Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Цитогенетический мониторинг - эффективный способ оценки состояния окружающей среды и живых организмов 10
1.1.1. Критерии цитогенетического мониторинга 16
1.2. Информативность митоза как основного типа деления клеток пролиферирующей ткани для оценки состояния генетического аппарата организмов 20
1.3. Сосна обыкновенная как одна из основных лесообразующих пород в Воронежской области 1.3.1. Систематическое положение, биология и ареал 29
1.3.2. Цитогенетика 36
1.4. Тяжелые металлы - приоритетные токсиканты 42
1.4.1. Источники загрязнения биосферы тяжелыми металлами 43
1.4.2. Влияние физических и химических свойств тяжелых металлов на уровень индуцируемого биологического эффекта 50
1.4.3. Цитогенетические эффекты воздействия разных концентраций тяжелых металлов 56
1.4.4. Молекулярные и клеточные механизмы реакции растений на воздействие тяжелых металлов 59
Глава 2. Материал и методика 64
2.1. Эколого-географическая характеристика Усманского бора 64
2.2. Характеристика объекта исследования 65
2.3. Методика изготовления микропрепаратов и обработка результатов 67
2.4. Биохимические методы исследования 69
Глава 3. Результаты исследований и обсуждение 75
3.1. Цитогенетика сосны обыкновенной из различных районов Усманского бора (2006-2008 гг.) 75
3.1.1. Митотическая активность 75
3.1.2. Уровень и спектр патологий митоза 78
3.1.3. Ядрышковая активность 83
3.1.4. Частота встречаемости клеток с микроядрами 86
3.2. Влияние нитрата свинца на цитогенетические и биохимические показатели сосны обыкновенной (2009 г) 88
3.2.1. Цитогенетический анализ 89
3.2.2. Биохимические исследования 96
3.3. Влияние нитратов свинца, цинка, меди и калия на цитогенетическую изменчивость сосны обыкновенной (2010 г) 103
3.3.1. Сравнительный анализ воздействия тяжелых металлов на цитогенетические показатели сосны обыкновенной 116
Выводы 131
Список литературы 133
- Цитогенетический мониторинг - эффективный способ оценки состояния окружающей среды и живых организмов
- Влияние физических и химических свойств тяжелых металлов на уровень индуцируемого биологического эффекта
- Уровень и спектр патологий митоза
- Сравнительный анализ воздействия тяжелых металлов на цитогенетические показатели сосны обыкновенной
Введение к работе
Актуальность темы. Своевременная оценка устойчивости лесных экосистем имеет огромное значение в связи с постоянно усиливающимся антропогенным давлением. В России сегодня наблюдается кризис лесных сообществ, который проявляется в сокращении площади лесных территорий, снижении их устойчивости, продуктивности, способности противостоять вредителям и болезням, в сокращении видового разнообразия. Так, за последние годы в Центрально-Черноземной зоне в целом лесистость упала с 18,7 до 10,4%, а непосредственно в Воронежской области до 7,4%. С ростом населения и интенсификацией хозяйственной деятельности значение леса постоянно возрастает, лесные территории же неуклонно сокращаются (Гераськина, 2007; Шилов, 2011). В сложившейся ситуации большое значение для оптимизации лесовосстановительного и лесообразовательного процесса имеет изучение влияния природных и антропогенных факторов на продуктивность и устойчивость лесов.
Реакция растений на факторы среды изучена далеко не полностью. В результате различных видов человеческой деятельности в воздух и почву выбрасывается более 200 различных компонентов. Среди них обширную группу занимают тяжелые металлы (ТМ), влияние которых на живые организмы (чаще травянистые и реже лиственные древесные растения) в последнее время активно изучается на морфофизиологическом и биохимическом уровнях (Бессонова и др., 1991; Chakravatry et al., 1992; Fargasova et al., 1998; Довгалюк и др., 2001; Montvydiena, 2004; Титов и др., 2007; Кузнецова, 2009; Серегин, 2009). Практически отсутствуют экспериментальные работы, направленные на изучение действия конкретных металлов на важнейшие цитогенетические показатели хвойных растений (Федорков, 2011). Известно, что ТМ помимо токсического эффекта оказывают и мутагенный, который в настоящее время изучен крайне слабо и разрозненно (Genotoxic effects of heavy metals..., 1998; Кулаева и др., 2010). Изучение цитогенетических реакций сосны обыкновенной на воздействие ТМ позволит определить уже на ранних этапах их генотоксический эффект; характер, специфику и механизмы воздействия на цитогенетический аппарат; чувствительность к этим факторам различных цитогенетических показателей и др. Эти вопросы недостаточно изучены у хвойных видов. Установление закономерностей индукции цитогенетических эффектов у растений при действии ТМ необходимо для обоснования решений в природоохранной деятельности, для восстановления лесов на значительных по площади территориях, загрязненных ТМ.
