Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Разнообразие озер 9
1.1. Классификация озер по их происхождению 10
1.2. Классификация озер по температурному режиму 11
1.3. Классификация озер по степени трофии 14
1.4. Географическое описание содовых озер
1.4.1 .Содовые озера различных континентов 17
1.4.2.Содовые озера Забайкалья 19
2. Основные факторы среды обитания микроорганизмов в микробном сообществе
2.1.1. Концентрация водорода 21
2.1.2. Концентрация органических метаболитов 22
2.1.3.Влияние рН среды 23
2.1.4. Концентрация сероводорода и метана 24
2.1.5. Концентрация кислорода и величина Eh 25
2.1.6. Образование покоящихся форм и скорост ъ роста 26
2.1.7. Влияние температуры 27
2.1.8. Пространственная организация сообщества 29
2.2. Донные осадки как среда обитания микроорганизмов 30
2.3. Сезонные изменения условий среды обитания микроорганизмов 34
2.4. Межгодовые изменения условий среды обитания микроорганизмов 36
3. Основные этапы деструкции органического вещества микроорганизмами
3.1 Начальные этапы разложения OB 39
3.2. Терминальные процессы анаэробного разложения ОВ 40
3.2.1 Метаногенез 43
3.2.2 Сульфатредукция 45
3.3. Лечебный фактор содово-соленых озер 49
4. Круговорот углерода в содово-соленых озерах 51
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объект исследования 55
2.2. Методы отбора проб 56
2.3. Методы исследования среды обитания 56
2.4. Методы учета численности бактерий 57
2.5. Методы определения скорости микробных процессов 60
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Сезонные изменения физико-химических показателей воды и донных осадков озера Белое 62
3.2. Химический состав воды озера Белое 68
3.3. Сезонная динамика развития микробного сообщества 72
3.3.1. Микробное сообщество водной толщи 72
3.3.2. Микробное сообщество донных отложений 73
3.4. Сезонные колебания численности различных физиологических групп бактерий - деструкторов 75
3.4.1. Сезонная динамика численности мезофильных бактерий 76
3.4.2. Сезонная динамика численности психроактивных бактерий 80
3.5. Интенсивность микробных процессов деструкции органического вещества
3.5.1. Скорость разложения белка, целлюлозы и концентрация органического углерода (Сорг) в донных осадках 83
3.5.2. Темновая фиксация СОг 86
3.5.3. Сульфатредукция 87
3.5.4. Образование метана 88
3.5.5 Расход органического вещества на терминальных этапах деструкции 90
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 91
ВЫВОДЫ 93
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 95
ПРИЛОЖЕНИЯ 114
- Концентрация органических метаболитов
- Методы исследования среды обитания
- Сезонные колебания численности различных физиологических групп бактерий - деструкторов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Сезонные изменения условий среды обитания оказывают глубокое влияние на состояние микробных сообществ и распределение потоков углерода в природных экосистемах. Глобальный характер этих изменений диктует необходимость их подробного изучения в течение всего года и является одной из приоритетных задач научных исследований в настоящее время (Заварзин, 2003).
Однако на данный момент количество работ по этой проблеме крайне не достаточно. Это связано с тем, что, во-первых, большая часть природных экосистем недоступна для систематических исследований в течение года. Во-вторых, проследить все пути продукции и деструкции органического вещества (ОВ) даже в одном отдельно взятом биотопе технически сложно. Микробная деструкция ОВ отличается исключительным разнообразием процессов, их разветвленностью и наличием множества обратных связей, которые зависят от физико-химических условий среды (Кузнецов, 1970, Горленко и др., 1977, Заварзин, 1984, Намсараев, 1992).
Настоящая работа посвящена исследованию влияния сезонных изменений условий среды на процессы разложения ОВ микробным сообществом мелководного озера в Забайкалье. Известно, что мелководные озера характеризуются ярко выраженными сезонными колебаниями условий среды. Непостоянный водный режим, значительные перепады температуры и минерализации воды в течение года существенно влияют на деятельность микроорганизмов и их разнообразие (Намсараев, Намсараев, 2007).
