Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1.1 Основные закономерности процесса экзотрофии у рыб с позиций современной парадигмы питания 9
1.2 Характеристика различных звеньев экзотрофии у рыб разных экологических групп 10
1.2.1 Спектр питания рыб разных экологических групп 10
1.2.2 Особенности пищевого поведения рыб разных экологических групп 12
1.2.3 Морфологические особенности пищеварительной системы рыб, различающихся по характеру питания 12
1.2.4 Особенности переваривания белковых компонентов пищи у рыб разных экологических групп 16
1.3 Влияние метаболитов и гормонов на пищевое поведение рыб 17
1.3.1 Влияние метаболитов на пищевое поведение 18
1.3.2 Влияние гормонов на пищевое поведение рыб 24
1.4 Влияние тяжелых металлов на процесс экзотрофии у рыб 31
1.4.1 Краткая характеристика тяжелых металлов и их влияние на организм рыб 32
1.4.2 Влияние тяжелых металлов на пищевое поведение рыб 43
1.4.3 Роль сенсорных систем в реализации эффектов тяжелых металлов 45
1.4.4 Влияние тяжелых металлов на процесс пищеварения у рыб 47
1.5 Заключение 48
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 50
2.1 Характеристика исследованных видов рыб 50
2.2 Методы исследования 53
2.2.1 Метод изучения скорости пищевой реакции рыб 53
2.2.2 Схема экспериментов 54
2,2.3 Определение активности протеин аз слизистой оболочки желудка и кишечника рыб 57
2.4 Статистическая обработка материала 59
ГЛАВА 3. ВЛИЯНИЕ ЦИНКА И МЕДИ НА СКОРОСТЬ ПИЩЕВОЙ РЕАКЦИИ КАРПА 60
3.1 Влияние различных концентраций цинка и меди на скорость пищевой реакции карпа 60
3.1.1 Влияние различных концентраций цинка на скорость пищевой реакции карпа 60
3.1.2 Влияние различных концентраций меди на скорость пищевой реакции карпа 62
3.2 Заключение 65
ГЛАВА 4. РАЗДЕЛЬНОЕ И СОЧЕТАННОЕ ВЛИЯНИЕ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ, АДРЕНАЛИНА И УТИЛИЗОНОВ НА СКОРОСТЬ ПИЩЕВОЙ РЕАКЦИИ КАРПА 66
4.1.1 Влияние адреналина на скорость пищевой реакции карпа 66
4.1.2 Сочетанное влияние тяжелых металлов и адреналина на скорость пищевой реакции карпа 67
4.2 Раздельное и сочетанное влияние адреналина и утилизонов (глюкозы и глутамата натрия) на скорость пищевой реакции карпа 70
4.3 Раздельное и сочетанное влияние тяжелых металлов, адреналина и утилизинов на скорость пищевой реакции карпа 74
4.3.1 Раздельное и сочетанное влияние тяжелых металлов и глюкозы на скорость пищевой реакции карпа 74
4.3.2 Раздельное и сочетанное влияние тяжелых металлов и глутамата натрия на скорость пищевой реакции карпа 75
4.3.3 Сочетанное влияние тяжелых металлов, адреналина и утилизонов на скорость пищевой реакции карпа 76
4.4 Заключение 86
4 ГЛАВА 5. ВЛИЯНИЕ ЦИНКА И МЕДИ НА АКТИВНОСТЬ ПРОТЕИНАЗ ПИЩЕВАРИТЕЛЬНОГО ТРАКТА РЫБ РАЗНЫХ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ ГРУПП 85
5.1 Влияние цинка и меди на протеолитическую активность слизистой оболочки желудка типичных и факультативных ихтиофагов 87
5.2. Влияние цинка и меди на протеолитическую активность слизистой оболочки кишечника типичных и факультативных ихтиофагов 87
5.3Влияние цинка и меди на протеолитическую активность слизистой оболочки кишечника бенто- и планктофагов 90
5.4 Заключение 95
ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ 96
ВЫВОДЫ 98
СПИСОК ЛИТЕРЕТУРЫ 101
ПРИЛОЖЕНИЕ 132
- Основные закономерности процесса экзотрофии у рыб с позиций современной парадигмы питания
- Характеристика исследованных видов рыб