Целью работы явилось изучение влияния различных тяжелых металлов на цитогенетические показатели проростков семян сосны обыкновенной из Усманского бора (выделенного в категорию особо ценных лесов) для оценки их генотоксичности и выявления возможных механизмов воздействия.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
1. Изучить цитогенетические характеристики семенного потомства сосны из различных районов Усманского бора в многолетней динамике.
Оценить чувствительность проростков сосны обыкновенной к воздействию нитрата свинца на примере цитогенетических показателей, а также активности и изозимного спектра дыхательных ферментов.
Разработать ряды генотоксичности ТМ и схему их влияния на цитогенетические параметры сосны обыкновенной.
Научная новизна работы. Впервые проведены исследования по изучению цитогенетических характеристик семенного потомства сосны обыкновенной при воздействии солей ТМ, взятых в различных концентрациях. Определены опытным путем пороговые концентрации для каждого из использованных металлов.
Выявлена большая чувствительность цитогенетических критериев (уровень и спектр патологий митоза, частота встречаемости микроядер, доля клеток на разных стадиях митоза) для оценки воздействия ТМ по сравнению с определением активности и изозимного спектра дыхательных ферментов. По результатам воздействия ТМ на проростки семян сосны обыкновенной сформированы ряды генотоксического и токсического эффектов влияния. Предпринята попытка выявления механизмов их действия на клеточном уровне.
Проведен пятилетний цитогенетический мониторинг шести выборок Усманского бора, что позволяет оценить состояние уникального леса, находящегося в заповедной зоне, как удовлетворительное.
Теоретическое и практическое значение работы. Результаты экспериментальных исследований дополняют существующие сведения о влиянии ТМ в различных концентрациях на цитогенетические показатели хвойных растений, а также о механизмах, регулирующих эти процессы. Полученные данные расширяют представление о возможности использования сосны обыкновенной как тест-объекта.
Основные результаты работы могут быть использованы при проведении селекционно-генетических исследований, направленных на повышение металлоустойчивости хвойных растений, а также в учебном процессе при чтении лекционных курсов по общей экологии, генетике, физиологии растений, биохимии, а также ряда спецкурсов (экологическая генетика, цитогенетика).
На защиту выносятся следующие положения:
Результаты проведенных цитогенетических исследований шести выборок (из Краснолесного и Борского лесничеств) Усманского бора свидетельствуют об удовлетворительном состоянии исследованного древостоя и подтверждают возможность их использования в качестве источника семян для лесовосстановительных работ, а также для экспериментальных исследований по изучению влияния стрессоров различной природы (в частности ТМ) на сосну обыкновенную.
На примере сосны обыкновенной показана большая чувствительность цитогенетических показателей (уровень и спектр патологий митоза, доля клеток на переходе метафаза-анафаза, доля микроядер) по сравнению с активностью и изозимным спектром дыхательных ферментов для оценки токсичности ТМ.
Токсический и генотоксический эффекты воздействия одного и того же металла разнохарактерны и позволяют формировать различные ряды по уровню индуцируемого питогенетического эффекта.
Возможными механизмами действия ТМ является блокировка полимеризации тубулина микротрубочек веретена деления ионами ТМ (что приводит к задержке клеточного цикла на стадиях метафазы и мета-анафазы), а также их ингибирующее действие на ферменты репарации ДНК (что цитологически проявляется в существенном увеличении доли фрагментов хромосом в метафазе митоза и микроядер в интерфазных клетках).