Для исследования было выбрано содовое озеро Белое (Западное
Забайкалье), водная толща и донные осадки которого являются местом
активной деятельности алкалофильных микроорганизмов.
Микробиологические исследования в данном водоеме позволили охарактеризовать сезонную динамику функциональной активности алкалофильного микробного сообщества.
Цель исследования: изучить влияние физико-химических условий среды на активность бактерий - деструкторов ОВ в донных осадках содового озера Белое.
Основные задачи исследования:
Изучить сезонные колебания основных физико-химических показателей воды и донных осадков озера Белое (температура, рН, Eh, минерализация, ионный состав воды).
Определить численность различных физиологических групп бактерий-деструкторов в осадках озера в разные сезоны года.
Определить сезонную динамику скорости микробных процессов деструкции ОВ: разложения целлюлозы и белка, темновой ассимиляции СОг в донных отложениях озера Белое.
Оценить значение метаногенеза и сульфатредукции, как терминальных процессов минерализации ОВ в литоральных осадках по сезонам.
Научная новизна. В содовом озере Белое впервые определены в разные сезоны макро - и микроэлементный состав воды и ила. Впервые по единой схеме количественно исследована деятельность алкалофильных микроорганизмов, принимающих участие в деструкции органического вещества, в аэробных и анаэробных зонах водной толщи и донных осадков. Их максимальная численность, равная 104 и 107 кл/мл, выявлена в донных осадках. Численность алкалофильных микроорганизмов снижается в толще осадков к нижним горизонтам.
Основными регулирующими факторами активности алкалофильных
аэробных и анаэробных микробных сообществ содового озера являются
температура, содержание и состав органического вещества, концентрация
кислорода и минерализация. Установлено, что в донных осадках
исследованного озера скорость микробных процессов имеет два пика
активности: весной и конец лета — начало осени. Количественная оценка
деятельности микроорганизмов показывает, большая часть органического
вещества на терминальных этапах используется для бактериального восстановления сульфатов.
Практическая ценность. Полученные количественные данные о распространении микроорганизмов разных физиологических групп и об их активности в водной толще и донных осадках могут использоваться в качестве индикаторов трофического уровня и их антропогенного загрязнения. Результаты физико-химических анализов и геохимической деятельности алкалофильных микроорганизмов могут быть использованы для бальнеологических оценок воды и донных осадков озер. Алкалофильные бактерии различных физиологических групп представляют интерес для биотехнологий, связанных с применением устойчивых к высоким значениям рН микробных культур и ферментов.
Теоретическая значимость. Проведенные комплексные физико-химические и микробиологичесіше исследования значительно расширили представления о деятельности алкалофильных микробных сообществ. Впервые количественно оценена геохимическая роль протеолитических, целлюлолитических и сульфатредуцирующих бактерий в содовом озере Белое. Показано важное значение процесса сульфатредукции в круговороте углерода и серы. Полученные результаты расширяют представление о разнообразии и экологическом значении алкалофильных бактерий в природе.
Апробация работы. Основные результаты работы доложены: на Всероссийской конференции молодых ученых «Экология в современном мире: взгляд научной молодежи» (Улан-Удэ, 2007), 2-м Байкальском Микробиологическом Симпозиуме с международным участием «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек, водохранилищ» (Иркутск, 2007), Научная сессия молодых ученых, посвященная 50-летию БНЦ СО РАН (Улан-Удэ, 2008), V Международной конференции по криопедологии «Разнообразие мерзлотных и сезонно-промерзающих почв и их роль в экосистемах» (Улан-Удэ, 2009).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ.
Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 116 страницах, включая 5 таблиц и 19 рисунков. Диссертация состоит из разделов: Введение, Обзор литературы, Экспериментальная часть (включающая главы: Объект и методы исследований, Результаты исследований и Обсуждение результатов), Выводы и Список литературы.