- Влияние различных концентраций цинка и меди на скорость пищевой реакции карпа
- Влияние адреналина на скорость пищевой реакции карпа
- Влияние цинка и меди на протеолитическую активность слизистой оболочки желудка типичных и факультативных ихтиофагов
Введение к работе
Одной из острейших проблем современности является антропогенное воздействие на гидросферу. Среди антропогенных факторов наибольшую опасность представляет химическое загрязнение. Тяжелые металлы рассматриваются, как приоритетные химические поллютанты, представляющие особую опасность для организмов и биоценозов, вследствие того, что многие из них обладают биологической активностью, способны аккумулироваться в тканях различных организмов, не подвергаются биодеградации и крайне медленно покидают биологический цикл (Строганов, 1968; Лукьяненко, 1983; Алабастер, Ллойд, 1984; Линник, Набиванец, 1986; Мур, Рамамурти, 1987; Решетников, Шатуновский, 1997; Моисеенко, 1999; Кашулин, Терентьев, 2004; Комов и др., 2004). Также известно, что устойчивость водных экосистем в значительной мере зависит от эффективности трофических взаимоотношений гидробионтов, которые включают как сложный комплекс процессов экзотрофии консументов, так и систему защитных реакций потенциальных жертв (Одум, 1986 б; Поддубный, 1971; Никольский, 1974). При этом токсичные отходы производства и антропргенный стресс являются лимитирующими факторами для различных экосистем (Одум, 1986 а).
Согласно данным, известным из литературы, тяжелые металлы оказывают влияние на морфологию, биохимические и физиологические процессы, а также поведение, влияющие на питание, размножение, развитие, рост, выживаемость и динамику численности популяции (Лукьяненко, 1983; Матей, 1996; Микряков и др., 2001; Остроумова, 2001; Немова, Высоцкая, 2004; Немова, 2005). Есть сведения о влиянии некоторых тяжелых металлов на пищевое поведение (Герасимов и др., 1991; Симонавичене, 1991; Касумян, Морси, 1998; Woo et al., 1993) и пищеварение (Sastry, Gupta, 1979; Golovanova et al., 1994, 1999; Kuz'mina et al., 1999, 2002; Неваленный и др., 2001, 2003; Туктаров, 2002; Голованова, Комов, 2003; Неваленный, Бедняков, 2004). В ряде работ показано, что пищевое поведение рыб, как и у высших позвоночных животных, контролируется различными нейро-гуморальными, в том числе гормональными факторами (Peter, 1997; Le Bail, Boeuf, 1998; de Pedro, Bjornsson, 2001; Buddington, Krogdahl, 2004; Кузьмина, 2005 а, б) и утилизонами (Кузьмина, 1966; Delicio, Vicentini-Paulino, 1993; Кузьмина, Гарина, 2001; Xie et al., 2003; Кузьмина и др., 2002, 2003; Гарина, 2005; Kim et al., 2005). Также известно, что тяжелые металлы вызывают стресс-реакцию (Berntssen et al., 1999), одним из компонентов которой является увеличение уровня катехоламинов, в частности адреналина (Wendelaar, Sjoerd, 1997; Запруднова, Прозоровская, 1999).
Вместе с тем нет сведений, касающихся влияния тяжелых металлов на весь процесс экзотрофии у рыб одного и того же вида. Также не известно о зависимости пищевого поведения рыб от соотношения различных эндогенных и экзогенных (природных или антропогенных) факторов. Поскольку функционирование экосистем и продуктивность водоемов в значительной мере зависят от трофических взаимоотношений, не вызывает сомнения необходимость изучения влияния антропогенных факторов, в том числе тяжелых металлов, на различные этапы экзотрофии рыб.
