Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Сравнительная характеристика содовых и содово-соленых озер Мира с озерами Забайкалья и Монголии 8
1.2. Структура алкалофильного и галоалкалофильного микробных сообществ 17
1.3. Геохимическая роль бактерий в круговороте элементов в водных экосистемах 25
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Характеристика исследуемых озер 34
2.2. Методы отбора проб 36
2.3 Методы полевых и лабораторных исследований 37
2.4. Методы учета численности бактерий 37
2.5. Методы выделения накопительных и чистых культур 39
2.6. Методы исследования экофизиологических и биохимических характеристик 40
2.7. Методы детекции ферментативной активности 41
2.8. Оценка геохимической деятельности 42
2.9. Моделирование микробных сообществ содово-соленых озер в микрокосме 42
2.10. Определение пигментного состава клеток 43
2.11. Молекулярно-генетические методы 43
2.12. Статистические методы 43
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Физико-химические условия среды обитания микроорганизмов
3.1.1. Физико-химическая характеристика исследуемых озер 44
3.1.2. Физико-химическая характеристика воды и донных отложений оз. Соленое 46
3.1.3. Содержание Сорг в донных осадках оз. Соленое 49
3.2. Структура микробного сообщества содово-соленых озер Забайкалья и Монголии 51
3.2.1. Численность бактерий-деструкторов ОВ в донных осадках исследуемых озер 52
3.2.2. Вертикальное распределение бактерий в донных осадках оз. Соленое 54
3.3. Изучение микробного пейзажа в микрокосмах озер и in situ 56
3.4. Характеристика аэробных и факультативно-анаэробных бактерий- деструкторов ОВ, выделенных из содово-соленых озер Забайкалья и Монголии 60
3.4.1. Морфологическая характеристика культур 61
3.4.2. Эколого-физиологическая характеристика культур 66
3.4.3. Биохимическая характеристика культур 71
3.4.4. Ферментативная активность культур 74
3.4.5. Генотипическая характеристика 76
3.5. Краткая характеристика выделенных культур 78
3.6. Описание новых родов и видов выделенных микроорганизмов 86
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 100
ВЫВОДЫ 107
ЛИТЕРАТУРА 108
ПРИЛОЖЕНИЯ
- Сравнительная характеристика содовых и содово-соленых озер Мира с озерами Забайкалья и Монголии
- Характеристика исследуемых озер
- Физико-химические условия среды обитания микроорганизмов
Введение к работе
Содовые и содово-соленые озера широко распространены в аридных зонах. Они представляют собой уникальные экосистемы, в которых экстремально высокие значения рН сочетаются с высокими концентрациями солей вплоть до насыщающих (Sadler et al., 1980; Vreeland et al, 1987).
Исследование разнообразия микробных сообществ представляет значительный интерес для понимания функционирования содовых озер как отдельного типа экосистем.
В настоящее время в содовых озерах мира выявлены и описаны представители основных функциональных групп, принципиально различающихся в отношении использования органического вещества (ОВ) и свободного кислорода:
- продуцентов - цианобактерий и пурпурных бактерий (Дубинин и др.,
1995; Герасименко и др, 1996; Брянцева и др. 1999, 2000);
- деструкторов (консументов), включающих аэробных и анаэробных
органотрофных бактерий (Tindall, 1988; Jones et al, 1998; Заварзин и др.,
1999);
- вторичных анаэробов, замыкающих циклы углерода и серы (Жилина и др.,
1998);
- бактерий «аэробного фильтра», окисляющих газы биогенного и
абиогенного происхождения (Сорокин и др., 2001; Калюжная и др., 1998).