Благодарности. Автор выражает глубокую признательность за общее научное руководство научному руководителю к.б.н. Е.Ю. Абидуевой, научному консультанту к.б.н. СП. Бурюхаеву, заведующему лабораторией микробиологии д.б.н., проф. Б.Б. Намсараеву за постоянное внимание, помощь в работе и обсуждении результатов.
д.б.н. A.M. Зякуну и к.б.н. Ц.Д. Ли любезно согласившимся оппонировать работу.
Автор приносит искреннюю благодарность сотрудникам и аспирантам лаборатории микробиологии ИОЭБ СО РАН, родным и близким за поддержку и ценные советы.
Работа выполнена при финансовой поддержке грантов Президиума СО РАН №38 и 95, МО РФ РНП.2.1.1./2165, НОЦ «Байкал».
Концентрация органических метаболитов
Расчеты по методике Тауэра (Thauer et al, 1977) показывают, что в отличие от водорода изменение концентрации таких промежуточных продуктов, как этанол, пропионат, бутират и бензоат относительно слабо влияют на энергетический выход реакций (Dolfmg, 1988). Однако результаты экспериментальных исследований свидетельствуют, что удаление ацетата из среды при разложении этих метаболитов оказывает стимулирующий эффект. В синтрофных ассоциациях с участием ацетат-использующих микроорганизмов скорость разложения субстратов и прирост биомассы резко возрастают. Термодинамические расчеты и модельные математические исследования также свидетельствуют об энергетическом выигрыше реакций при удалении ацетата из среды. Причем наибольший эффект оказывается в системах где метаболическое значение водорода несущественно. По аналогии с межвидовым переносом водорода этот процесс получил название межвидовой перенос ацетата (Mclnerney, Beaty, 1988; Beaty, Mclnerney,1989; Слободкин, Ножевникова, 1990; Петров, Слободкин, 1993).
Возможность межвидового переноса формиата до сих пор остается дискуссионной (Boone et al, 1989; Stams et al, 1992; Schmidt, Ahring, 1993; Dong et al, 1994). В пользу этого предположения свидетельствуют термодинамическая предпочтительность формиата в синтрофных реакциях по сравнению с водородом; более, высокий, чем у водорода коэффициент диффузии в водной среде; наличие среди синтрофных партнеров микроорганизмов, способных как к образованию, так и к использованию формиата. Термодинамические параметры определяют возможность протекания тех или иных реакций, но реализация этих возможностей часто зависит от других причин. Интенсивное разложение органического вещества может приводить к закисленню среды. Такая ситуация возникает, например, при резком поступлении легко разлагаемого ОВ и активизации гидролитической и ферментативной микрофлоры. В результате этого происходит накопление кислых продуктов брожения ОВ, которые не могут быть быстро утилизированы терминальными группами микроорганизмов (Бонч-Осмоловская, 1979а; Boone, Xun, 1987; Nacamura et al, 1991; Коцюрбенко и др, 1992; Yanetal, 1996).
Снижение рН среды до 4-5 приводит к ингибированию большинства бактериальных процессов и консервации органического материала (Anderson et al, 1978; Yavitt et al, 1987; Schiller, Conrad, 1991; Намсараев, 1992). Механизм ингибирования, по-видимому, связан с особенностями транспорта низкомолекулярных кислот. При низких значениях рН среды эти кислоты находятся в молекулярной форме. В таком виде они токсичны для большинства микроорганизмов, поскольку свободно проникают через клеточную мембрану. Наибольшее значение этот фактор имеет для промежуточных и конечных этапов разложения ОВ, в которых участвуют специализированные группы бактерий образующих и потребляющих эти продукты. Так, например, в кислых условиях увеличение концентрации ацетата, пропионата и тактата ингибирует активность облигатных протон восстанавливающих бактерий. При этом происходит снижение продукции ацетата и Н2 (Fukuzaki et al, 1990). Появление достаточного количества бактерий способных использовать эти кислоты восстанавливает процесс (Бонч-Осмоловская, 1979b; Beaty, Mclnemey, 1989; Fukuzaki et al, 1990). Такой же эффект оказывает и подщелачивание среды до нейтральных значений (Boone, Xun, 1987; Nacamura et al, 1991). Аналогичным образом величина рН влияет на активность метаногенов (Yavitt et al, 1987; Gorris et al, 1989; Barredo, Evison, 1991). При низких значениях рН среды ацетат ингибирует образование метана. Однако повышение рН до нейтральных значений полностью снимает эффект.
