузьмина, 2005). При изучении активности протеиназ по казеину (рН 8.0) у ряда ракообразных, в частности у лангуста Panulirus interraptus, омара Homarns gammarus, большого краба Cancer pagurus, а также крабов-плавунцов Callinectes arcuatus и Callinectes bellicosus, также установлены значительные видовые различия. Так, максимальная активность отмечена у лангуста P. interraptus, несколько меньшая (в 1.6 раза) у большого краба С. pagurus, минимальная (в 15.7 раз ниже) у омара Н. gammarus (Navarrete del Того et al., 2006).
Данные, касающиеся межвидовых различий активности катепсинов беспозвоночных, а также ее зависимости от состава и количества пищи в доступной литературе не обнаружены. Известно лишь, что активность катепсинов у хищных видов креветок выше, чем у всеядных (Guillaume, Ceccaldi, 2001; цит. по Navarrete del Того et al., 2006). Также есть сведения, что активность катепсина В моллюска Tresus сарах ниже зимой, когда мало доступной пищи, в то время как активность катепсина D постоянна на протяжении всего годового цикла (Reid, Rauchert, 1976).
Множественность форм и молекулярная масса сериновых протеиназ. Трипсин и химотрипсин у беспозвоночных характеризуется множественностью молекулярных форм. У гребешка Pecten maximus обнаружено три изоформы химотрипсина с молекулярными массами близкими 32 кДа (Le Chevalier et al., 1995). У лангуста Procambarus clarkia трипсин представлен четырьмя изозимами (Kim et al., 1994). У креветки Pleoticus muelleri обнаружено три изоформы трипсина с молекулярными массами 17.4, 19.1 и 20 кДа, а также одна 21.9 кДа изоформа химотрипсина (Fernandez Gimenez et al., 2001). Даже у двух близкородственных видов крабов-плавунцов Callinectes bellicosus и Callinectes arcuatus количество форм сериновых эндопептидаз варьирует. Так, у С. bellicosus выделено по три изоформы трипсина с разными молекулярными массами (26.9, 24.9, и 23.6 кДа) и химотрипсина (42.6, 34.9 и 33.2 кДа), у С. arcuatus - пять изоформ трипсина (25.8, 24.7, 23.1, 21.6, и 20.2 кДа) и лишь две - химотрипсина (30.8 и 28.4 кДа) (Diazenorio et al., 2006). Важно отметить, что молекулярная масса различных форм трипсина и химотрипсина у дафнии Daphnia carinata может колебаться еще значительнее - от 20 до 93 кДа (Kumar et al., 2005).
Катепсины, подобно другим протеиназам, могут быть представлены несколькими изозимами. Так, из гепатопанкреаса креветки Penaeus vannamei выделено две изоформы катепсина L (Le Boulay et al., 1996). Структура молекулы одноименных катепсинов и их молекулярная масса у разных видов значительно варьирует. Действительно, катепсин D (38кДа), выделенный из пищеварительной железы кальмара Todarodes sagittatus, состоит из двух цепочек (10 и 28кДа), связанных при помощи дисульфидных мостиков (Gildberg, 1987), а катепсин D из мантии мидии Mytilus edulis представлен одной цепочкой (49кДа) (Okada, Aikawa, 1986). У моллюска Tresus сарах молекулярная масса катепсина В составляет 52кДа (Reid, Rauchert, 1976). Наибольшей молекулярной массой (ЮОкДа) из всех изученных катепсинов обладает катепсин Е, выделенный из кишечника морского ежа Strongylocentrotus nudus (Ikeda et al., 1986).