Личный вклад. Автором разработаны теоретические и методические положения диссертационной работы, обоснованы цели и задачи исследования, проведен сбор и анализ экспериментального материала, обобщены результаты исследований. Статьи и научные доклады подготовлены самостоятельно и в соавторстве.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 5-ом Международном совещании «Кариология, кариосистематика и молекулярная систематика растений» (Санкт-Петербург, 2005); на Всероссийской студенческой конференции «Роль естественных наук в решении проблем современного общества» (Липецк, 2009); на 8-й Международной научно-практической конференции «Природноресурсный потенциал, экология и устойчивое развитие регионов России» (Пенза, 2010); на 14-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2010); на 15-й Международной экологической студенческой конференции «Экология России и сопредельных территорий» (Новосибирск, 2010); на 19-й Международной научно-практической конференции «Экология и жизнь» (Пенза, 2010); на 1-й Международной научно-практической заочной конференции «Экологическая безопасность и устойчивое развитие территорий» (Чебоксары, 2010), а также на научных конференциях ВГУ (2009, 2010).
Исследования поддержаны Федеральной целевой программой "Научные и научно-педагогические кадры для инновационной России" (ГК N П395, П270, 14.740.11.0114, 14.740.11.0169).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ, включая 3 статьи в рецензируемых журналах.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из общей характеристики работы, 3-х глав, выводов и списка литературы, включающего 268 наименований, в том числе 68 иностранных. Работа изложена на 160 страницах, содержит 8 таблиц и 36 рисунков.
Цитогенетический мониторинг - эффективный способ оценки состояния окружающей среды и живых организмов
В связи с ростом обеспокоенности мировой общественности проблемой изменения природной среды существует настоятельная необходимость в разработке операциональных систем оценки ее состояния, ее благоприятности для живых существ и человека. Основной системой оценки состояния окружающей среды является мониторинг. Мониторинг - это система повторных наблюдений за изменениями в пространстве и во времени одного или нескольких элементов окружающей среды по заранее разработанной программе. В качестве таких элементов может быть климат, гидрологический режим, сейсмическая активность территории и т.п. Актуальность антропогенных изменений природной среды привела к необходимости создания специальной информационной системы, получившей название мониторинга окружающей природной среды, основными задачами которого являются наблюдения за факторами воздействия на окружающую среду и за состоянием среды, оценка фактического состояния в перспективе.
По мнению Ю.А. Израэля (Израэль, 1979), мониторинг - это система наблюдений, оценки и прогноза состояния природной среды, не включающая управления качеством окружающей среды. Блок-схема мониторинга представляет собой замкнутую систему, в которой результаты оценок фактического и прогнозируемого состояния окружающей среды служат исходной базой как для управления качеством среды, так и совершенствования структуры и методов мониторинга.
Термин «мониторинг» впервые появился в рекомендациях специальной комиссии СКОПЕ (Научный комитет по проблемам окружающей среды при ЮНЕСКО) в 1971 году, начал использоваться в Глобальной системе мониторинга окружающей среды после Стокгольмской конференции ООН 1972 г. и отличается от термина «контроль» тем, что кроме элементов наблюдения содержит элементы активных действий, регулирования и управления природопользованием и охраной природы. Целями мониторинга являются: сбор количественных и качественных показателей по состоянию окружающей среды, обобщение информации, оценка и их ранжирование по степени опасности, прогноз, возможных изменений (Израэль, 1979; Лозановская, 1998).
Мониторинг включает в себя наблюдение, оценку и прогноз состояния природной среды под влиянием антропогенного воздействия с целью предупреждения о создающихся критических ситуациях, вредных или опасных для здоровья людей, благополучия других существ в природных или созданных человеком объектах (Герасимов, 1975; Израэль, 1979).
Одним из направлений биомониторинга является генетический мониторинг, задача которого состоит в долговременном слежении за состоянием популяционных генофондов, оценке и прогнозировании их динамики во времени и пространстве, определении допустимых пределов изменений (Алтухов, 1995).
Цитогенетический мониторинг, базируясь на основных принципах генетического мониторинга и являясь его производной, ставит перед собой задачи по оценке и контролю за состоянием хромосомного комплекса организма в ходе митоза и мейоза при спонтанном и индуцированном мутагенезе (Захаров, 1993). Необходимость исследования цитогенетического мониторинга при оценке состояния живых организмов обусловлена возрастанием в окружающей среде количества вредных веществ, обладающих мутагенной активностью (Бурдин, 1985; Калашник, 1997). Таким образом, цитогенетический мониторинг - это долговременное слежение за состоянием хромосомного аппарата клеток растений и животных, оценка и прогнозирование изменений в хромосомном аппарате, динамика этих изменений во времени, определение пределов допустимых изменений (Калашник, 1997, 1999).