Цель работы: изучение раздельного и сочетанного влияния тяжелых металлов (цинк, медь), гормонов (адреналин) и утилизонов (глюкоза, глутамат натрия), обладающих сигнальными эффектами, на начальный этап экзотрофии (пищевое поведение), а также их действие на промежуточный (пищеварение) этап экзотрофии у карпа Cyprinus carpio L. и для сравнения у 7 массовых видов пресноводных костистых рыб, различающихся по характеру питания.
Задачи исследования:
1. Изучить влияние различных концентраций тяжелых металлов (цинк, медь) на скорость пищевой реакции рыб (на примере карпа).
2. Изучить раздельное и сочетанное влияние адреналина, утилизонов (глюкоза, глутамат натрия) и тяжелых металлов (цинк, медь) на скорость пищевой реакции рыб (на примере карпа).
3. Изучить влияние цинка и меди на активность протеиназ пищеварительного тракта рыб (карп, лещ, плотва, карась, щука, налим, окунь, судак), значительно различающихся по характеру питания.
Научная новизна: Большая часть данных, касающихся влияния меди и цинка на процесс экзотрофии у рыб, в представленной работе получена впервые. Впервые изучены и сопоставлены эффекты раздельного и сочетанного влияния адреналина и утилизонов (глюкозы или глутамата натрия), адреналина и тяжелых металлов (цинк, медь), утилизонов и тяжелых металлов, а также сочетанное действие всех указанных факторов на скорость пищевой реакции рыб (на примере карпа). Впервые в идентичных методических условиях изучено влияние различных концентраций цинка и меди на активность казеин- и гемоглобинлитических протеиназ пищеварительного тракта у пресноводных костистых рыб, различающихся по типу питания. Впервые в рамках одной работы на примере карпа сопоставлено влияние цинка и меди на начальное и центральное звенья процесса экзотрофии у рыб.
Теоретическая и практическая значимость работы: Исследование влияния таких биогенных металлов, как цинк и медь, на реализацию рыбами сложного процесса экзотрофии, необходимо для анализа закономерностей функционирования сообществ водных организмов в условиях антропогенного стресса, а также понимания механизмов негативного воздействия тяжелых металлов на пищевое поведение и процессы пищеварения у рыб, что важно не только для решения указанных фундаментальных проблем, но и для дальнейшей разработки методов управления поведением рыб, а также создания рецептуры новых кормов и оптимизации кормления в условиях аквакультуры.
Защищаемые положения:
Медь и цинк оказывают негативное влияние на пищевое поведение рыб, степень которого зависит от их концентрации и времени воздействия.
При одной и той же концентрации и времени экспозиции медь, как правило, оказывает более выраженное негативное действие на скорость пищевой реакции карпа, чем цинк.
Степень влияния меди и цинка на скорость пищевой реакции рыб зависит от уровня метаболитов (глюкозы и глутамата натрия) и гормонов (адреналина) в их организме. Глюкоза, глутамат натрия и низкие дозы адреналина снижают отрицательное действие металлов на пищевую реакцию рыб.
Степень негативного влияния меди и цинка на активность протеиназ, функционирующих в желудке и кишечнике рыб, различна. Активность аспартильных (карбоксильных) протеиназ слизистой оболочки желудка в присутствии меди и цинка снижается в меньшей степени, чем активность сериновых протеиназ, функционирующих в кишечнике.
Публикации: По теме диссертации опубликовано 8 статей и 5 тезисов.