Приготовление ферментативно-активных препаратов
Исследованные виды рыб и ряд беспозвоночных были отловлены в Рыбинском водохранилище, моллюски, олигохеты, личинки хирономид - в прибрежных прудах. Личинки Chironomus riparius взяты из культуры, содержащейся в лаборатории. Масса рыб-консументов: щука - 950±120г, судак - 1130±56г, налим - 620±70г, окунь - 128±35г, лещ - 920±54г., синец - 285±13г., плотва - 324±38г., тюлька - 12.3±3г. и уклейка -9.7±2.3г. После поимки животных в течение 1-2ч доставляли в лабораторию. Затем у рыб, исследуемых в качестве консументов, на холоду изымали желудочно-кишечный тракт и специальным скребком снимали слизистую оболочку желудка и кишечника. Готовили суммарные пробы, в состав которых входила слизистая от 3-15 экз. рыб одного вида. Слизистую тщательно перемешивали и отбирали аликвоту для приготовления исходного гомогената. Для опыта по изучению температурных характеристик ферментов тюльки также собирали и использовали для приготовления гомогената химус. Для приготовления гомогенатов потенциальных жертв использовали целые организмы гидробионтов. Тушки мелких неполовозрелых особей рыб измельчали и готовили суммарные пробы, в состав которых обычно входило 5-15 экз. одного вида, в суммарные пробы 1.5 мес. сеголеток -до 50-60 особей разных видов рыб сем. карповых. У моллюсков снимали раковину. В состав проб беспозвоночных входило 7-10 экз. моллюсков, а также десятки и сотни экз. других животных. Гомогенаты готовили при помощи стеклянного гомогенизатора, добавляя охлажденный до 2-4С раствор Рингера для холоднокровных животных (109 тМ NaCl, 1.9 тМ КС1, 1.1 тМ СаС12, 1.2 тМ NaHC03) в соотношении 1:49 или 1:99 (для изучения температурных характеристик ферментов тюльки).
Определение проводили в широком диапазоне значений рН: 3.0, 4.0 и 5.0 - для протеиназ желудка, 5.0, 7.4, и 8.5 - для протеиназ кишечника, а также 3.0, 5.0, 7.4 и 8.5 -для протеиназ целого организма жертв. Изучения температурных характеристик протеиназ тюльки проводилось при рН 3.0 и 5.0 в случае протеиназ желудка и целого организма и 7.4 в случае протеиназ кишечника и химуса. Активность протеиназ определяли по приросту тирозина методом Ансона (1938) в некоторой модификации (Кузьмина, Егорова, 1988). В основе метода лежит цветная реакция компонентов реактива Фолина-Чиокальтеу с продуктами протеолиза (преимущественно тирозин). При взаимодействии аминокислот, ионов меди, вольфрамата и молибдата в присутствии фосфорной кислоты развивается синее окрашивание, пропорциональное количеству тирозина. Интенсивность окрашивания определяли на фотоколориметре (КФК-2) при красном светофильтре, А.=587 нм. Для определения гемоглобинлитической активности ферментов желудка (преимущественно пепсин КФ 3.4.23.1) и кишечника (преимущественно химотрипсин, КФ 3.4.21.1), а также целого организма жертв (химотрипсин, КФ 3.4.21.1, лизосомальные катепсины КФ 3.4.12-3.4.14, 3.4.21.-3.4.23, а также в случае рыб пепсин КФ 3.4.23.1) использовали 1% раствор гемоглобина. Для определения казеинлитической активности (преимущественно трипсин, КФ 3.4.21.4, а также лизосомальные катепсины КФ 3.4.12-3.4.14, 3.4.21.-3.4.23 в случае жертв) использовали 1% раствор казеина. Кроме того, определяли активность протеиназ по казеину и по гемоглобину химуса тюльки, обусловленные как активностью вышеназванных гидролаз, так и металлоферментами энтеральной микробиоты (нейтральные протеиназы КФ 3.4.24.4). Ферментативную активность определяли в 4-х повторностях для каждой точки с учетом фона и выражали в мкмоль/(г-мин). Энергию активации (Еакт) рассчитывали графическим методом Аррениуса, коэффициенты Qio -общепринятым способом. Реактивы: Растворы сернокислой меди (СиБО НгО) и сернокислого цинка (ZnSCVVtbO), в концентрации 10 мг/л в расчете на ион металла. 1% субстрат (гемоглобин или казеин), приготовленный на растворе Рингера для холоднокровных животных 0.3 N трихлоруксусная кислота (ТХУ) 0.0025 N раствор CuS04 0.5NNaOH Реактив Фолина-Чиокальтеу Раствор Рингера Ход определения. В пробирки, не содержащие ионов металла (контроль опыта) приливали 0.25 мл гомогената, 0.25 мл раствора Рингера. В опытные пробирки вместо раствора Рингера приливали раствор сернокислого цинка или сернокислой меди (10 мг/л). Предъынкубация продолжалась в течение 1ч при температуре 0, 10, 20 и 37С. Затем к содержимому пробирок добавляли 0.5 мл субстрата и инкубировали при тех же температурах в течение 30 мин при непрерывном перемешивании для лучшего контакта фермента с субстратом. В опыте по изучению температурных характеристик ферментов тюльки проводилась только инкубация в течение ЗОмин в широком диапазоне значений температуры (0-70С). После этого во все пробирки приливали 1 мл ТХУ, а в аналитический контроль (фон) ТХУ приливали до инкубации ферментативно активного препарата и субстрата. Пробирки выдерживали при комнатной температуре в течение 30 мин для формирования осадка. Пробы снова встряхивали и фильтровали через бумажные фильтры в течение 5-10 мин. Затем к 0.5 мл фильтрата приливали 0.25 мл C11SO4, 2 мл NaOH и 0.75 мл реактива Фолина-Чиокальтеу. Пробирки с содержимым оставляли на 20 мин под тягой для развития окраски, после чего пробы просматривали на фотоэлектроколориметре, КФК-2 при длине волны 670 нм. Для построения калибровочной кривой использовали 0.25-1.0 тМ растворы тирозина. Активность фермента выражали в единицах скорости ферментативной реакции (количество образовавшегося тирозина за 1 мин инкубации) в пересчете на 1 г влажной массы ткани. Расчет производили по формуле: (єо - єк) х 100 V= , ScrXt где V - активность фермента, є0 - оптическая плотность опытной пробы, ек - оптическая плотность контрольной пробы, Єст - оптическая плотность стандартного 1 мМ раствора тирозина, 100 - разведение ткани, t - время инкубации.