Повышение концентрации ацетата в кислых условиях практически не оказывает ингибирующего воздействия на интенсивность продукции СОг (Yavitt et al, 1987). Этот факт, по-видимому, свидетельствует о более высокой устойчивости гидролитических и ферментативных бактерий к токсичному действию органических кислот. Вместе с тем, снижение рН среды отражается на всей трофической цепи разложения ОВ. Происходит общее снижение интенсивности процессов, увеличивается продукция С4-С6 кислот, а также отмечается изменение соотношения п- и zso-соединений (Beaty, Mclnerney, 1989; Lin, Ни, 1993).
Процессы микробиологического подщелачивания среды связаны с потреблением органических кислот (включая угольную) и дезаминированием азотсодержащих соединений. При наличии освещенности, важная роль в повышении рН среды принадлежит фотосинтезирующим микроорганизмам. В некоторых водных экосистемах в моменты максимальной интенсивности фотосинтеза величина рН может достигать 9-10, что также ингибирует бактериальные процессы (Кузнецов, 1970).
Неоднозначное воздействие на бактериальные процессы оказывает сероводород. По некоторым данным H2S ингибирует анаэробное разложение жирных кислот и метаногенез (Cappenberg, 1974b; McCartney, Oleszkiewicz, 1991). Причем токсичность увеличивается при снижении рН среды (Visser et al, 1993) и снижается в присутствии ионов железа. В последнем случае эффект связан с выпадением в осадок нерастворимых в воде сульфидов (Бонч-Осмоловская и др, 1978). По другим данным он не оказывает существенного влияния на развитие метанобразующих бактерий даже в концентрации до 300 мг/л (Беляев и др, 1982). Нет данных свидетельствующих о регуляторном воздействии метана на какие-либо процессы деструкции органических веществ.
Особое значение в регуляции процессов разложения ОВ принадлежит кислороду. Для одних микроорганизмов он является незаменимым акцептором электронов, для других - крайне токсичным реагентом.
Гидролитические и ферментативные бактерии способны развиваться в широком диапазоне концентраций кислорода и значений Eh. Среди них есть не только строго аэробные и анаэробные, но также микроаэрофильные, аэротолерантные и факультативно анаэробные формы. Такие микроорганизмы выполняют в микробных сообществах роль первичных анаэробов, которые удаляют остатки кислорода из среды. При необходимости они могут начинать осуществлять процессы при повышенных концентрациях 02, постепенно снижая ее до оптимальных значений.
Методы исследования среды обитания
отбора проб температуру воды измеряли сенсорным электротермометром Prima (Португалия), кислотность среды (рН) -портативным рН-метром рНер2 (Португалия), значения общей минерализации - портативным тестер-кондуктометром TDS - 4 (Сингапур), Eh - измерителем редокс-потенциала ORP (Португалия).
Концентрацию карбонат- и гидрокарбонат-ионов определяли титриметрическим, хлорид-ионов - аргентометрическим, катионов кальция и магния - комплексонометрическим, содержание сульфат-ионов -турбидиметрическим, сульфидов - калориметрическим методами (Ананьевская, Щекатурина, 1960; Алекин и др., 1973). Концентрацию катионов натрия и калия - пламенно-фотометрическим методом на атомно-адсорбционном спектрофотометре AAC SOLAAR MG в Байкальском институте природопользования СО РАН (Методы гидрохимических исследований, 1988).Учет численности жизнеспособных клеток микроорганизмов определяли, при помощи 10-кратных последовательных разведений на элективные среды. Среды предварительно стерилизовали при 120С в течение 20 минут.