В содовых озерах Забайкалья и Монголии в течение последних 10 лет исследуются биоразнообразие и функционирование микробных сообществ (Намсараев и др., 1999; Горленко и др., 1999; Банзаракцаева, 2002. Sorokin et al., 2003). В деструкции ОВ предполагается важная роль аэробных процессов, о чем свидетельствуют высокая численность аэробных органотрофов 105-106 кл/мл и значительная скорость аэробной деструкции в донных отложениях озер Забайкалья. Из проб воды, микробных матов и донных осадков выделены новые роды и виды представителей высокоспециализированных
групп бактерий: пурпурных, метанотрофных, сероокисляющих, а также анаэробных алкалофилов (Сорокин и др., 2001; Ешинимаев и др., 2001; Жилина и др., 2004). Вместе с этим таксономическое разнообразие бактерий, выполняющих деструкцию органического вещества в аэробных зонах содово-соленых озер Забайкалья, практически не изучено.
Целью работы явилось определение разнообразия доминирующих аэробных и факультативно-анаэробных органотрофных алкало- и галофильных бактерий в донных осадках содовых и содово-соленых озер Забайкалья и Монголии.
Задачи исследования:
Изучить физико-химические условия обитания бактерий в исследуемых озерах;
Определить численность аэробных и анаэробных бактерий-деструкторов органического вещества;
Выделить доминирующих при культивировании представителей бактерий, осуществляющих разложение органического вещества в аэробных условиях, исследовать экофизиологические и физиолого-биохимические свойства;
Определить таксономическое положение выделенных бактерий;
Установить роль выделенных доминирующих и новых бактерий в функционировании микробного сообщества.
Научная новизна и практическая значимость.
Впервые изучено таксономическое разнообразие аэробных и факультативно-анаэробных бактерий содовых озер Забайкалья. Показано, что выделенные штаммы являются гало- и алкалофильными/толерантными организмами, способными осуществлять деструкцию органического вещества при смене экологических условий в экосистеме: распреснении или
концентрировании солей, изменении рН, смене окислительно-восстановительной обстановки.
Специфичность исследованных водных экосистем по микробиоте подтверждается наличием новых форм выделенных микроорганизмов. Впервые из содовых озер выделены в культуру и описаны облигатно аэробные алкалотолерантные и галотолерантные представители семейства Flexibacteriaceae, определенные как новые роды и виды с предложенными названиями "Lyalikoviella elongate" gen. nov., sp. nov. и "Sanguinoglea alkalitolerans" gen. nov., sp. nov.
Полученные результаты расширяют представления о разнообразии и экологическом значении бактерий в экстремальных природных экосистемах. Выделенные штаммы представляют интерес для биотехнологии, как продуценты ферментов, устойчивых к высоким значениям рН и минерализации.
Апробация работы. Материалы диссертации были апробированы в виде докладов на Межрегиональной научно-практической конференции «Биоразнообразие микроорганизмов Восточно-Сибирского региона и их научно-практическое использование» (Иркутск, 2004), научно-практической конференции «Научный и инновационный потенциал Байкальского региона глазами молодежи» (Улан-Удэ, 2004, 2005 гг.), Всероссийской конференции с международным участием «Биоразнообразие экосистем Внутренней Азии» (Улан-Удэ, 2006).
Публикации. По результатам исследований опубликовано 14 научных работ. Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 146 страницах машинописного текста и включает 22 рисунка и 21 таблиц. Диссертация состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Экспериментальная часть», «Обсуждение», «Выводы», «Список
литературы», включающий в себя 81 отечественных и 107 зарубежных источников и «Приложение».
Благодарности. Автор выражает глубокую признательность за общее научное руководство научному руководителю к.б.н. Л.П. Козыревой, научному консультанту д.б.н., проф. М.Б. Вайнштейну.
Автор выражает благодарность заведующему лабораторией «Экологии и геохимической деятельности микроорганизмов» ИНМИ РАН д.б.н. В.М. Горленко и сотрудникам данной лаборатории к.б.н. З.Б. Намсараеву за советы и помощь в освоении методик, Е.Н. Болдаревой за предоставление штамма Nu, сотрудникам ИНМИ РАН к.б.н. A.M. Лысенко, Г.А. Осипову, Е.С. Бариновой за помощь на отдельных этапах работы, к.б.н. В.Н. Акимову (ИБФМ РАН), а также заведующему лабораторией микробиологии ИОЭБ СО РАН д.б.н., проф. Б.Б. Намсараеву и сотрудникам данной лаборатории за помощь в работе и поддержку.