Раздельное и комплексное влияние температуры, рН и ионов тяжелых металлов на активность протеиназ слизистой оболочки кишечника типичных планктофагов
Как отмечалось в обзоре литературы, существуют значительные сложности в корректной классификации протеиназ рыб. Поскольку идентификация протеолитических ферментов затруднена, обычно пользуются термином «подобные» (пепсиноподобные, трипсиноподобные и другие) или обозначают ферменты по названию использованных субстратов (казеинлитические, гемоглобинлитические и другие).
Ранее при нашем участии было показано, что у пресноводных костистых рыб цинк и медь в диапазоне концентраций от 0.1 до 50 мг/л, как правило, вызывают достоверное снижение уровня активности протеиназ пищеварительного тракта по гемоглобину (пепсин и химотрипсин) и казеину (трипсин) (Кузьмина и др., 2005). Исследование было проведено при стандартных значениях температуры (20С) и рН (3.0 для протеиназ желудка и 7.4 для протеиназ кишечника). Однако температура и рН в естественной среде обитания рыб могут существенно варьировать. В связи с этим представляло интерес изучение влияния меди и цинка в широком диапазоне значений температуры и рН, а также изучение комплексного действия этих факторов. Для данного исследования была выбрана концентрация тяжелых металлов 10 мг/л, которая встречается в потенциальных жертвах рыб (Гапеева, 1993; Соболев, 2005а, б) и не превышают допустимую остаточную концентрацию в рыбной продукции (Остроумова, 2001; Перевозников, Богданова, 1999).
Раздельное и комплексное влияние температуры, рН и ионов тяжелых металлов на активность пепсиноподобных протеиназ слизистой оболочки желудка типичных и факультативных ихтиофагов.
Полученные данные свидетельствуют о том, что в период активного питания (щука, судак и окунь — в июне, налим - в феврале) уровень активности протеиназ по гемоглобину (АПГ) при стандартных значениях температуры (20С) и рН (3.0) у щуки в 2 раза выше, чем у других исследованных видов рыб (рис. 1). При этом на величину показателя большее влияние оказывает интенсивность, чем тип питания. Так, у типичного ихтиофага судака и факультативных ихтиофагов налима и окуня активность близка - 7.51, 7.66 и 8.28 мкмоль/(г-мин) соответственно, у типичного ихтиофага щуки в период наиболее интенсивного питания - 14.96 мкмоль/(гмин). При стандартных значениях рН (3.0) температура оказывает незначительное влияние на ферментативную активность. При температуре 0С уровень активности протеиназ у всех видов рыб достоверно снижается на 22-27% (Приложение: табл. Обозначения: ось X - рН, ось Y - температура, С, ось Z - ферментативная активность, мкмоль/(г-мин). Незаштрихованные столбики - контроль, темные заштрихованные - Zn, светлые заштрихованные - Си. активности пепсиноподобных протеиназ, степень которого у рыб разных видов значительно варьирует: при температуре 20С у щуки активность снижается на 5%, у судака - на 25%, у налима — на 30%, у окуня - на 70%. Металлы меньше влияют на ферментативную активность по сравнению с природными факторами. В присутствии цинка активность снижается на 6-8%, в присутствии меди - на 8-12%. Лишь у окуня при рН 5.0 АПГ в присутствии цинка снижается на 71 и 17%, в присутствии меди - на 75 и 28% при температуре 0 и 20С соответственно.