Также можно сказать, что цитогенетический мониторинг представляет собой системы мер слежения, оценки и прогнозирования состояния цитогенетической системы (хромосомного аппарата в митотическом и мейотическом циклах) при спонтанном и индуцированном мутагенезе. Основной целью цитогенетического мониторинга является обнаружение хромосомных мутаций в тест-системах, по чувствительности близких человеку и контроль за их фенотипическим проявлением и распространением в популяциях (Константинов, 1971). Методы цитогенетического мониторинга имеют ряд преимуществ:
Методы цитогенетичекого мониторинга имеют ряд преимуществ: -применимы для значительного числа объектов и типов клеток;
-непосредственно изучаются хромосомные мутации, которые могут служить косвенным показателем состояния окружающей среды;
-можно наблюдать весь геном целиком непосредственно в микроскоп, что может сыграть важную роль в случае соединений, которые имеют специфические участки действия (так называемые «горячие точки») (Калашник, 1991);
-позволяют оценить комплексное действие всех неблагоприятных факторов на генетический аппарат живых организмов в зависимости от дозы и времени их воздействия по реакциям генетического аппарата их соматических и генеративных клеток.
-способны регистрировать отдаленные эффекты загрязнения окружающей среды (например, последствия радиоактивного заражения), отражающиеся на состоянии генетического статуса целых популяций (Муратова, Зубарева, 1990; Гуськов, 2000).
-методы достаточно просты, недороги, пригодны для широкого применения (Федоров, 1975; Захаренко, 1999), позволяют проводить прижизненную оценку особей (микроядерный тест);
-высокая чувствительность цитогенетических методов, позволяющая экстраполировать полученные в ходе исследований растительных и животных тест-объектов данные на человека (Духарев и др., 1988).
-важное преимущество цитогенетического мониторинга состоит в том, что влияние пороговых величин антропогенных факторов фиксируется не только по структурным перестройкам кариотипа, но и по изменениям функциональной активности генома клетки (Муратова, 1990; Гуськов, 2000).
Одной из ключевых задач, предшествующих проведению цитогенетического мониторинга, является выбор тест-объекта исследования, который должен удовлетворять ряду обязательных требований: обладать высокой чувствительностью к разного рода воздействиям, выявлять все типы генетических повреждений, а также позволять экстраполировать полученные с помощью выбранной тест-системы или тест-объекта данные на человека. Они должны также быть достаточно широко распространенными и доступными для исследования. Такими качествами обладают древесные растения, главное преимущество которых состоит в их долгожительстве и многолетнем произрастании на одном и том же месте, в возможности проводить долговременный скрининг состояния организма и, кроме того, отслеживать последствия перенесенных в ходе онтогенеза стрессов самой разной природы. Древесные растения широко используют в озеленительных зонах вокруг промышленных объектов, вдоль шоссейных дорог, т.е. в тех местах, где опасность антропогенного загрязнения особенно велика. Причем, хвойные породы обладают высокой чувствительностью, примерно сопоставимой с таковой у человека, что делает их наиболее выигрышными на фоне других организмов, позволяет экстраполировать полученные данные на человека (Духарев и др., 1988). Чаще других применяются сосна (Butorina, Evstratov, 1996; Micieta, Murin, 1997), многие виды из родов Larix, Abies, Picea (Muller, 1997). Среди лиственных древесных тест-объектов береза повислая выявлена как один из чувствительных видов для биоиндикации (Косиченко, 1989; Буторина, 2000).
Широкое использование видов хвойных древесных растений (в частности сосны обыкновенной) для целей биоиндикации антропогенного загрязнения окружающей среды обусловлено рядом причин.
Использование растений-биоиндикаторов для оценки состояния окружающей среды дает возможность получения интегральных характеристик реакции биоты на антропогенные воздействия и проведения скрининга мутагенности активности химических веществ (Шафикова, 1999).