Работа выполнена при финансовой поддержке грантов Президиума РАН «Происхождение и эволюция биосферы», Президиума СО РАН № 24, УрО и СО РАН «Микробные сообщества экстремальных экосистем», Минобразования науки РНП. 2.1.1.4566, Минобразования РФ Е02-6.0-294, Президиума СО РАН № 170 и Минобразования РФ 07.01.474.
Сравнительная характеристика содовых и содово-соленых озер Мира с озерами Забайкалья и Монголии
Содово-соленые озера встречаются во всех аридных зонах нашей планеты и почти на всех континентах:
- Африка (Ливия, Египет, Эфиопия, Кения, Судан, Танзания, Чад, Уганда);
- Евразия:
1) Европа (Италия, Венгрия, Россия (район Каспийского моря));
2) Азия (Забайкальский регион, Кулундинская долина, Монголия, Корея, Китай, Турция, Индия, Армения);
- Северная Америка (Канада, США: штаты Калифорния, Невада, Орегон, Вайоминг);
- Австралия (юго-запад материка).
Впервые комплексное микробиологическое исследование содовых озер было проведено Б.Л. Исаченко в 1930-х гг. в содовых озерах Кулундинской степи (Прииртышье), включающие низкоминерализованные с рН 8,5 и высокоминерализованные с рН 9,5-11,6 (Исаченко, 1931, 1951).
Геохимические и гидрологические особенности содовых озер Мира рассмотрены рядом авторов, и их характеристики приведены в обзорах и экспериментальных статьях (Малышев, 1927; Франк-Каменецкий, 1932; Дзенс-Литовский, 1967; Борисенко, Замана, 1978; Иванов, 1997; Исаченко, 1934, 1951; Дзюба, 2002; Grant, Tindall, 1986; Jenkins, 1932; Euqster, 1970; Javor, 1989; Oren, 2002).
Наиболее исследованными являются аталассофильные озера Африканского Рифта и Северной Америки (Jenkins, 1932; Euqster, 1970; Grant, Tindall, 1986; Javor, 1989; Oren, 2002).
Содовые озера Восточно-Африканского Рифта, расположены в тропической зоне, где тектоническая активность создала серию мелких депрессий. В части Кения-Танзания основная подстилающая порода состоит из щелочных трахитных лав, уложенных во время плювиальной фазы, бывшей около 10 тыс. лет назад. Эти лавы содержат большое количество
Na2C03 и крайне мало Са и Mg (Grant et al., 1990;). Диапазон общей солености изменяется от 5 % в таких озерах как Богория, Элементейта, Накуру и др., до насыщения (30% и более) в таких озерах, как Магади и Натрон. рН в озерах варьирует от 10 до 11.5. №гСОз и NaCl находятся в соотношении 2:1. В зависимости от минерализации они создают более или менее мощную буферную систему. Также в значительных количествах присутствует К+ (5-200 мМ). Концентрация сульфата сильно варьирует в разных озерах. Особенностью этих озер является то, что их общая соленость изменяется в зависимости от сезонных погодных условий, хотя рН остается примерно на одном уровне.
Группа озер Вади-эль-Натрум расположены на территории Египта, к западу от дельты реки Нила. Озера занимают тектоническую трещину, углубленную древней речной эрозией и дефляцией. Значения рН варьируют от 8,5 до 9,5, минерализация составляет 283-540 г/л. Доминирующие в химическом составе воды ионы - сульфаты, хлориды, карбонаты и натрий. Вода характеризуется как хлоридная или сульфатная. Озеро Вади-эль-Натрум представляет собой классический тип содового озера, значения рН которого более 9. В настоящее время в этом озере происходит осаждение троны и ведется ее добыча. Гидрохимия и геохимия озер Вади-эль-Натрум хорошо изучена (Imhoff, 1978; Boone, 1982; Taher, 1999; Shortman, 2004).
