Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СОЗ 15
1.1 Хлорорганические пестициды 15
1.2 Полихлорированные бифенилы 28
1.3 Полиароматические углеводороды 38
1.4 Полихлорированные фенолы , 41
Глава 2 Микробиологическая деструкция СОЗ 60
Глава 3 МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОЗ 71
3.1 Определение ХОП и ПХБ в доыных отложениях и почвах 71
3.2 Определение ХОП и ПХБ в биологических образцах 77
3.3 Определение ПАУ в донных отложениях 84
3.4 Определение фенола и хлорфенолов в воде и доннвіх отложениях 85
Глава 4 МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ 97
4.1 Определение численности фенолразрушающих микроорганизмов 97
4.2 Построение калибровочных кривых накопления биомассы 99
4.3 Выделение культур микроорганизмов-деструкторов фенола и хлорфенолов 101
4.4 Определение морфолого-культуральных и физиологических 106 свойств микроорганизмов
4.5 ПЦР-амплификация, клонирование и секвенирование генов 16s рДНК 113
Глава 5 ИССЛЕДОВАНИЕ СОДЕРЖАНИЯ СОЗ В ВОДЕ И ДОННЫХ ОТЛОЖЕНИЯХ ПРИТОКОВ ОЗЕРА БАЙКАЛ И ЗАЛИВА ПРОВАЛ 116
5.1 ХОП и ПХБ в донных отложениях притоков озера Байкал и Селенгинского мелководья 118
5.2 СОЗ в керне донных отложениях залива Провал 124
5.3 ПАУ в донных отложениях притоков озера Байкал 127
5.4 СОЗ в почвах Байкальского региона 135
5.5 Фенол и хлорфенолы в воде и донных отложениях притоков озера Байкал 137
Глава 6 ИССЛЕДОВАНИЕ СОДЕРЖАНИЯ СОЗ В ПОДКОЖНОМ ЖИРЕ НЕРПЫ 151
Глава 7 ИДЕНТИФИКАЦИЯ ИСТОЧНИКОВ ПОСТУПЛЕНИЯ СОЗ 170
Глава 8 ИССЛЕДОВАНИЕ МИКРОБНОЙ ДЕСТРУКЦИИ СОЗ 174
8.1 Деструкция фенола микроорганизмами природных и сточных вод 174
8.1.1 Численность фенолразрушающих микроорганизмов в природной воде 174
8.1.2 Деструкция фенола микроорганизмами природных вод 176
8.1.3 Деструкция фенола микроорганизмами сточных вод 184
8.1 Л Морфолога -кул ьтуральные свойства бактерий-деструкторов фенола 188
8.2 Деструкция хлорфенолов микроорганизмами пруда-аэратора БЦБК 198
8.3 Морфолого-культуральные и физиологические свойства бактерий-деструкторов хлорфенолов 201
8.4 Видовая идентификация бактерий-деструкторов 2,4-дихлорфенола 204 и 4-хлорфенола
8.5 Деструкция 2,4-дихлорфенола бактерией B.cereus 207
8.6 Разработка биотехнологической схемы очистки сточных вод 211
ВЫВОДЫ 216
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 218
СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИИ
2,4,5-ДХФ - 2,4,5-трихлорфенол
2,4,6-ДХФ - 2,4,6-трихлорфенол
2,4-ДХФ - 2,4-дихлорфенол
2,6-ДХФ - 2,6-дихлорфенол
2-ХФ - 2-хлорфенол
БЦБК - Байкальский целлюлозно-бумажный комбинат
ГХБ - гексахлорбензол
ГХЦГ - гексахлорциклогексан
ДДД - дихлордифеншгдихлорэтан
ДДТ - дихлордифенилтрихлорэтан
ДДЭ - дихлордифенилдихлорэтилен
ЮК — культуральная жидкость
ОС - основная среда
ПАУ - полиароматические углеводороды
ПХБ - полихлорированные бифенилы
ПХФ - пентахлорфенол
СОЗ - стойкие органические соединения
ХОП - хлорорганические пестициды
ХОС - хлорорганические соединения
ХФ - хлорфенолы
- Хлорорганические пестициды
- Микробиологическая деструкция СОЗ
- Определение ХОП и ПХБ в доыных отложениях и почвах
Введение к работе
В 1996 году ЮНЕСКО внесло озеро Байкал в Список участков мирового природного наследия, тем самым мировое сообщество признало озеро уникальным природным феноменом, имеющим важное значение для всего человечества.