Сосна обыкновенная широко используется в озеленении промышленных объектов и при создании санитарных зон. В природных сообществах сосна относится к эдификаторным видам, определяющим лицо фитоценоза и в существенной степени влияющим на жизнь других растений (Гераськин и др., 1996).
Влияние физических и химических свойств тяжелых металлов на уровень индуцируемого биологического эффекта
Изучению закономерностей индукции патогенетических эффектов у растений при действии тяжелых металлов (плотность которых больше 50 атомных единиц) в связи с оценкой устойчивости биоценозов к повышенным уровням содержания этих элементов в окружающей среде уделяется большое внимание как в отечественной, так и зарубежной литературе. Актуальность указанной проблемы обусловлена постоянно увеличивающимся техногенным влиянием на биосферу, одним из основных следствий которого является поступление в экосистемы избыточных концентраций ТМ.
Многочисленными исследованиями показано, что повышенные концентрации ТМ в окружающей среде могут приводить к малоспецифическим физиологическим и биохимическим изменениям. В качестве наиболее общих проявлений стресса, обусловленного избытком ТМ, выделяют (Гуральчук, 1994; Barcelo, 1990) изменение активности ферментов, повреждение мембран, гормональный дисбаланс, дефицит необходимых элементов, ингибирование фотосинтеза и т. д. В совокупности эти нарушения гомеостаза приводят к подавлению роста растений (Гуральчук, 1994). Именно поэтому изменение ростовых процессов служит надежным интегральным показателем фитотоксичности и используется во многих экспериментальных исследованиях в качестве маркера силы воздействия ионов металлов.
В настоящее время известно, что ТМ помимо токсического оказывают канцерогенный и мутагенный эффекты. Следует отметить, что до сих пор ряд вопросов, связанных с оценкой мутагенной активности тяжелых металлов, остается до конца не решенным. Бактериальные тесты, например, часто дают отрицательные результаты, а данные цитогенетического анализа клеток млекопитающих оказываются спорными (Пешева, 1997; Snow, 1992; Rossman, 1995; Nishioka, 1975). Наиболее адекватными при изучении мутагенеза, индуцированного ТМ, признаны (Steinkellner, 1998; Mukhopadhyay, 1990) цитогенетические тесты на растениях. Они дают мало заведомо ложных результатов и позволяют обнаружить ранние и в то же время наиболее серьезные последствия антропогенного воздействия, . усиливающееся мутагенное давление на биосферу, проявляющееся в увеличении генетического груза в популяциях и изменении видовой структуры биоценозов. Установление закономерностей индукции цитогенетических эффектов у растений при действии ТМ является важным этапом исследований, результаты которых необходимы для обоснования решений в природоохранной деятельности, сельском хозяйстве, медицине, а также социальной сфере.
Попытки поиска корреляционных связей токсичности с физическими и химическими свойствами металлов, предпринимаемые уже с конца XVIII в., позволили прийти к некоторым обобщениям (Кабата-Пендиас, 1989; Левина, 1972; Мецлер, 1980; Чекунова, 1986). Установлено, что важным свойством, определяющим биологическую эффективность ионов ТМ, является их способность к комплексообразованию. Константы образования хелатных комплексов зависят от заряда, радиуса, степени гидратации иона металла и формы его электронных орбиталей, участвующих в образовании ковалентной связи с хелатной группой, а также нуклеофильностью лиганда. Токсичность растворов солей металлов положительно коррелирует с электроотрицательностью, которая определяет способность металла вступать в химические реакции с образованием ионных или ковалентных связей. Важной характеристикой биологического действия ионов металлов является произведение растворимости их сульфидов. При этом более ядовитыми оказываются металлы, образующие наименее растворимые сульфиды. Эта закономерность представляет собой отражение двух взаимосвязанных явлений: особого сродства многих металлов к тиоловым (сульфгидрильным) группам, с одной стороны, и биологической роли SH-групп - с другой. Значение сульфгидрильных групп для нормального состояния белков, осуществления физиологических и биохимических процессов общеизвестно. При реакции ионов металлов с сульфгидрильными группами образуются нерастворимые, слабо диссоциирующие меркаптиды, что является причиной осаждения белков. Следует учитывать, что степень связывания металлов с тиоловыми группами весьма различна. Очень высокое сродство к SH-группам проявляют Hg, Cd, Ag, Au, Sb, Cu, Pb и As3+. Однако Al, Cr, Mn, W, Ba, Ca, Zr, Mg, Th не образуют прочных соединений с тиолами (Левина, 1972). Интересно отметить, что обусловливающее высокую токсичность свойство металлов образовывать нерастворимые соединения с сульфгидрильными группами лежит в то же время в основе механизма детоксикации этих элементов (Лебедева, 1998; Феник, 1995).