Следующим уникальным водоемом является озеро Магади (Кения). В этом африканском озере происходит современное осаждение соды. Гидрохимия этого озера также подробно изучена (Eugster, 1970). Характерной особенностью озера является высокое значение рН 10-11, высокая концентрация NaCl и ЫагСОз (суммарная соленость до 30%) при полном отсутствии ионов кальция и магния. Но в разные сезоны, как общее содержание этих компонентов, так и их соотношения могут меняться. В засуху происходит засоление и выпадение троны (Na2C03 х ЫаНСОз х 2Н20), в сезон дождей - распреснение.
В Северной Америке расположено озеро Биг Сода Лейк. Это меромиктический водоем, где значение рН воды достигает 9,7. Придонные воды этого озера содержат около 500 мг/л сульфидов, 50 мг/л аммония, 6,5 г/л сульфата и 1,2 мл/л метана (Oremland, 1982).
В Европе содово-соленые озера встречаются на территории Украины, Белоруссии, Калмыкии. Самым крупный содовый водоем Европы - озеро Червонное (Белоруссия), где рН воды составляет 9,0 - находится в центральной части Припятского Полесья. Экосистема данного озера складывалась в условиях мелководности котловины (максимальная глубина составляет 2,9 м, средняя - 0,7 м) и большой площади (40 км2). Водный режим озера не стабильный и зависит от климатических условий.
На Азиатском континенте содовые озера встречаются в Северном Казахстане, Западной и Восточной Сибири, Туве, Монголии и Китае.
Характеристика исследуемых озер
Объектами исследования явились содовые озера Забайкалья и Монголии: Соленое, Нухэ-Нур, Безымянное, Алгинское (Бурятия), Хилганта, Горбунка (Агинский Бурятский автономный округ), Долоон Давст Нуур (Монголия) (рис.1). Микробиологические и гидрохимические исследования проведены с 2003 по 2006 гг. Фотографии озер даны в приложении 1.
Озеро Соленое (Киран) (координаты 50 35 757" с.ш. 105 44 228" в.д.), находится в Кяхтинском районе Республики Бурятия в долине реки Киран на высоте 612 м над уровнем моря. Озеро расположено в 30 км восточнее г. Кяхты и окружено горно-степным ландшафтом. Площадь водного зеркала составляет 0,36-1 кв. км, глубина - 2,5-Зм. На базе гидроминеральных ресурсов озера функционирует Киранская грязелечебница, являющаяся курортом республиканского значения. В качестве лечебных факторов используется гидрокарбонатно-хлоридная натриевая рапа и иловая сероводородная грязь.
Озеро Хилганта (50 42 535" с.ш., 115 06 086" в.д.) расположено в мелкосопочной степной зоне Южного Забайкалья на водоразделе между реками Онон и Ага на высоте 668 м над уровнем моря в 8 км к северу от села Кункур Агинского Бурятского автономного округа. Озеро округлой формы, чуть вытянуто с северо-востока на юго-запад. Максимальные размеры озера 150 х 120 м, общая площадь водного зеркала составляет 1,8 кв. км, максимальная глубина 0,7-0,8 м. В зависимости от метеорологических условий глубина озера изменяется. В засуху на акватории озера остаются отдельные лужи, глубина которых составляет 0,05-0,10 м. В период дождей озеро с северной стороны частично опресняется. Дно озера блюдцеобразное и илистое. Поверх ила дно покрыто кожистым циано-бактериальным матом толщиной до 20-30 мм с хорошо выраженной слоистостью. Вода в озере соленая и прозрачная. Водно-солевое питание озеро получает за счет атмосферных осадков и вод поверхностного стока.