Признание озера Байкал, как участка мирового природного наследия, накладывает на мировое сообщество и, в первую очередь, на Россию обязательства по сохранению озера для будущих поколений людей.
Для сохранения озера необходимо знать современный уровень загрязнения озера вредными веществами.
Особую опасность для экосистемы озера представляют стойкие органические загрязнители (СОЗ). Это, в основном, галогенированные органические соединения, синтезированные в промышленных целях или соединения, спонтанно синтезирующиеся в процессах химического синтеза (побочные продукты) или горения. Особенностью этих соединений является высокая токсичность для биоты, высокая устойчивость к фотолитическому, химическому и биологическому разложению. Они характеризуются низкой растворимостью в воде и хорошей растворимостью в жирах, что приводит к биоаккумуляции в жировых тканях организмов. СОЗ, не разлагаясь, переносятся воздушными массами на большие расстояния и рассеиваются по всему земному шару. Поэтому СОЗ постоянно воздействуют как на организм людей, так и на живые организмы.
На сегодняшний день не существует общепринятого списка СОЗ в силу отсутствия по многим веществам научных данных по длительному воздействию и биоаккумуляции. Тем не менее, из примерно 60 тысяч особо опасных химических веществ были выбраны 12 стойких органических загрязнителей, которые наиболее опасны для человека и окружающей среды.
Эти 12 СОЗ получили название «грязная дюжина». В мае 1995 года список 12 СОЗ утвержден решением № 18/32 Совета управляющих ЮНЕП (СОЗ, 2003):
Дихлор-дифенил-трихлорэтан (ДДТ);
Алдрин;
Диэлдрин;
Эндрин;
Хлордан;
Мирекс;
Токсафен;
Гептахлор;
Гехсахлорбензол (ГХБ); Ю.Полихлорбифенилы (ПХБ);
11.Полихлордибензодиоксиньї (ПХДД);
12.Полихлордибензофураны (ПХДФ).
Список включает в себя 8 запрещенных к производству и применению пестицидов (.1.-8), ГХБ раньше использовался как пестицид, в настоящее время производится для создания пиротехнических устройств и для создания дымовых завес в военном деле. ПХБ в настоящее время не производятся, но до сих пор входят в состав охлаждающих масел в электротехнике. ПХДД и ПХДФ специально не производятся, но эти соединения образуются при любых высокотемпературных процессах с использованием хлора (химический синтез и процессы горения). Основным источником в настоящее время является сжигание мусора.
Решение 18/32 привлекло внимание не только научного сообщества, но и широких слоев населения, заинтересованного в сохранении окружающей среды. Соответственно, правительства стран и природоохранные ведомства приняли решения о принятии мер по ограничению поступления СОЗ в
окружающую среду.
Поскольку СОЗ могут длительное время оставаться в окружающей среде, есть только один способ защититься от СОЗ - полностью прекратить производство и применение этих веществ во всем мире, то есть требуется международная программа борьбы с СОЗ. Поэтому в 1998 году по инициативе ЮНЕП (Программа ООН по окружающей среде) был создан Межправительственный комитет по разработке конкретных мер в отношении 12 СОЗ. В течение 3 лет обсуждались предложения многих стран и был подготовлен документ в отношении 12 СОЗ. Документ был открыт для подписания 23 мая 2001 года в Стокгольме и получил название «Стокгольмская конвенция». Заключительный акт конвенции, где был принят текст конвенции, подписали более ста стран.