Важную роль физико-химических свойств в определении уровня биологической эффективности ионов металлов демонстрируют данные сравнительной оценки их токсичности, полученные разными авторами. При изучении влияния растворов солей металлов на корни проростков семян Allium сера L. (Довгалюк, 2001) сделан вывод, что по эффективным концентрациям (ЕС50) токсического действия соединения различаются следующим образом: CuS04 CdCl2 NiS04 Pb(CH3COO)2 A1(N03)3 ZnS04; по сублетальным (ECc,o) и летальным (частота клеток с пикнотическими ядрами) эффектам - C11SO4 CdCb РЬ(СНЗСОО)г ZnS04 NiS04 A1(N03)3. Оценка действия MnS04, Fe(S04)3, ZnS04, СЮ3 на меристемы корней чины душистой (Бессонова, 1991) позволило расположить ионы металлов в ряды по способности снижать интенсивность деления клеток (число клеток, образующихся из 1000 за 1 ч) - Cr Zn" Fe Mn и увеличивать длительности митоза и метафазы - Cr Mn Zn Fe . Предложен (Алексеева-Попова, 1991) и такой ряд токсичности элементов -Си Ni Cd Zn Pb Hg Fe Mo Mn. В последнее время были получены данные о сравнительной токсичности ионов металлов для разных видов растений: Lepidium sativum - Cr Си Cd Ni = Pb Zn Mn (Montvydiene, 2004); Spirodella polyrrhiza - Cd Си = Cr Ni Pb Mn Zn (Montvydiene, 2004); Lemna minor - Си Cr(VI) Cd Co (Ince, 1999); Lolium perrene - Си Ni Mn Pb Cd Zn Al Hg Cr Fe (Montvydiene, 2004); Panicum miliaceum - Си Ni Cd Cr(VI) Zn Mn (Montvydiene, 2004); Sinapis alba - Cu2+ Mo042" Ni2+ Mn2+ V043" (Fasulo, 1983). Установлено (Munzuroglu, 2002), что способность ТМ снижать всхожесть семян уменьшается для Triticum aestivum в ряду Hg Cd Си Pb Со Zn, а в случае Cucamiis sativus - Hg Си Cd Pb Zn Co. При этом по замедлению роста корней, колеоптиля и гипокотиля обоих указанных растений металлы расположены в ряд - Hg Си Cd Со Pb Zn.
Из приведенных данных видно, что независимо от вида растений и выбранного тест-критерия, Си" (за редким исключением) при одинаковом с Cd" , Ni" , Pb , Zn заряде иона оказывается токсичнее, поскольку имеет наивысшую из перечисленных элементов плотность заряда, и, следовательно, в большей степени проявляет акцепторные свойства.
Электроотрицательность свободных ионов меди, равная 65,88 эв/А (Годовиков, 1977), превосходит эту величину для Cd , Ni , Pb , Zn" , что обусловливает высокую способность Си"+ оттягивать электроны, обобществляемые при образовании химической связи, и образовывать устойчивые комплексы с различными биологически важными соединениями, например, аминокислотами. Крайне низкая растворимость меркаптидов меди (Годовиков, 1977) также выдвигает ее на первое место по токсичности среди указанных ионов металлов.
Уровень и спектр патологий митоза
Нарушения митоза, связанные с повреждением хромосом, встречаются при более высоких дозах загрязнителя, и критерий является менее чувствительным, чем иные. Также патологические митозы, как правило, имеют место в пролиферирующих тканях у всех организмов как следствие влияния внутриклеточных метаболитов, возникающих в ходе обменных процессов. Однако патологии митоза один из способов возникновения мутаций.