Озеро Горбунка (50 39 835" с.ш., 115 04 498" в.д ), расположено в 12 км к северу от села Кункур недалеко от оз. Хилганта на высоте 673 м над уровнем моря. Глубина озера 2,1м, общая площадь водного зеркала 8 кв.км. Озеро имеет овальную форму и блюдцеобразное дно, покрытое черным восстановленным илом. Черный ил до 15-20 см имеет маслянистую консистенцию с разрывами газа и растительными остатками, ниже серый маслянистый ил без разрывов газа и растительности.
Озеро Долоон Давст Нуур (46 51 185" с.ш., 104 36 839" в.д.). Относится к центральной группе озер Республики Монголия. Находится на территории Тов аймага, в 300 км от г.Улаан-Баатар, на высоте 1435 м над уровнем моря. Глубина озера 0,85 м., площадь водного зеркала 18 кв. км..
Озеро Нухэ-Нур (54 01 912" с.ш., 110 16 776" в.д.). Площадь водного зеркала составляет около 4 кв. км. Находится в Курумканском районе в 15 км от с. Барагхан. Располагается в надпойменном понижении на степном участке долины по правому берегу реки Баргузин. Сульфатно-натриевый тип воды. Озеро Безымянное (рН 9.5, ОМ 17-20 г/л) расположено в Баргузинском районе.
Озеро Алгинское (рН 9.62, ОМ 45-50 г/л) расположено в нижнем бассейне р. Баргузин, в 3 км севернее с. Алга. Площадь озера составляет 1,04 кв. км глубина 1,3 м. Относится к типу солоноватых озер евтрофного типа. Сульфатно-гидрокарбонатный натриевый тип воды.
Для микробиологических исследований пробы воды, донных осадков и микробных матов отбирали в стерильную посуду. Для проведения химических исследований пробы фиксировали сразу после отбора проб. До проведения анализов пробы хранили в темноте при температуре in situ или в холодильнике. Отбор проб осадков из оз. Соленое по горизонтам с целью получения структурно-ненарушенных слоев ила проводили при помощи пластиковой бутыли со срезанным дном. Отбор колонок высотой 10, 15 и 20 см проводили с северо-восточного побережья озера с глубины 0,5 м.
В полевых условиях определение физико-химических параметров воды в местах отбора проб проводили с помощью портативных приборов. Кислотность среды (рН) измеряли рН-метром рНер2 (Португалия), значения общей минерализации - тестер-кондуктометром TDS-4 (Сингапур), Eh -измерителем редокс-потенциала ORP (Португалия). Температуру воды и осадков определяли ртутным или сенсорным электротермометром Prima (Португалия). Концентрацию карбонат- и гидрокарбонат-ионов определяли титриметрическим методом; растворенный кислород определяли методом Винклера (Резников и др., 1970).
В лабораторных условиях определяли: турбидиметрически с BaSC 4 сульфаты, аргентометрическим методом Мора - хлориды (Аринушкина, 1970), колориметрически с парафенилендиамином - сульфиды (Triiper, Schlegel, 1989). Концентрации ионов Na+ и К+ определены с помощью атомно-абсорбционного спектрометра SOLAAR Мб (США), Са был определен комплексометрическим методом с Трилоном Б в присутствии мурексида, Mg - по разнице между результатами титрования суммы Са и Mg в присутствии эриохрома и результатов определения Са (Резников и др., 1970).
Органический углерод в осадках анализировали методом мокрого сжигания по Тюрину (Аринушкина, 1961). Белок определяли по методу Лоури (Lowry et al., 1951), углеводы - фенолсернокислым методом Дюбуа (Орлов Д.С., Гришина А.А. Практикум по химии, 1981).Оптическую плотность измеряли на фотоэлектрокалориметре КФК-20 (Россия) и спектрофотометре CECIL-CE1021 (Великобритания).
Физико-химические условия среды обитания микроорганизмов
Исследованные содовые озера Забайкалья и Монголии являются мелководными водоемами и имеют относительно малую площадь (табл. 1).