18 мая 2002 года Премьер-министр Российской Федерации Михаил Касьянов подписал Постановление Правительства №320 о поддержке Россией Стокгольмской конвенции, тем самым Россия также приняла на себя обязательства по выполнению мероприятий по выведению из оборота, обезвреживанию и уменьшению выбросов 12 СОЗ.
Хотя в Стокгольмской речь идет только о 12 СОЗ, в ней заложены принципы политики в отношении СОЗ. Эти принципы будут распространены и на другие СОЗ, по мере увеличения списка, существующий список отражает лишь современное понимание повышенной экологической опасности СОЗ. Поэтому прослеживается общая тенденция исследований присутствия СОЗ в объектах окружающей среды, когда исследуются не только СОЗ из «грязной дюжины», но и другие, не менее опасные СОЗ. На наш взгляд, для байкальского региона актуальны исследования содержания в природе изомеров пестицида ГХЦГ, широко использовавшегося как инсектицид в сельском хозяйстве и для борьбы с вредителями леса. ГХЦГ также устойчив, и в настоящее время как почвенные и лесные экосистемы,
так и акваэкосистемы (пестицид поступает с поверхностными и подземными водами) содержат в опасных концентрациях этот высокотоксичный пестицид. Также актуальны для байкальского региона исследования содержания хлорфенолов. Хотя они не так устойчивы как ДДТ и ГХЦГ (кроме пентахлофенола), но производство беленой целлюлозы на БЦБК с помощью активного хлора дает большой спектр хлорфенолов, особенно токсичных для гидробионтов. Полиароматические углеводороды (ПАУ), также можно отнести к токсичным СОЗ, ПАУ с большим числом ароматических колец также устойчивы в природе. ПАУ являются наиболее токсичными соединениями, входящими в состав нефти и нефтепродуктов. Огромное количество ПАУ выбрасывается в окружающую среду в регионе при производстве алюминия (сгорание электродов при электролизе). Два алюминиевых завода, расположенных в Иркутской области (г. Шелехов и г. Братск) эмитируют огромное количество токсичных ПАУ.
Поэтому важной проблемой, на наш взгляд, является выявление источников поступления в бассейн озера Байкал токсичных СОЗ. Эта проблема крайне сложна и с научной стороны, вследствие отсутствия точных критериев отнесения к разным источникам, и из-за сложности процессов атмосферного переноса. Большие трудности создает и генерация некоторых СОЗ в природе (некоторые соединения ПАУ и хлорфенолы).
Само озеро Байкал относительно хорошо исследовано, работы по определению СОЗ в воде и приповерхностных донных отложениях начались в 1991 году (Kucklick et al., 1993, 1994), а по определению СОЗ в тканях байкальской нерпы в 1992 году (Nakata et al., 1995). Бассейн же озера Байкал относительно мало исследован.
Крайне высокая токсичность СОЗ для акваэкосистем, а также способность аккумулироваться и достигать высоких концентраций в конечных цепях трофической цепи (байкальская нерпа) с необходимостью
определяет СОЗ как приоритетные загрязнители для озера Байкал, а байкальская нерпа является чувствительным индикатором загрязнения СОЗ озера.
Поступление СОЗ в озеро связано с выносом СОЗ водами притоков озера. СОЗ, сорбированные частицами аэрозоля, выпадают на территорию бассейна озера, затем смываются осадками и с наземными и подземными водами поступают в притоки озера. Донные отложения притоков, которые сорбируют СОЗ в процессе седиментации, отражают уровень поступления СОЗ в бассейн озера.