Из каждого разведения отбирали аликвоты по 0,5 см и вносили в пробирки с соответствующей жидкой средой (4,5 см ) для аэробов и по 1,0 см в жидкую среду (9,0 см) для анаэробов. Аэробные бактерии культивировали в пробирках закрытых ватно-марлевой пробкой. Культивирование анаэробов проводили в пенициллиновых флаконах закрытых резиновой пробкой. Развитие сапрофитов наблюдали по помутнению среды. Развитие целлюлолитиков учитывали визуально по разложению фильтровальной бумаги (Кузнецов, Дубинина, 1989).
Среду разливали в пробирки с стерильной металлической скрепкой доверху и закрывали резиновой пробкой. О росте сульфатредукторов судили по образованию черного налета сульфида железа на металлической скрепке, стенках пробирки, или черного осадка.
Численность сапрофитов определяли через 7 суток культивирования, сульфатредукторов — 14 суток, целлюлолитиков — 30 суток культивирования в термостате при 30С. Психрофильные микроорганизмы инкубировали в криостатепри 10С.
Морфотипы бактерий, размеры, подвижность изучали
микроскопированием образцов с помощью светового микроскопа PZO SK 14 (Польша) и "Биолам-70" в фазовом контрасте при 100-кратном увеличении объектива (общее увеличение 1250) (Романенко, Кузнецов, 1974).
Методом стекол обрастания по Холодному было изучено естественное распределение и разнообразие микроценозов в донных осадках (Методы изучения почвенных микроорганизмов, 1966).
Выделение и учет микромицетов проводили методом посева на среду Чапека с дальнейшим проведением световой микроскопии (Практикум по микробиологии, 2004). Для определения видового состава цианобактерий пробы воды и донных осадков отбирали в стерильные емкости по общепринятой методике (Водоросли..., 1989) и фиксировали 4% формалином. Микроскопирование проводили с помощью оптических микроскопов МБИ-15 (Россия), PZO (Польша) и Axiostar plus (Carl Zeiss, Германия) в проходящем свете и с иммерсией при увеличении 1000-1250 (Теппер и др., 1993). Определение таксономической принадлежности цианобактерий на основании морфологических признаков проводили по Еленкину, Голлербаху (Еленкин, 1949; Голлербах и др., 1953) и уточняли по Комареку и Анагностидису (Komarek&Anagnostidis 1999, 2007). При определении и описании видов обращали внимание на следующие характеристики: форма и окраска, наличие дополнительных образований, количество клеток в колониях, особенности ветвления, строение двигательного аппарата и т.д. Определение размеров клеток в живом и фиксированном состоянии проводили с помощью окуляр-микрометра с измерительной линейкой. Учитывались длина и ширина клеток, длина трихомов, размеры колоний, длина отростков и жгутиков и др Скорость разложения белка и целлюлозы изучали аппликационным методом in situ с помощью белкового субстрата желатины фотобумаги, целлюлозы - фильтровальной бумаги (метод Мишустина и Петровой) (Носова, Гельцер,1984; Теппер и др., 1987).
Скорость микробиологического процесса сульфатредукции, метаногенеза и темновой ассимиляции СОг определяли при помощи радиоизотопного метода (Гальченко 2001, Иванов, 1956; Сорокин, 1975; Беляев, Иванов, 1975).
При определении интенсивности сульфатредукции использовали метод Иванова (1956). Пробы донных осадков для радиоизотопных работ отбирали в стерильные флаконы, которые закрывали пробками и обжимали алюминиевыми крышками. В пробу с помощью шприца вводили 0,1 мл Naz S04 с активностью 0,1-1 мКюри и инкубировали в течение 0,4-2 суток. Фиксацию интенсивности сульфатредукции проводили путем введения в пробу 10-25% раствора ацетата Zn.