При комплексном воздействии температуры и рН наиболее значительно уровень АПГ снижается при действии температуры 0С и рН 5.0: у щуки на 35%, у судака и налима на 50%, у окуня на 80%. В присутствии цинка при температуре 0С ферментативная активность у всех исследованных видов снижается на 27-35% по сравнению со стандартными значениями. В присутствии меди в тех же условиях в наибольшей степени активность снижается у щуки (на 36%), в наименьшей - у окуня (на 28%).
При комплексном действии всех исследованные факторов отмеченные выше ингибиторные эффекты усиливаются. Наиболее устойчивыми оказались протеиназы желудка щуки: при температуре 0С, рН 5.0 и в присутствии цинка ферментативная активность снижается на 38%, в присутствии меди - на 40%. Наименее устойчивы ферменты желудка окуня. В тех же условиях в присутствии цинка протеолитическая активность снижается на 94%, в присутствии меди - на 95%. У двух других видов активность протеиназ уменьшается на 56-65%, причем эффекты меди несколько выше эффектов цинка. Увеличение температуры до 37С приводит к значительному снижению эффектов рН и тяжелых металлов. В присутствии металлов у большинства исследованных видов рыб устойчивость ферментов повышается приблизительно в 2 раза.Раздельное и комплексное влияние температуры, рН и ионов тяжелых металлов на активность протеиназ слизистой оболочки кишечника типичных и факультативных ихтиофагов.
Активность протеиназ слизистой оболочки кишечника ихтиофагов при стандартных значениях температуры и рН (20С, 7.4) представлена в табл. 1. Результаты опытов по раздельному и комплексному влиянию температуры, рН, цинка и меди на уровень активности протеиназ по казеину (АПК) и АПГ слизистой оболочки кишечника рыб значительно отличаются от данных, полученных при изучении АПГ слизистой оболочки желудка (рис. 2, 3). Прежде всего, это касается значительного влияния температуры на ферментативную активность, особенно трипсиноподобных протеиназ.
Так, при температуре 0С (рН 7.4, в отсутствии цинка и меди) уровень протеолитической активности в наибольшей степени снижается у окуня - на 90%, у остальных видов - на 68-72%. Химотрипсиноподобные протеиназы, напротив, наиболее устойчивы у окуня -активность снижается на 30%), у щуки - на 40%, у двух других видов - приблизительно на 75%). При этом у всех видов рыб характерно значительное увеличение ферментативной активности при температуре 37С.
рН среды в меньшей степени влияет на активность трипсин- и химотрипсиноподобных протеиназ. Значительное уменьшение ферментативной активности при рН 5.0 и увеличение при рН 8.5 отмечено в обоих случаях лишь для налима. У окуня выявлено лишь уменьшение АПК при рН 5.0. При изучении влияния металлов при температуре 20С и рН 7.4 наименьшее снижение АПК отмечено у налима (13 и 7% в присутствии меди и цинка соответственно), наибольшее - в присутствии меди у окуня (40%) и в присутствии цинка у судака (20%). При тех же значениях температуры и рН в присутствии обоих металлов минимальное снижение АПГ отмечено также у налима, максимальное — у щуки (табл. 2). Обращают на себя внимание различия в степени воздействия исследованных металлов на одноименные ферменты у рыб разных видов. У судака и налима эффект меди выше эффекта цинка на 5, у щуки - на 13, у окуня на 22%). АПГ в присутствии цинка и меди в большей степени снижается у щуки - на 58 и 63% соответственно. Наиболее устойчивы ферменты налима - активность снижается лишь на 13 и 14% соответственно. Следует отметить, что в большинстве случаев снижение как АПК, так и АПГ несколько выше при 0С по сравнению с таковым при 20С. Исключение составляют АПК и АПГ у щуки при рН 5.0, АПГ у окуня при рН 8.5, а также АПК и АПГ у налима при рН 7.4 и 8.5. В указанных случаях степень снижения ферментативной активности при обеих температурах близка. Особое внимание следует обратить на то, что при рН 5.0 активность протеиназ слизистой оболочки кишечника налима в присутствии обоих металлов снижается в большей степени, чем при нейтральных и щелочных значениях рН.