Известно, что большинство СОЗ разлагаются в окружающей среде микроорганизмами, но скорость разложения мала, поскольку природные микроорганизмы не в достаточной мере выработали способность к катаболизму, к биодеградации этих чуждых природе веществ. Повысить скорость биодеградации СОЗ. в природных экосистемах и в сточных водах предприятий, содержащих СОЗ, можно с помощью селекции микроорганизмов или создания микроорганизмов с помощью генной инженерии. Но согласно Федеральному закону Российской Федерации «О государственном регулировании в области генно-инженерной деятельности» генетически модифицированные микроорганизмы нельзя интродуцировать в окружающую среду. Запрещает интродукцию живых организмов, не свойственных экосистеме озера Байкал и его бассейну Федеральный закон «Об охране озера Байкал». Следовательно, ускорить биодеградацию СОЗ в бассейне озера возможно лишь с помощью микроорганизмов, адаптированных к конкретным СОЗ.
Большую проблему для региона представляют склады запрещенных к использованию пестицидов и других ядохимикатов. Только в ООО «Саянтуй-Сервис» (Тарбагатайский район Республики Бурятия), хранится в неприспособленных складах более 140 тонн пестицидов и ядохимикатов.
Это только в одном земледельческом районе региона. Поэтому проблема утилизации (обезвреживания) этих веществ требует исследований. Очевидно, что утилизация с использованием высокотемпературных печей, плазменных установок требует больших затрат. Поэтому биодеградация этих веществ с использованием микроорганизмов представляет наиболее дешевый и эффективный способ. Поэтому биоремедиация, т.е. использование микроорганизмов для борьбы с загрязнениями окружающей среды, может быть особенно эффективна для уменьшения загрязнения почвенных н водных экосистем как в случае локального (почва складов), так и рассеянного (сельхозугодья) загрязнения.
Байкальский целлюлозобумажный комбинат (БЦБК) является крупнейшим поставщиком в озеро Байкал крайне опасных токсикантов -полихлорированных фенолов. БЦБК расположен непосредственно на берегу озера, а сброс сточных вод происходит прямо в озеро. Хлорфенолы крайне токсичны для гидробионтов, а также обладают мутагенным и канцерогенным воздействием.
Фенол (оксибензол), несмотря на отсутствие в структуре атомом хлора,
также является токсичным для гидробионтов загрязнителем. Фенол
поступает в природу при сгорании на тепловых станциях органического
топлива, при работе газогенераторных станций, со стоками
целлюлозобумажных и деревообрабатывающих производств.
Поэтому исследование закономерностей биологической деструкции фенола и его хлорпроизводных, как крайне токсичных акваполлютантов, крайне важно для оценки состояния бассейна озера Байкал, а полученные данные в перспективе позволят совершенствовать биодеградативные методы защиты экосистем бассейна.
Цель и задачи исследования.
Целью работы является определение современного уровня 3aq^3HeHHH водных экосистем бассейна озера Байкал стойкими органическими загрязнителями, установление закономерностей динамики контаминации СОЗ этих экосистем, научное обоснование методов биодеградации стойких органических загрязнителей для защиты окружающей среды в бассейне озера Байкал,
Для реализации заявленной цели решались следующие задачи:
определение уровней загрязнения экосистем бассейн озера Байкал стойкими органическими загрязнителями;
идентификация источников поступления стойких органических загрязнителей в бассейн озера Байкал;
определение закономерностей распределения пестицидов и полихлорированных бифенилов (ПХБ) по глубине в керне мелководья озера Байкал;
сравнение уровней загрязнения СОЗ байкальской нерпы в 1992 г. и в 2002 г.;
определение петрогеныой и пиролитической природы полиароматических углеводородов по соотношениям индивидуальных соединений;
установление антропогенного и природного происхождения хлорфенолов по соотношениям индивидуальных соединений;
определение источников происхождения фенола в природных водах притоков озера Байкал;
определение деструктивной активности (по разложению фенола) органотрофных микробиоценозов водных экосистем бассейна озера Байкал;
выделение культур бактерий-деструкторов хлорфенолов из пруда-аэратора БЦБК и определение их таксономической принадлежности;
установление закономерностей деструкции хлорфенолов выделенными культурами;
определение перспективности применения выделенных культур для эффективной очистки стоков БЦБК;
обобщение опыта выделения культур с высокой деструктивной способностью для биодеградации других стойких органических соединений. Научная новизна работы.
