Содержание к диссертации
Введение
Глава I Литературный обзор 11
1. Общая характеристика иммунной системы рыб 11
1.1. Им му некомпетентные клетки, ткани и органы рыб 13
1.2. Особенности структурно-функциональной организации иммунной системы осетровых рыб 18
1.3. Механизмы неспецифического иммунитета у рыб 20
1.4. Кровь 22
1.4.1. Составляющие гуморального звена иммунитета. Гуморальные факторы врожденного иммунитета 23
1.4.2. Специфические факторы гуморального иммунитета 28
1.4.3. Клеточные факторы иммунитета. Характеристика лейкоцитов рыб 30
1.4.4. Состав и соотношение лейкоцитов крови в зависимости от вида, возраста, физиологического состояния рыб и сезона года 35
1.5. Становление иммунной системы рыб в онтогенезе 38
2. Влияние токсических соединений на иммунный статус рыб 41
2.1. Соли тяжелых металлов 42
2.1.1. Ртуть 43
2.1.2. Кадмий 45
2.1.3. Медь 48
2.2. Пестициды 52
Заключение 57
Глава П. Материалы и методы исследования 58
1. Объекты исследования и условия проведения экспериментов 58
1.1. Схема постановки опыта по изучению эффекта сублетальных концентраций Hg, Си и Cd на молодь осетра 58
1.2. Схема постановки опыта по определению влияния соли кадмия на иммунофизиологический статус карпа 59
1.3. Условия проведения эксперимента по изучению изменения протективных свойств тканей личинок плотвы при действии ионов кадмия 60
1.4. Схема постановки опыта по исследованию эффекта различных концентраций карбофоса на иммунофизиологическое состояние карпа
при непродолжительных экспозициях 61
1.5. Схема постановки опыта по определению влияния карбофоса на иммунитет к бактериальному антигену в хроническом эксперименте 62
2. Методы исследований 62
2.1. Отбор проб, приготовление экстрактов тканей 65
2.2. Определение морфофизиологических показателей: индексы органов, коэффициент упитанности, общий белок сыворотки крови 68
2.3. Определение показателей гуморального звена иммунитета: концентрация лизоцима, анализ бактериостатической активности сыворотки крови 69
2.4. Методы изучения состава лейкоцитов периферической крови: определение лейкоцитарной формулы крови, подсчет индекса обилия лейкоцитов 70
2.5. Определение средних полулетальных концентраций токсикантов 71
2.6. Статистическая обработка материала 72
Результаты исследований
Глава III. Влияние ионов тяжелых металлов на молодь разных видов рыб
1. Реакция иммунофизиологических показателей молоди осетра на экспозицию в сублетальных концентрациях ионов Hg, Си и Cd 73
1.1. Морфофизиологические показатели 73
1.2. Показатели гуморального звена иммунитета 78
1.3. Лейкоциты крови 85
2. Влияние ионов кадмия на иммунофизиологическое состояние карпа 93
2.1. Морфофизиологические показатели 93
2.2. Показатели гуморального звена иммунитета 97
2.3. Лейкоциты крови 100
3. Исследование действия ионов кадмия на протективные свойства тканей личинок плотвы 104
3.1 Методические подходы к анализу антимикробных свойств экстрактов тканей 104
3.2. Влияние различных концентраций ионов кадмия
на бактериостатические свойства личинок плотвы 107
Глава IV. Реакция иммунофизиологических показателей карпа на присутствие карбофоса
1. Влияние различных концентраций карбофоса на иммунофизиологическое состояние карпа 111
1.1. Морфофизиологические показатели 111
1.2. Показатели гуморального звена иммунитета 115
1.3. Лейкоциты крови 118 2. Анализ влияния карбофоса на иммунитет к бактериальному антигену в хроническом эксперименте 123
2.1. Морфофизиологические показатели 123
2.2. Показатели гуморального звена иммунитета 127
2.3. Лейкоциты крови 129
Глава V. Обсуждение результатов и выводы 135
Список литературы 156
- Механизмы неспецифического иммунитета у рыб
- Определение морфофизиологических показателей: индексы органов, коэффициент упитанности, общий белок сыворотки крови
- Показатели гуморального звена иммунитета
Введение к работе
Широкое применение разнообразных средств защиты в сельском хозяйстве, недостаточная очистка сточных вод промышленных и коммунально-бытовых предприятий приводит к возрастающему загрязнению водоемов рыбохозяйственного назначения токсичными для гидробионтов соединениями. Среди огромного количества поллютантов наибольшую опасность для водных организмов представляют тяжелые металлы. Их глобальное распространение в гидросфере и высокая токсичность для водных организмов и, в частности, рыб, делают изучение этих веществ особенно актуальным (Sorensen, 1992; Перевозников, Пономаренко, 1991; 1999; Кашулин и др., 1999). Важное место среди соединений, также приводящих к снижению численности, адаптивного потенциала и напряженности естественного иммунитета к паразитам, вызывающим инфекционные и инвазионные заболевания рыб, занимают пестициды.