Данные, представленные в таблице 2, свидетельствуют о том, что по числу патологий митоза (ПМ) ситуация у потомства сосны обыкновенной из Усманского бора достаточно благополучная. В 2006 году максимальное значение ПМ в выборках составило 3,2%, а для выборок 2007 года - 2,9% и 3,4% для 2008 года, что находится в пределах нормы у сосны, то есть в пределах показателей спонтанного мутационного процесса. Среднее значение ПМ (рис. 4) по выборкам: от 1,1±0,2% до 1,2±0,1% (2006), от 1,4±0,2% до 1,5±0,1% (2007) и от 1,4±0,1% до 1,6±0,2% (2008).
Нарушение нормального течения митоза может стать источником геномных мутаций и хромосомных аберраций (Алов, 1965). Это один из основных механизмов возникновения анеуплоидии и нарастания гетерогенности клеточных популяций. По частоте встречаемости нарушений митоза можно судить об интенсивности мутационного процесса в клеточных популяциях организма, по спектру нарушений - о степени повреждения генетического материала, т. е. совместимости с жизнью возникающих повреждений (Буторина и др., 2001). Низкое число ПМ у сосны из Усманского бора позволяет предположить проявление у нее высокой репарационной способности. Спектр ПМ включал забегания и отставания хромосом в анафазе митоза, мосты в анафазе и телофазе, то есть наиболее общие типы митотических нарушений (рис. 5). Также были посчитаны доли каждого нарушения от общего числа патологий (рис. 6).
В.М. Захаров с соавторами (Здоровье среды...,2000) предлагает свою балльную оценку для получения интегральной характеристики цитогенетического гомеостаза, определяемую следующим способом:
-первый балл - условно нормальное состояние - частота аберрантных клеток до 3,5%;
-второй балл - низкая степень отклонений - частота аберрантных клеток в пределах 3,5-6%;
-третий балл - средняя степень отклонений - частота аберрантных клеток в пределах 6-9%;
-четвертый балл - высокая степень отклонений - частота аберрантных клеток в пределах 9-12%;
-пятый балл - критическое состояние - частота аберрантных клеток выше 12%.
Полученные нами показатели в соответствии с этой шкалой оценки укладываются в 1 балл.
Проведенное сравнение выборок по Х-критерию Ван-дер-Вардена выявило (при Р 0,05):
1. Отсутствие различий между выборками 134-го квартала, что позволяет их объединить и рассчитать их среднее (в 2006, в 2007 и в 2008 гг. соответственно).
2. Отсутствие различий между средним выборок 134-го квартала и выборкой 122-го квартала (в каждом году исследования соответственно).
3. Наличие различий между средними выборок 134-го и 122-го кварталов 2006, 2007 и 2008 гг. соответственно при их сравнении между собой. Это может свидетельствовать о разных погодных условиях в эти годы.
Сравнительный анализ воздействия тяжелых металлов на цитогенетические показатели сосны обыкновенной
Митотическая активность
Показатели митотического индекса (МИ) в семенном потомстве опытных вариантов достоверно снижались при действии всех солей ТМ в сравнении с контролем (рис. 25). Однако снижение во всех случаях не превышало 1,5% и индекс МИ находился в узком коридоре 6,0-6,7%. При сравнении опытных вариантов между собой различия наблюдались только в крайних концентрациях. Это незначительное снижение не является следствием отсутствия токсического эффекта ввиду того, что происходит задержка митоза на разных стадиях, а также можно утверждать о способности данных солей проявлять свойства фиксатора.
Динамика средних значений МИ в зависимости от концентрации выбранных солей (нитратов свинца, цинка, меди и калия) в сравнении с контролем
При сравнении частоты встречаемости клеток, находящихся на различных стадиях митоза, выявлено, что в условиях стресса (опытные варианты) происходит рост доли клеток на стадии метафазы и перехода метафаза-анафаза (мета-анафаза) по сравнению с контролем (рис. 26, 27).
Указанные эффекты связывают с изменением времени формирования веретена деления и блокированием процессов расхождения хромосом к полюсам и цитокинеза (повреждение веретена деления и затруднение процессов прохождения цитотомии) (Казанцева, 1981). Аналогичные явления были выявлены у семенного потомства березы повислой и дуба черешчатого на территориях, подвергшихся радиоактивному загрязнению в результате аварии на Чернобыльской АЭС (Artyukhov, Kalaev, 2006).