Апробация работы: Материалы были представлены и доложены на Международной конференции «Биологические ресурсы Белого моря и внутренних водоемов Европейского Севера» (Сыктывкар, 2003, Вологда, 2005); Международной конференции «Fisheries, aquaculture and environment» (Lattakia, Syria, 2003); Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы патологии, иммунологии и охраны здоровья рыб и других гидробионтов». (Борок, 2003). Международной конференции «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов» (Петрозаводск, 2004); Всероссийской научно-практической конференции «Экологические проблемы уникальных природных и антропогенных ландшафтов» (Ярославль, 2004); Международной научной конференции «Проблемы естественного и искусственного воспроизводства рыб в морских и пресноводных водоемов» (Ростов-на-Дону, 2004); Международной конференции «Современные проблемы водной токсикологии» (Борок. 2005); Международной конференции «Поведение рыб» (Борок, 2005).
Основные закономерности процесса экзотрофии у рыб с позиций современной парадигмы питания
Экзотрофия - совокупность процессов, обеспечивающих ассимиляцию пищевых объектов, включает три основных этапа: питание, пищеварение и всасывание (Уголев, 1985). Потребление пищи - одна из важнейших сторон жизнедеятельности организма, включающая ряд сложных поведенческих актов, которые определяются функционированием различных отделов мозга {«пищевого центра»), на основании сигналов из внешней и внутренней среды (Кассиль, 1990). Пищеварение, обеспечивающее начальные этапы ассимиляции пищи, занимает центральное место в процессах экзотрофии (Уголев, 1985).
Взгляды на процессы экзотрофии в XX в. претерпели серьезные изменения. Известно 3 парадигмы физиологии питания - античная, классическая и современная (Уголев, 1985, 1987). Согласно античной парадигме питания, пища в пищеварительном тракте в результате сложных процессов неизвестной природы преобразуется в кровь, которая обеспечивает питание всего организма. В конце XVIII в. начала формироваться классическая парадигма питания. В рамках этой парадигмы была сформулирована теория сбалансированного питания, основным постулатом которой было предположение о необходимости поддерживать при помощи питания молекулярный состав организма. Благодаря этой теории были разработаны рационы питания, а также представления об «идеальной» пище. Однако практика показала, что ряд практических рекомендаций, в частности необходимость снижение в пище количества балластных веществ, вызывает так называемые «болезни цивилизации» (Петровский, 1982; Уголев, 1985).
Характеристика исследованных видов рыб
Работа проведена в лаборатории экологии рыб Института биологии внутренних вод им И. Д. Папанина в течение 2003-2005 гг. Материал собран в Рыбинском водохранилище и его притоков, а также в прибрежных прудах.
Объектами исследования были 8 видов рыб, относящихся к типу Позвоночные Vertebrata, группе Рыбы Pisces, кл. Костные рыбы Osteichthyes, п/кл Лучеперые Actinopterygii, 4 отрядам и 4 семействам {Никольский, 1954; Решетников, 1998).
Отр. Salmoniformes - лососеобразные, п/отр. Esocoidei, сем. Esocidae -щуковые, Esox lucius L. - обыкновенная щука. Отр. Cypriniformes -карпообразные, сем. Cyprinidae - карповые, Cyprinus carpio L. - карп, Abramis brama (L.) - лещ, Rutilus rutilus (L.) - плотва, Carassim carassuis (L.) - карась обыкновенный; отр. Gadiformes - трескообразные, сем. Lotidae -налимовые, Lota lota (L.) - налим; отр. Perciformes - окунеобразные, п/отр. Percoidei, сем. Percidae - окуневые, Perca fluviatilis L. - речной окунь, Stizostedion lucioperca (L.) - обыкновенный судак.
Ниже приведена краткая характеристика биологии исследованных видов рыб, основанная на работах Г. В. Никольского (1954), Е. Н. Фортунатовой и О. А. Поповой (1973), М. И. Ивановой и соавторов (1978), А. Г. Поддубного (Поддубный, 1971; Poddubny, Galat, 1995), П. И. Жукова (1988) и Ю.С.Решетникова(1998).