Как известно, важная роль в реализации процессов адаптации рыб к биотическим и абиотическим факторам среды и сохранении индивидуальной целостности организма на разных этапах онтогенеза, формировании устойчивости к паразитам принадлежит иммунной системе (Вольский, 1991; Маянский, 1991; Микряков, 1991). Несмотря на возросший интерес к исследованию вопросов иммунитета рыб к паразитам (Вихмап, 1978; Anderson, 1974; 1989), проблемы структурно-функциональной организации иммунной
6 системы в фило- и онтогенезе, характера реагирования ее на возмущающие факторы среды, слабо разработаны, это особенно касается молоди рыб. Между тем известно, что рыбы на ранних этапах развития наиболее чувствительны к воздействию токсических факторов среды, они более подвержены массовой гибели от инфекций и инвазий при воздействии на них загрязняющих веществ (Вирбицкас и др., 2000).
Для рыб вообще характерно доминирование неспецифических факторов защиты, обладающих большим разнообразием и быстротой активации, а на ранних этапах онтогенеза они являются определяющими (Кондратьева, Киташова, 2002; Studnicka at al., 1993; Anderson, Zeeman, 1995). Исследование нсспецифических механизмов реакции иммунной системы рыб, обеспечивающей защиту от инфекций и сохранение индивидуальной целостности организма на ранних этапах онтогенеза, имеет как теоретический, так и практический интерес при определении роли иммунной системы в реализации процессов адаптации к токсическим и биотическим факторам, при оценке причин снижения напряженности естественного иммунитета в колеблющихся условиях среды и разработке проблем биотестирования, определения нормы и патологии и т.д. (Макарская и др., 2001 )
Исходя из вышеизложенного, нами проведено комплексное исследование реакции неспецифических факторов иммунитета молоди рыб на воздействие солями тяжелых металлов (на примере осетра, карпа и плотвы) и
7 пестицидами (на примере карпа) в условиях подострого и хронического экспериментов.
Актуальность, практическая ценность. Исследования, посвященные действию различных техногенных факторов на живые организмы, являются в настоящее время приоритетными во всем мире. Весьма актуально изучение данной проблемы на рыбах, являющихся, с одной стороны, конечным звеном трофической цепи водных биоценозов, и одним из основных продуктов питания человека, с другой. Оценка состояния неспецифических факторов иммунной системы молоди рыб в условиях нарастающего ухудшения среды обитания помимо теоретической важности представляет большой практический интерес. Исследования в данной области позволяют оценить состояние здоровья и прогнозировать численность рыбных популяций в естественных водоемах, оптимизировать технологические процессы в условиях искусственного рыборазведения, а также разрабатывать тесты для проведения мониторинговых работ. Данных же по этой проблеме явно недостаточно, что отчасти вызвано методическими сложностями, возникающими при работе на молоди рыб. Слабо изучен гуморальный ответ иеспецифического звена иммунитета на действие токсических веществ, отсутствуют данные о взаимосвязи показателей, отражающих напряженность врожденного иммунитета.
Целью работы являлось изучение иммунофизиологического состояния молоди рыб при воздействии ряда приоритетных загрязнителей на основе анализа реакции клеточного и гуморального звеньев неспецифического иммунитета и ряда морфофизиологических показателей.
В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:
1. Изучить влияние сублетальных концентраций ионов Hg2+, Cu2+ и Cd +на иммунофизиологический статус молоди осетра и Cd2+ на карпа.
2. Исследовать характер изменений протективных свойств тканей личинок плотвы после экспозиции их в растворе ионов кадмия.
3. Сравнить влияние различных концентраций карбофоса на карпа при непродолжительных экспозициях и проанализировать процесс восстановления показателей после прекращения воздействия.
4. Оценить влияние карбофоса на развитие иммунного отклика к бактериальному антигену у карпа в хроническом эксперименте.