Раздельное и комплексное влияние температуры, рН и ионов тяжелых металлов на активность казеинлитических протеиназ целого организма рыб
Полученные данные свидетельствуют о том, что наиболее высокий уровень активности протеиназ по казеину (АПК) при стандартных значениях температуры (20С) и рН (7.4) характерен для плотвы и окуня - 1.01 ± 0.03 и 1.39 ± 0.07, несколько ниже для ерша и сеголеток карповых рыб - 0.92 ± 0.06 и 0.72 ± 0.04, наиболее низкий для тюльки и карпа - 0.37 ± 0.04 и 0.22 ± 0.03 мкмоль / (г-мин) (рис. 7, 8). При снижении температуры во всем исследованном диапазоне рН ферментативная активность достоверно уменьшается. Так, при рН 7.4 при понижении температуры от 20С до 0С уровень активности протеиназ снижается в 2-5 раз. Влияние рН на ферментативную активность у разных видов рыб имеет разнонаправленный характер. При рН 5.0 (20С) у плотвы, сеголеток карповых рыб и ерша активность снижается в 1.2-2.0 раза, у остальных видов увеличивается в 1.5-2.0 раза по отношению к стандартным значениям. При рН 8.5 у большинства видов рыб активность протеиназ несколько увеличивается, у окуня -практически не изменяется. Металлы в разной степени влияют на ферментативную активность. При рН 7.4 в присутствии цинка у рыб, относящихся к сем. карповые, активность снижается в 2.0 раза, у рыб, относящихся к сем. окуневые и сельдевые - в 1.3 раза; в присутствии меди - в 2.5 и 1.7 раза; при рН 5.0 -в 1.6 и 1.7, а также в 2.7 и 1.9 раза соответственно. Эффекты тяжелых металлов на активность протеиназ целого организма рыб, как и в случае протеиназ слизистой оболочки их пищеварительного тракта, усиливаются при снижении температуры (табл. 4). Так, у окуня при рН 8.5 в присутствии цинка активность при 20С практически не изменяется, при 0С - снижается в 3 раза. Кроме того, в большинстве случаев токсическое действие металлов несколько уменьшается при повышении значений рН до 8.5.
При комплексном действии температуры 0С и рН 5.0 наблюдается разная степень снижения уровня АПК. Если у сеголеток карповых рыб активность снижается до 0, у плотвы - в 5, у ерша - в 3.5 раза, то у карпа, окуня и тюльки - не более чем в 2 раза. При температуре 0С и щелочных значениях рН в большинстве случаев степень снижения ферментативной активности существенно ниже, чем при кислых значениях рН. Вместе с
Примечание. отсутствие данных из-за денатурации казеина. тем у сеголеток карповых рыб отмечено некоторое увеличение активности протеиназ. В результате этого у большинства видов рыб при 0С и рН 8.5 активность в 1.5-2 раза выше, чем при рН 5.0, лишь у окуня в 2.5 раза ниже. Во всех указанных случаях изменения ферментативной активности достоверны (Приложение табл. 4). При комплексном действии ионов цинка и температуры 0С ферментативная активность у всех видов рыб уменьшается значительнее: у представителей сем. карповых в 3-5, у ерша - в 4, у окуня - в 6, у тюльки - в 9 раза по сравнению со стандартными значениями. В присутствии меди в тех же условиях негативный эффект возрастает: у представителей сем. карповых активность снижается в 5-11, у ерша - в 6, у тюльки - в 18, у окуня - в 35 раза.
При комплексном воздействии температуры, рН и ионов металлов отмеченные выше ингибиторные эффекты значительно усиливаются. При температуре 0С, рН 5.0 и
Обозначения: ось X - рН, ось Y - температура, С, ось Z - ферментативная активность, мкмоль/(г-мин). Незаштрихованные столбики - контроль, темные заштрихованные - Zn, светлые заштрихованные - Си.Обозначения: ось X - рН, ось Y - температура, С, ось Z - ферментативная активность, мкмоль/(г-мин). Незаштрихованные столбики - контроль, темные заштрихованные - Zn, светлые заштрихованные - Си. в присутствии цинка АПК снижается у сеголеток карповых рыб до 0, у плотвы - в 11 у остальных видов - 3-6 раз; в присутствии меди - до 0, в 34, в 5-15 раз соответственно. В зоне щелочных значений рН в одних случаях эффекты ниже, в других - выше, чем в зоне кислых значений рН. У рыб, относящихся к сем. карповые, при 0С и рН 8.5 в присутствии цинка активность снижается до 4 раз, в присутствии меди - до 11 раз. У тюльки, ерша и окуня в первом случае активность снижается в 1.5, 2 и 28 раз, во втором -в 18, 3 и 35 раз соответственно. Однако различия достоверны лишь в нескольких случаях (Приложение табл. 4).