Обыкновенная щука населяет озера и медленно текущие реки. Молодь щуки после резорбции желточного мешка питается планктоном. По достижении 4-5 см переходит на питание более крупными объектами, в частности молодью рыб. По типу питания щука является типичным ихтиофагом. В Рыбинском водохранилище главными кормовыми объектами щуки являются плотва, окунь, ерш и уклея. В течение года щука питается с различной интенсивностью. Наиболее высокая интенсивность питания -сразу после нереста. В период весеннего нагула в течение короткого периода щука может потреблять до 88% от общего количества плотвы, съедаемой за год.
Влияние различных концентраций цинка и меди на скорость пищевой реакции карпа
Для определения казеинлитической активности слизистой оболочки кишечника (преимущественно трипсин, КФ 3.4.21.4) использовали 1% раствор казеина (рН 7.4). Количество продуктов реакции определяли при помощи фотоэлектроколориметра КФК-2 (длина волны 670 нм). Активность ферментов в суммарных пробах слизистой оболочки 5-7 рыб определяли в 5-ти повторностях для каждой точки с учетом фона (количество соответствующих компонентов в исходном гомогенате).
В каждую пробирку, служащую контролем опыта, приливали 0.25 мл раствора Рингера и 0.25 мл гомогената при непрерывном перемешивании. Затем содержимое пробирок инкубировали при температуре 20±1С в течение 1 ч, после чего приливали 0.5 мл субстрата и инкубировали еще в течение 30 мин при тех же условиях и непрерывном перемешивании для лучшего контакта фермента с субстратом. После этого во все пробирки приливали 1 мл ТХУ, а в пробы, служащие контролем метода, кроме этого 0.5 мл гомогената. Пробирки выдерживали при той же температуре в течение 1 часа. Пробы фильтровали через бумажные фильтры в течение 5-10 мин. Затем к 0.25 мл фильтрата приливали 0.25 мл CuS04, 2 мл NaOH и 0.75 мл реактива Фолина-Чиокальтеу (приложение, табл. 1). Пробирки с содержимым оставляли на 40 мин под тягой для развития окраски. Через 40 мин пробы просматривали на фотоэлектрокол ори метре. Для оценки влияния цинка и меди на активность пищеварительных гидролаз в пробирки приливали 0.25 мл раствора соли тяжелого металла (CuS04 5H20 или ZnS04-7H20) в широком диапазоне концентраций (0.1, 1, 10, 25 и 50 мг/л, в расчете на содержание ионов металла) и 0.25 мл гомогената. Содержимое пробирок инкубировали при той же температуре в течение 1 ч при непрерывном перемешивании. Последующие процедуры были аналогичны опысанным для контроля опыта.
Как известно, высокие концентрации тяжелых металлов вызывают у рыб стресс (Berntssen et al., 1999), одним из компонентов которого является увеличение уровня катехоламинов, в частности адреналина (Wendelaar, Sjoerd, 1997; Запруднова, Прозоровская, 1999). В связи с этим важно было исследовать вляиние тяжелых металлов на ЛВП, опосредованное различным уровнем адреналина, характерным как для спокойного состояния (0.14 и 0.7 мг/кг), так и для состояния стресса (1.4 мг/кг).
Влияние цинка и меди на протеолитическую активность слизистой оболочки желудка типичных и факультативных ихтиофагов
Гемоглобинлитическая активность протеиназ слизистой оболочки желудка в отсутствие ТМ у разных видов ихтиофагов различна (рис. 17, табл. 5 приложения). Максимальная активность обнаружена у налима, несколько меньшая - у судака и щуки, минимальная - у окуня. Степень воздействия цинка и меди на протеиназы желудка также различна. Наиболее подвержены воздействию исследуемых металлов протеиназы окуня. Так, в присутствии цинка (50 мг/л) гемоглобинлитическая активность протеиназ слизистой оболочки желудка окуня снижается на 26%, под действием меди в той же концентрации на 58% по сравнению с контролем. У других видов рыб эффект выражен слабее - снижение исследуемого показателя не превышает 11 - 23%. При этом, как правило, не прослеживается зависимость эффекта от концентрации металлов.