Научная новизна работы. На основе комплексного анализа реакции клеточного и гуморального звеньев иммунитета получены новые данные об общих закономерностях функционирования иммунной системы разных видов рыб на ранних этапах онтогенеза при действии наиболее широко распространенных загрязняющих веществ. Показана зависимость происходящих изменений от вида рыб, природы, концентрации и времени воздействия токсиканта.
Исследована динамика изменения интегрального показателя неспецифической гуморальной защиты - БАСК - в зависимости от концентрации и природы токсиканта, проанализирована взаимозависимость
9 между гепатосоматическими индексами, содержанием общего белка сыворотки крови и ее защитными свойствами при действии токсических и биотических факторов.
Разработан метод определения бактериостати чес кой активности гомогенатов тканей рыб, что дало возможность впервые проанализировать характер изменений данного показателя у личинок под действием кадмия.
Определен характер сдвигов иммунофизиологических показателей карпа и процессов их восстановления после снятия воздействия в зависимости от концентрации пестицида. Исследованы реакции клеточных и гуморальных факторов врожденного иммунитета на иммунизацию в присутствии карбофоса, показано, что пестицид подавляет защитные свойства сыворотки крови иммунизированных рыб. Выявлен иммуностимулирующий эффект низких концентраций различных по химической природе токсикантов на начальных этапах воздействия, проявляющийся в усилении защитных свойств тканей, а также активизации гемопоэза.
Материалы исследований расширяют знания о механизмах реагирования неспецифических механизмов иммунитета молоди рыб, особенно гуморального его звена, при действии различных по химической природе токсикантов.
10 Я выражаю глубокую благодарность научному руководителю д.б.н., профессору В.Р. Микрякову за внимательное отношение и ценные консультации, к.б.н., с.н.с. Е.А. Заботкиной за помощь на всех этапах подготовки рукописи и к.б.н., в.н.с. Л.В. Балабановой за конструктивные советы и поддержку в работе, а также д.б.н. В.Т. Комову и д.б.н., проф. Б.А.
Флерову за ценные замечания.
Особую благодарность хочу выразить д.б.н., в.н.с. лаборатории экспериментальной экологии Г.А. Виноградову за предоставленную возможность принять участие в работе с молодью осетра. Глубоко признательна к.б.н., заведующему лабораторией популяционной биологии и генетики ЮТ. Изюмову за помощь в получении материала для исследования личинок плотвы, а также заведующему экспериментальной прудовой базой «Супога» И.Г. Гречанову за теоретическое и практическое содействие при выращивании молоди.
Механизмы неспецифического иммунитета у рыб
Под неспецифическим иммунитетом подразумевается уровень врожденной устойчивости организма, независимо от его вида, к различным патогенным факторам и не связанной с предварительным контактом с антигеном (Anderson, 1974; Земсков и др., 1977; Козиненко и др., 1999). Соотношение специфических и врожденных факторов иммунитета у животных различных систематических групп неодинаково (Siwicki, Anderson, 1993). У низших позвоночных, включая и рыб, признается приоритет именно неспецифического иммунитета вследствие более слабого развития специфического по сравнению с высшими классами позвоночных (Grinde, 1989), тем более что механизмы его у рыб отличаются большим разнообразием и при любом внешнем воздействии активизируются относительно быстро даже при низких температурах (Кондратьева и др., 2001; Anderson, Zeeman, 1995). Напряженность естественной резистентности не является статической величиной и претерпевает популяционные, возрастные, сезонные и иные колебания (Купер, 1980; Лукьяненко, 1989). Неспецифический ответ является критерием эффективности процесса адаптации, который включает в себя сложную перестройку биорегуляции, направленную на поддержание гомеостаза (Метод, рекоменд., 1978). Врожденные антибактериальные факторы относятся к категории весьма чувствительных индикаторов течения адаптационных и патологических процессов, развивающихся иногда скрытно (заболевание, применение лекарственных средств, воздействие экстремальных факторов внешней среды), в связи с чем их изучение может иметь важное значение для оценки течения и прогноза этих процессов (Бухарин, Васильев, 1974;Вершигора, 1980). К барьерам и механизмам общей резистентности рыб относят чешую; эпителиальные и эндотелиальные покровы органов, слизь на коже, жабрах и в желудочно-кишечном тракте; а также высокое содержание лейкоцитов в крови, ее лимфоидный характер, широкий набор клеточных элементов, обладающих фагоцитарными свойствами; выраженная активность тканевых жидкостей; зависимая от внешней среды температура тела, ограничивающая развитие инфекции (Studnicka at al., 1993; Anderson, Zeeman, 1995; Valerie at al., 2000). Помимо противомикробной защиты, гуморальные неспецифические факторы выполняют множество других, не менее важных биологических функций, в том числе регуляторных (Даугалиева, Филиппов, 1991). Таким образом, поскольку в защите организма от неблагоприятных воздействий на более ранних этапах как фило-, так и онтогенеза неспецифическим факторам иммунитета принадлежит решающая роль (Grace, 1981; Абелев, 1996), исследование устойчивости к неблагоприятным воздействиям у молоди рыб должно основываться в первую очередь на изучении реакции различных звеньев врожденного иммунитета.