Заметное ингибирование митоза, проявляющееся в сильном увеличении доли клеток в первую очередь на стадии мета-анафазы, может быть следствием блокировки полимеризации тубулина микротрубочек веретена деления. Так, было установлено, что соединения свинца взаимодействуют с 2 из 18 тиоловых групп тубулиновых димеров как неполимеризованных микротрубочек, так и уже образовавшихся (The molecular mechanism.., 1984). Также ингибирующее действие ТМ проявляется и на ферменты репарации ДНК, подтверждением чего служит высокий уровень и спектр патологических митозов (Ильинских, 1992; Rieder, 1992; Interaction of metal..., 2003), а в наших экспериментах - существенное увеличение доли клеток с фрагментами и микроядрами.
Изменение времени прохождения клетками фаз митоза может быть связано с активацией системы checkpoint (проверки целостности генетического материала), действием механизмов checkpoint-репарации. Известно, что продукты checkpoint-генов сканируют целостность ДЬЖ и способствуют задержке клеточного цикла в случае обнаружения повреждения. К критическим стадиям клеточного цикла (в которых происходит его временная остановка) относят переход клетки от Gi к S-стадии, от G2 к митозу и от метафазы к анафазе (точка проверки целостности генетического материала — mid-anaphase-checkpoint) (Епифанова, 2003; Омельянчук и др., 2004). Так, в точке контроля перехода метафаза-анафаза осуществляется проверка правильности сборки веретена и прикрепления хромосом к нему, состояние кинетохоров, что обеспечивает правильную сегрегацию хромосом. При обнаружении слабых дефектов («ошибок») включается система ликвидации повреждений ДНК и восстановления ее исходной структуры. Если же повреждения ДЬЖ значительны и их исправление не происходит, клетка либо самоуничтожается с помощью процесса апоптоза, либо вступает далее в аберрантное деление (Закономерности индукции цитогенетических эффектов.., 2005). Поэтому «точки контроля» клеточного цикла представляют собой механизм, который предохраняет делящиеся клетки от летального митоза. Это дает основание рассматривать изменение времени прохождения клетками стадий митоза, в первую очередь перехода метафаза-анафаза, как механизм адаптации к стрессовым факторам (солям ТМ) и поддержания гомеостаза клеточной популяции у проростков семян сосны обыкновенной.
Также полученные данные (МИ, доли клеток на стадиях митоза) влияния одинаковых концентраций различных солей ТМ позволяет судить о токсичности выбранных металлов. Так как снижение МИ приблизительно одинаково (рис. 25) для всех солей ТМ, то основополагающим критерием является доля клеток на стадии мета-анафазы, с максимальными значениями у нитрата меди (рис.26). Эти данные подтверждаются еще и результатами всхожести семян сосны обыкновенной (рис. 23). Поэтому среди выбранных металлов наиболее токсичный - медь. При сравнении цинка и свинца, на второе место следует отнести свинец, т. к. он в большей степени вызывал задержку митоза (судя по доле клеток на стадии мета-анафазы) и снижал всхожесть семян в сравнении с контролем, тогда как цинк наоборот увеличивал ее (рис. 23). Свинец занимает промежуточное положение.
Дисперсионный анализ
По результатам цитогенетических исследований проростков семян сосны обыкновенной проведен дисперсионный анализ. Затем посчитаны доли силы влияния различных факторов на цитогенетические показатели по Снедекору (Лакин, 1990; Кулаичев, 2006). По методу Плохинского получены аналогичные данные, поэтому они не приводятся.
Дисперсионный анализ цитогенетических данных между опытными выборками воздействия ТМ в различных концентрациях на проростки сосны, проведенный без учета контрольных значений, показывает достоверное (Р 0,001) влияние фактора концентрации ТМ (от 87,4 до 90%), фактора типа ТМ (7,8-10%) и не во всех случаях их совместного действия (4,8%) (рис. 28).
Максимальные (до 90%) значения влияния фактора концентрации ожидаемы ввиду большого размаха выбранных концентраций (от 0,5 до 2000 мкМ), среди которых есть даже не оказывающие достоверного воздействия на цитогенетические показатели. Также можно сделать вывод о меньшей чувствительности показателя МИ при сравнении воздействия различных ТМ на сосну обыкновенную (отсутствие достоверных различий совместного действия факторов концентрации и типа ТМ).