Впервые получены данные о степени загрязнения бассейна озера Байкал стойкими органическими загрязнителями ~ хлорорганическими пестицидами, полихлорированными бифенилами, полиароматическими углеводородами, хлорфенолами.
Идентифицированы источники поступления стойких органических загрязнителей для разных классов соединений.
Для байкальской нерпы установлено понижение уровня загрязнения СОЗ за последние 10 лет.
В керне донных отложений мелководья озера Байкал определены уровни содержания СОЗ.
Определены характеристики биодеградации фенола природными сообществами водных экосистем бассейна озера Байкал.
Выявлены закономерности биодеградации хлорфенолов выделенными культурами-деструкторами хлорфенолов. Практическая значимость работы.
Определена степень контаминации водных экосистем бассейна озера Байкал стойкими органическими загрязнителями, материалы исследований вошли в «Ежегодные доклады о состоянии окружающей среды в Республике Бурятия» 1998 - 2004 г.г. и «Ежегодные доклады Правительственной комиссии по Байкалу» 1999 - 2004 г.г.. Результаты исследований вошли в нормативные документы по охране окружающей
среды на Байкальской природной территории - «Нормативы предельно допустимых вредных воздействий на уникальную экологическую систему озера Байкал» и «Перечень веществ, вредных для экосистемы озера Байкал». Выделены культуры с высокой деградативной способностью фенола и хлорфенолов, которые могут быть использованы для обезвреживания промышленных стоков. Апробация работы.
Основные результаты работы были представлены и обсуждены на
международных конференциях: «International Baikal Conference 1999»
(Schneverdingen, Germany, 1999), "Экология Сибири, Дальнего Востока и
Арктики" (Томск, 2001), V International Congress "Water: Ecology and
Technology" (ECWATECH-2002), (Moscow, 2002), "Селенга - река без
границ" (Улан-Удэ, 2002), International Baikal Symposium on Microbiology
(IBSM-2003) «Microorganisms in Ecosystems of Lakes, Rivers and Reservoirs»
(Irkutsk, 2003), International Ecologic Forum "Environment and Human Health"
(St. Petersburg, 2003); на всероссийских конференциях: Всероссийских
научных чтениях с международным участием, посвященных 70-летию со дня
рождения члена-корреспондента АН СССР М.В. Мохосоева (Улан-Удэ,
2002), X Всероссийской научно-практической конференции "Экология и
проблемы охраны окружающей среды" (Красноярск, 2003); на региональных
научных конференциях: "Природные ресурсы Забайкалья и проблемы
природопользования" (Чита, 2001), «Экологические и
гидрометеорологические проблемы больших городов и промышленных зон» (Санкт-Петербург, 2002). Результаты исследований также обсуждались на семинарах Центра экологических исследований (г. Лейпциг, Германия, 2000), Центра морских исследований Эхимэ университета (Япония, 2004).
Публикации.
Материалы диссертации опубликованы в 45 работах, включая аналитический обзор. Объем и структура.
Диссертация состоит из введения, 8 глав, выводов, списка использованных источников, включающего 271. источник, в том числе 185 иностранных, Работа изложена на 248 стр., включая 45 таблиц, 47 рисунков.