Среди других тканей и органов кровь по своим морфологическим и функциональным показателям занимает особое место. Помимо формообразовательной и трофической, кровь, как одна из наиболее чувствительных и лабильных систем организма животных, выполняет множество других функций. Особая роль плазмы и крови в целом состоит в том, что они обеспечивают одну из самых важных биологических адаптационных функций организма, которая направлена на контроль и сохранение его генетического (антигенного) постоянства или гомеостаза, обеспечении его резистентности и реактивности (Иванеха, Лиманский, 1989). Осуществляются эти функции за счет мощного и совершенного комплекса органных, тканевых, клеточных и субклеточных структур гематогенной природы (Иванова, 1995). Система крови объединяет вместе сосудистую кровь с многочисленными форменными элементами и органами гемолимфопоэза, в которых развиваются, а также разрушаются клетки крови (Иванова, 1995). Эндотелий и периферическая кровь рассматриваются как специфическая разновидность соединительной ткани. Большая часть имеющейся в организме кропи постоянно циркулирует по сосудам, некоторое количество крови депонировано в капиллярах печени и селезенки (Аминева, Яржомбек, 1984).
Учитывая свойства входящих в систему крови клеток, особенно лейкоцитов, следует подчеркнуть, что каждая клетка крови полифункциональна. Каждая функция крови обеспечивается взаимосвязанной работой нескольких типов клеток, а также тесным взаимодействием между клетками и межклеточной средой - плазмой крови (Иржак, 2001),
Определение морфофизиологических показателей: индексы органов, коэффициент упитанности, общий белок сыворотки крови
Коэффициент упитанности. Коэффициент упитанности по Кларк рассчитывали как отношение массы порки к кубу длины рыбы, умноженное на 100. (Методика морфофизиологических и биохимических исследований рыб, 1972).
Индексы внутренних органов. Относятся также к морфофизиологическим показателям, рассчитываются как отношение массы органа к массе порки. Этот показатель отражает емкость и потенциальные возможности иммунной системы в нейтрализации и метаболизме ксенобиотиков, синтезе специфических антител. Величина данного параметра зависит от сезона года, пола, состояния зрелости половых продуктов, возраста, скорости роста в онтогенезе, а также влияния окружающей среды (Баранов, 1982). Содержание общего белка сыворотки крови. Данный показатель определяли рефрактометрически.
Определение лизоцима. Содержание фермента определяли высокочувствительным фотонефелометрическим методом (Блумберга, Дундуре, 1987; Практикум по иммунологии, 2002). Он, как и остальные методики определения этого литического агента, основан на способности лизоцима растворять оболочку бактерий Mycrococcus lysodeicticus.
Для работы использовали суспензию лиофилизированных бактерий, в качестве стандарта для построения калибровочной кривой - лизоцим яичного белка. Колориметрирование проводили против забуференного физраствора.
Определение бактериостатической активности сыворотки крови. Метод учета антимикробных свойств сыворотки крови основан на ее способности угнетать рост микроорганизмов и отражает функциональное состояние гуморальных факторов естественного иммунитета. Мы проводили определение этого показателя нефелометрическим методом (Смирнова, Кузьмина, 1966) в модификации В.Р. Микрякова (Методические указания... 19S7). Исследуемые образцы жидкости помещали в пробирки с питательным бульоном. В контрольные вместо сыворотки вносили равный объем стерильного физраствора. После добавления суточной культуры Acromonas hydrophila пробирки ставили на инкубацию при 26 С. Оптическую плотность измеряли до и после инкубирования, затем определяли разность между вторым и первым измерением. Прирост оптической плотности в опыте относили к таковой в контроле, результаты выражали в процентах угнетения роста тест-культуры в присутствии исследуемых образцов по отношению к контролю.