Интенсивность метаногенеза измеряли с помощью Na14HC03. Пробы фиксировали 1 мл 10 N NaOH. Образовавшийся меченый СН4 продували и сжигали до 14СС 2 при температуре 700С, улавливая газ сцинтилляционным раствором. Для определения интенсивности окисления метана во флаконы вносили - 0,1-0,5 мл 14СН4 с активностью 0,5-0,1 мкКи. После инкубации пробы фиксировали 1 мл 10 N NaOH, остаточный 14СОг отгоняли, затем приподкислении отдували в сцинтилляционный раствор с Р дифениленэтиламин.
Сезонные колебания численности различных физиологических групп бактерий - деструкторов
Определение численности физиологических групп бактерий алкалофилов в донных отложениях содового озера Белое было необходимо для оценки деятельности организмов, осуществляющих все основные этапы деструкции органических веществ от гидролиза полимеров до образования газообразных веществ. Наличие органических и минеральных веществ в водной толще и донных осадках содовых озер благоприятствует широкому распространению различных физиологических групп микроорганизмов. Высокие значения рН и минерализации в воде содового озера способствуют развитию алкалофильных групп микроорганизмов. Распространение и активность алкалофилов зависят от условий среды обитания и присутствия легкоразлагаемого органического вещества. Исследования сезонной динамики численности алкалофильных микроорганизмов в содовых озерах позволяет оценить их распространение в воде и осадках в течение года (Культова, 1999). В водной толще и донных осадках озера определена сезонная динамика численности мезофильных и психрофильных алкалофильных аэробных и анаэробных микроорганизмов. Инкубацию проб для определения численности мезофильных бактерий проводили при 30С, психрофильных бактерий - 10С.
Сезонная динамика численности мезофильных бактерий. Среди исследуемых мезофильных групп бактерий-деструкторов наиболее многочисленными были сапрофиты. В период исследований численность сапрофитных бактерий в воде и донных осадках была на 1-2 порядка выше, чем целлюлолитиков. Преобладание данной группы бактерий, скорее всего, связано с широким распространением легкогидролизуемого субстрата.
Численность сапрофитов в водной толще и донных осадках изучаемого озера на протяжении двух лет варьировала - от 10 тыс. кл/мл до 10 млн. кл/мл (рис. 6,7). В 2007 г. максимальная численность аэробных и анаэробных сапрофитов отмечена летом (10 кл/мл), минимальная для аэробов - зимой (104 кл/мл); для анаэробов - в осенне-зимний период (105 кл/мл). В 2008 году максимальная численность аэробных сапрофитов отмечена летом в июле-месяце, также как и в предыдущем году. Численность анаэробов в течение 2008 г. превышала, численность аэробов. Численность аэробных сапрофитов в 2007 году была на 1-2 порядка больше, чем в 2008 г. Накопительные культуры сапрофитных бактерий, выделенные из илов озера Белое, были представлены в основном клетками палочковидных форм с закругленными концами. Размеры клеток варьировали от 0,67 до 0, 98 мкм в длину. Палочковидные бактерии из накопительных культур в большинстве были представлены одиночными клетками.
Целлюлоза составляет в среднем 30-50% растительной массы и является основным источником углерода, поступающим в почву и озера с растительными остатками.
В природных условиях разложение целлюлозы происходит только в результате жизнедеятельности бактерий, актиномицетов и грибов, продуцирующих комплекс гидролитических ферментов - целлюлаз. Этот процесс представляет важную часть биосферного цикла углерода. В период исследований в 2007-2008 гг. количество целлюлозоразлагающих бактерий (ЦРБ) в воде и донных осадках варьировало от 10 тыс. кл/мл до 1 млн. кл/мл (рис. 8,9).
Зимой численность последних понижается до 1000 кл/мл, весной повышается на 1-2 порядка и в летних пробах достигает максимальных значений до 1 млн. кл/мл. Анализ результатов в течение двух лет исследований показал, что целлюлозоразлагающий биоценоз представлен в основном анаэробами, в 2008 году численность ЦРБ была выше на 1-2 порядка, чем в 2007 году.