Хлорорганические пестициды
Хлорорганические пестициды (ХОЇЇ) - большая группа химических веществ, представленная галогенпроизводными алициклических и ароматических соединений. ХОП являются веществами антропогенного происхождения, т.е. не образуются в природе и попадают в окружающую среду в результате хозяйственной деятельностью человека. Благодаря ярко выраженным инсектицидным свойствам, на протяжении 1940-1960 г.г. хлорорганические пестициды ДДТ (дихлордифенилтрихлорэтан) и ГХЦГ (гексахлорциклогексан) являлись наиболее распространенными и широко используемыми препаратами. ХОП представляют собой твердые кристаллические вещества, которые обладают высокой термостабильностью, низким давлением насыщенного пара, плохой растворимостью в воде, но хорошей растворимостью в жирах и липидах. Физико-химические свойства соединений группы ДДТ, изомеров ГХЦГ и ГХБ представлены в таблицах 1.1.1-1.1.3. По своим химическим свойствам ХОП в обычных условиях очень инертны и практически не разлагаются под действием концентрированных кислот, щелочей и воды. Исключением являются изомеры ГХЦГ, которые при температуре 100С и выше гидролизуются с образованием трихлорбензолов и трихлорфенолов и выделением хлористого водорода. Деструкция ХОП наступает в восстановительной среде и идет более интенсивно в присутствии катализаторов при повышенной температуре. Так, например, в спиртовом растворе едкой щелочи ДДТ количественно переходит в ДДЭ (реакция дегидрохлорирования). При нагревании бензольного раствора ДДТ с безводным хлористым алюминием наблюдается разложение ДДТ, о чем свидетельствует появление оранжевой окраски раствора. В присутствии сильных окислителей (азотной кислоты, оксидов хрома) разложение ДДТ и его метаболитов происходит с образованием бензофенолов (Ровинский и др., 1990). При нагревании до температуры разложения ГХБ разлагается с выделением ядовитых паров хлоридов, при 65 С бурно взаимодействует с диметилформамидом (ДМФА). ГХБ получают в промышленности хлорированием бензола избытком хлора в присутствии катализатора - хлорида алюминия (ASTDR, 2002).
Основу технического препарата ДДТ составлял дихлордифенилтрихлорэтан, который был представлен двумя изомерами п,п -ДДТ [1,1 Д трихлор-2,2-бис(« хлорфенил)этан] and о,п -ДДТ [1,1,1 трихлор-2-(и-хлорфенилфенил)-2-(о-хлорфенил)этан], различающимися положением атомов хлора в бензольных кольцах. В состав технического препарата кроме этих двух изомеров входили п,п ДДД [ 1,1-дихлор-2,2 бис(/7.-хлорфенил)этан], о,п -ДДД [1,1-дихлор-2-(о-хлорфенил)-2-(и хлорфенил)этан], п,п -ДДЭ [1,1 -дихлор-2,2-бис(и-хлорфенил)этилен], о,п -ДДЭ [1,1 дихлор-2-(о-хлорфенил)-2-(и-хлорфенил)этилен]. Обычный состав технического ДДТ следующий: п,п -ДДТ - 77.1%, о,п -ДДТ - 14.9%, п,п -ДДД - 0.3%, одт-ДДД - 0.1%, плт -ДДЭ - 4.0%, о,п -ДДЭ - 0.1% и следовые др. соединений (WHO, 1989).