Определение лейкоцитарной формулы. Приготовленные мазки фиксировали 96 этиловым спиртом в течение 20 мин; окрашивали по Романовскому-Гимза по стандартной методике. Краску готовили с использованием забуференной дистиллированной воды (Фрейфельд, 1947; Житенева и др., 1997). При определении лейкоцитов пользовались классификацией Н.Т. Ивановой (Иванова, 1983; 1995). Просчитывали на одном мазке не менее 200 лейкоцитов.
Работа с очень мелкими объектами имеет свои особенности, поэтому изготовление мазков крови личинок плотвы проводили согласно метода Житспевой с соавторами (1997). Поскольку в кровеносном русле личинок имеется крайне незначительное количество крови, а клетки ее очень нежные, то применяли предварительное обмывание личинок в изотоническом растворе, чтобы избежать разрушения клеток при соприкосновении с водой. Затем, после отсечения хвостового стебля, мазок накладывали не вдоль стекла, как обычно, а поперек, от 10 особей на стекло. Далее мазки обрабатывали как обычно. Индекс обилия лейкоцитов. Данный параметр представляет собой частоту встречаемости клеток белой крови в одном поле зрения. Для его определения просматривают на мазке 100 полей зрения на различных участках препарата, подсчитывая количество лейкоцитов в каждом поле зрения. Данные суммируют и делят на 100, получая, таким образом, среднее количество лейкоцитов в одном поле зрения. При определении данного показателя, в отличие от лейкоцитарной формулы, учитываются и молодые формы лейкоцитов, поэтому он дает представление об интенсивности процесса лейкопоэза и функциональном состоянии гемопоэтической ткани.
Показатели гуморального звена иммунитета
Показатели гуморального звена иммунитета. Бактериостатическая активность сыворотки крови. Полученные результаты представлены на рис. 10. Эксперимент показал значительное стимулирующее влияние ионов кадмия на показатели неспецифического гуморального иммунитета карпа на начальных этапах токсического воздействия: сыворотка крови подопытных рыб подавляла рост тест-бактерий в 1.4 раза активнее, чем у контрольных рыб. Отмеченный эффект далее снижался, и к концу эксперимента показатель достиг контрольного уровня.
Интересно отметить, что аналогичное действие кадмия на карпа было установлено и для специфического гуморального ответа; как было показано
Ю.Б. Алиновской (2001), у сеголеток карпа содержание иммуноглобулинов после 30 сут экспозиции в растворе ионов кадмия с концентрацией 0.75 мг/л значительно возросло. Это свидетельствует о том, что низкие концентрации солей кадмия оказывают выраженное стимулирующее влияние на гуморальный иммунитет, причем как на неспецифические, так и специфические его составляющие. Противомикробные свойства сыворотки крови являются результатом взаимосвязанной и взаимообусловленной работы комплекса защитных белковых систем. Установлено, что адаптационные изменения в белковой системе сыворотки крови рыб носят фазовый характер. В ответ на воздействие внешнего фактора в организме создается стрессовое состояние, сопровождающееся возникновением активационнои, а затем депрессивной фазы во многих системах, в том числе и в крови. В процессе адаптации названные фазы постепенно переходят в регулятивную, а затем в результативную. В то же время, при продолжительном и нерезком действии фактора организм проходит только регулятивную и результативную фазы адаптации, независимо от характера действующего фактора. В таком случае в белковой системе сыворотки крови обнаруживаются длительные незначительные сдвиги количественного равновесия между фракциями, результирующиеся в новом уровне гомеостаза (Кирсипуу, 1982). Именно по такому пути и развивается ответ защитной системы сыворотки крови в нашем эксперименте: под действием ионов кадмия показатели БЛСК проходят хорошо выраженную активационную фазу. Но действие раздражителя оказывается недостаточным для того, чтобы вызвать развитие депрессивной фазы, поэтому после активационнои и регулятивной наступает результативная фаза, с выходом показателя на контрольный уровень. 100 Обращает на себя внимание тот факт, что ход кривых изменений общего белка и БАСК не совпадает: к концу эксперимента содержание общего белка достоверно снижается, защитные же свойства сыворотки крови к этому моменту, напротив, возвращаются к норме. Это свидетельствует об отсутствии прямой зависимости между содержанием белка в сыворотке и ее протективными свойствами.