В период исследований температура воды варьировала от 22 до 27 С. Щелочная рН воды большинства озер (от 9,1 до 9,9) создается за счет высоких концентраций ионов НСОз" и СОз2", концентрация которых варьировала в пределах 1,37-4,76 г/л и 0,3-3,4 г/л соответственно. В озере Долоон Давст Нуур рН воды была нейтральной (7,7). Определение основных ионов в воде этого озера не проводилось. Измеренная минерализация воды варьирует от 5,6 до 320 г/л. По классификации Валяшко, по минерализации вод озера Соленое, Горбунка, Нухэ-Нур, Безымянное относятся к солоноватым (сумма солей 1,0-25,0 г/л), озера Хилганта и Алгинское к соленым (26-50 г/л), озеро Долон Давст Нуур к рассольным (свыше 50 г/л).
Максимальное значение окислительно-восстановительного потенциала (Eh) определено в оз. Соленое. В остальных озерах Eh варьировал от +59 мВ до +97мВ. Растворенный кислород присутствовал в концентрации от 4,48 до 6,2 мг/л. В насыщении воды содовых озер кислородом основная роль принадлежит цианобактериям и водорослям. Дефицит кислорода создается за счет снижения его растворимости при повышении температуры и потребления кислорода в окислительных процессах, осуществляемых аэробными организмами.
Максимальное количество карбонатов и гидрокарбонатов было зарегистрировано в озере Нухэ-Нур - 3,24 и 4,56 г/л, минимальное - в оз. Горбунка - 0,3 и 2,5 г/л. Во всех исследованных озерах наблюдается преобладание содержания гидрокарбонатов над карбонатами, за исключением оз. Хилганта.
Максимальное количество сульфатов обнаружено в воде озера Алгинское - 25,69 г/л. В озерах Горбунка, Соленое и Нухэ-Нур концентрация сульфатов варьирует от 0,1 до 0,58 г/л. Содержание ионов хлора составляет 0,034-0,39 г/л. Наибольшая концентрация С1 зафиксирована в оз. Хилганта (13,8 г/л).
Таким образом, исследовались озера ряда: 1) высокий рН и низкая минерализация (Соленое, Нухэ-Нур, Горбунка), 2) высокий рН и минерализация 40-50 г/л (Хилганта, Алгинское) и 3) нейтральный рН и высокая минерализация (Долон Давст Нуур).
Следует отметить, что гидрохимические исследования озер Хилганта, Горбунка, Нухэ-Нур, проводились и ранее (Кулырова, 1999, Банзаракцаева, 2002). Сведения о химии воды оз. Соленое отсутствовали, несмотря на имеющуюся оценку рапы и иловых отложений озера (Михайлов, Толстихин, 1946). Кроме того, озеро представляет собой тип непересыхающих содовых водоемов, встречающихся в Забайкалье. В связи с этим в озере Соленое было выполнено определение гидрохимических характеристик по глубине водной толщи озера, определение концентрации и компонентного состава органического вещества в донных отложениях (таблица 2).
Значения рН варьировали в пределах 0,3 единицы (9,6 - 9,9). Увеличение минерализации воды, отмеченное к придонным горизонтам (рис. 2А), коррелировало с увеличением концентрации анионов (С03 , S04", CI , S ) и катионов (Са + и Na+ + К+). По глубине водной толщи концентрации ионов изменялись скачкообразно. Преобладающим анионом являлся гидрокарбонат, катионами - натрий и калий, что типично для большинства содовых озер Забайкалья (таблица 2).
Концентрация кислорода до глубины 2 м варьировала от 4,8 до 4,2 мг/л, а затем резко снижалась к придонному слою (рис. 2Б). Концентрация сероводорода, наоборот, к придонному слою увеличивалась. Максимальная концентрация сероводорода (72 мг/л) в придонном слое воды озера, отобранного с глубины более 2,5 м, была зафиксирована в июне 2004 г. Окислительно-восстановительный потенциал снижался от +177 мВ в поверхностном слое до +119 мВ на глубине двух метров и был выше, чем в других озерах Забайкалья в летний период (Кулырова, 1999).