Микробиологическая деструкция СОЗ
Биотехнологические методы, основанные на применении микроорганизмов-деструкторов, используются для очистки бытовых, промышленных и агропромышленных сточных вод, локальной очистки загрязненных почв. Микроорганизмы обладают большим разнообразием ферментов, осуществляющих реакции деструкции различных СОЗ. Известно, что присутствие в молекулах связей «галоген-углерод» затрудняет их микробиологическую деструкцию, так как природные соединения редко содержат такие связи. Следовательно, многие хлорированные органические соединения весьма персистентны и подвергаются крайне медленному, а иногда даже лишь частичному разложению микроорганизмами. Способность к деструкции органических соединений у бактерий контролируется внехромосомными элементами наследственности, так называемыми плазмидами (плазмиды деградации, или D-плазмиды) (Воронин, 2000). Способностью разлагать фенол и хлорфенолы обладают многие виды микроорганизмов. Попав в окружающую среду, как в результате естественного метаболизма, так и поступления со сточными водами, фенол подвергается физической, химической и биологической деструкции (Тинсли, 1982). В водной среде лимитирующими процессами разложения фенола являются фотолиз и микробная деструкция (Каплин, 1973). Кроме того, остаточное количество фенола сорбируется донными отложениями (Методические указания по определению загрязняющих веществ в морских донных отложениях, 1979). Интерес к микроорганизмам, способным полиостью разлагать фенол в широком диапазоне концентраций, не только не снижается, но и постоянно растет. Выделяются новые штаммы, изучаются механизмы и пути его разложения. К настоящему времени выделен целый ряд микроорганизмов, способных использовать в качестве единственного источника углерода и энергии фенол - такие как Pseudomonas putida (Aksu, Bulbul, 1998; Mordocco et al., 1999; Kivisaar et al., 1989; Kallastu et al., 1998; Shen, Wang, 1995), Ralstonia eutropha (Leonard, Lindley, 1999), Comamonas testosteroni (Arai et al, 1998, 2000; Bae et al., 1996), Acinetobacter (Hao et al., 2000), thermophilic Bacillus (AH et al, 1998), Xanthobacter (Zhou et al., 1999), Coprinus (Guiraud et al., 1999), Clostridium (Li et al., 1996). Известно, что микроорганизмы, выделенные на фенольном агаре, способны окислять как небольшие (0,5-50,0 мг/дм ), так и высокие (до 1000 мг/дм ) концентрации фенола (Березкина и др., 1992; Федоров и др., 1992). Для деструкции токсичных ароматических соединений микроорганизмам требуется набор систем специфичных ферментов, активности которых находятся под контролем систем плазмидных генов - внехромосомных элементов наследственности (плазмидов биодеградации или D-плазмидов), наличие которых у определенных видов микроорганизмов позволяет им эффективно разлагать ряд органических экотоксикантов, в том числе и фенол. Каждый фермент селективно катализирует одно из превращений, которым подвергается данное соединение. Микроорганизмы располагают ферментами, катализирующими утилизацию аналогичных природных соединений, т.е. специфичность фермента изменить проще, чем характер катализируемой им реакции (принцип аналогии). Для функционально активного состояния данной последовательности реакций подготовительного метаболизма токсиканта необходимо наличие всех ферментов. Другими словами, совокупность ферментов подготовительного метаболизма определенного соединения, несмотря на их разнообразие, выступает как функционально единая система, и только она имеет биологическое значение. В подавляющем большинстве случаев в конкретных условиях окружающей среды у микроорганизмов функционально активны ферменты только одного типа. Это связано с различными механизмами регуляции биосинтеза и активности ферментов (Воронин, 2000). Чтобы использовать определенное соединение в качестве единственного источника питания, микроорганизмы синтезируют и поддерживают в активном состоянии специальную систему ферментов. Большинство ферментов подготовительного метаболизма может катализировать не одного, а ряда соединений, т.е. обладает широкой специфичностью (Копытов, Дивавин, 1983; Карасевич, 1982; Реакция гидробионтов на загрязнение, 1983). Из всего объема литературы о путях разложения фенола и ферментах, осуществляющих эти процессы, большая часть информации касается фенол гидроксилаз (Соляникова, Головлева, 1999). В работах, описывающих пути метаболизма фенола и его производных, как в аэробных, так и в анаэробных условиях, авторы делают упор на идентификацию ключевых интермедиатов, определение их дальнейшей судьбы, расшифровке генетических последовательностей плазмид (Watanabe et al., 1998; Semple, Cain, 1998; Kibret et al., 2000; Seme, Young, 1998; Karlsson et al, 1999; Heider, Fuchs, 1997).
В аэробных условиях метаболизм фенола протекает с образованием ключевого интермедиата - пирокатехина - и его последующим расщеплением пирокатехазой или метапирокатехазой. Несмотря на то, что деструкция фенола микроорганизмами изучается уже давно, немного известно о ферментах первичной атаки молекулы фенола.
1. Включение кислорода в молекулу фенола, эту реакцию катализируют оксигеназы. Монооксигеназы катализируют включение в молекулу фенола одного атома молекулярного кислорода, тогда как второй атом восстанавливается до воды.
Определение ХОП и ПХБ в доыных отложениях и почвах
Подготовку проб донных отложений и почвы для анализа осуществляли согласно РД 52.24.71-88 "Методические указания по определению содержания хлорорганических пестицидов и их метаболитов в донных отложениях" с небольшими изменениями данного метода.
Схема экстракции ХОС из проб донных отложений и почвы представлена на рис. 3.1.L Пробоподготовка состояла в двукратной экстракции ХОС растворителями (гексан, ацетон) и очистке полученных экстрактов концентрированной серной кислотой и пропусканием через колонку с флоризилом.
Донные отложения и почву высушивали при комнатной температуре и просеивали через сито с диаметром пор 0.5 мм для исключения крупных включений, затем примерно 20 г воздушно сухих донных отложений или почвы использовали для экстракции ацетоном и гексаном (40 мл смеси состава 1:1), затем снова гексаном (15 мл). Экстрагированные ХОС перераспределяли в гексан путем промывания объединенного экстракта дистиллированной водой. Полученный гексановый экстракт подвергали очистке концентрированной серной кислотой (промывание экстракта порциями кислоты по 5 мл до обесцвечивания слоя кислоты) и очищали пропусканием через колонку с флоризилом. После концентрирования экстракт подвергали хроматографическому анализу.
В подученных экстрактах идентифицировали изомеры ДДТ (п,п -ДДТ, о,п -ДДТ), изомеры его метаболитов (п,п -ДДЭ, п,п -ДДД, о,п -ДДЭ, о,п ДДД), изомеры ГХЦГ (а-ГХЦГ, р- ГХЦГ, у- ГХЦГ), шесть индикаторных ПХБ (ПХБ 28, ПХБ 52, ПХБ 138, ПХБ 153, ПХБ 180), а также дильдрин, эндрин и ГХБ. Идентификация и количественное определение индивидуальных ХОС в пробах донных отложений были выполнены в Центре экологических исследований (Umweltforschungszentrura, Leipzig, Germany) и Байкальском институте природопользования СО РАН.
В первом случае был использован метод хромато-масс-спектрометрии (газовый хроматограф Hewlett-Packard HP 5890 с масс-спектрометром HP 5971 и автосамплером HP 7673). Анализируемые компоненты разделяли на капиллярной колонке HP Ultra 2 (неподвижная фаза - (5%)-дифенил-(95%)-диметилсилоксан сополимер) длиной 25 м с внутренним диаметром 0.32 мм. В качестве газа-носителя использовали гелий. Температуру термостата колонки увеличивали от 60С (время выдержки - 1 мин.) до 260 С (время выдержки - 1 мин.) со скоростью 10С/мин. Были использованы стандарты пестицидов Promochem (Wessel, Germany).
Во втором случае был использован метод газовой хроматографии с электронозахватным детектированием (газовый хроматограф Hewlett-Packard HP 6890 с детектором электронного захвата, капиллярная колонка HP 5 (неподвижная фаза - (5%)-дифенил-(95%)-диметилсилоксан сополимер) длиной 30 м с внутренним диаметром 0.32 мм, газ-носитель - гелий). Температура термостата колонки увеличивали от 80С (время выдержки - 1 мин.) до 190С (время выдержки - I мин.) со скоростью 30С/мин, затем до 280С (время выдержки - 1 мин.) со скоростыо 6С/мин и до 300 С (время выдержки -2 мин.) со скоростью 20 С/мин.
