Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Исторический очерк исследований энтомопатогенных нематод и их симбиотических бактерий
1.1. Основные компоненты и особенности комплекса «энтомопатогенные нематоды –симбиотические бактерии »
1.1.1. Особенности организации энтомопатогенных нематод и их положение в системе нематод
1.1.2. Жизненный цикл энтомопатогенных нематод
1.1.2.1. Особенности жизненного цикла штейнернематид
1.1.2.2. Особенности жизненного цикла гетерорабдитид
1.1.2.3. Сравнительный анализ адаптаций штейнернематид и гетерорабдитид
1.1.3. Применение в сельском хозяйстве
1.2. Таксономическое разнообразие энтомопатогенных нематод
1.3. Таксономия бактерий, симбиотически связанных с энтомопатогенными нематодами
1.3.1. Неспецифические бактерии энтомопатогенных
нематод
1.4. Современные представления о функциональных механизмах симбиотической системы «энтомопатогенные нематоды-бактерии»
1.4.1. Основные особенности симбиоза энтомопатогенных нематод и бактерий
1.4.2. Смена фаз в развитии симбиотических бактерий энтомопатогенных нематод
1.4.3. Генетические основы подавления симбиотическими бактериями иммунной системы насекомого-хозяина
1.4.4. Адаптации, обеспечивающие функционирование симбиотической системы «энтомопатогенные нематоды - симбиотические бактерии»
1.4.4.1. Адаптации, обеспечивающие перенос клеток симбиотических бактерий энтомопатогенными нематодами
1.4.4.2. Бактериальные гены, требуемые для колонизации
Глава 2. Материалы и методы иследования 51
2.1. Изучение таксономического разнообразия энтомопатогенных нематод 51
2.1.1. Выделение новых изолятов энтомопатогенных нематод 52
2.1.2. Определение таксономической принадлежности энтомопатогенных нематод 56
2.1.3. Изучение тонкой морфологии поверхности нематод 57
2.1.4. Изучение морфологии энтомопатогенных нематод 58
2.2. Получение нуклеотидных последовательностей энтомопатогенных нематод 59
2.2.1. Проведение полимеразной цепной реакции 60
2.2.2. Очистка полученных продуктов ДНК 62
2.2.3. Метод векторного клонирования 64
2.3. Изучение таксономического состава симбиотических бактерий 65
2.3.1 Выделение чистой культуры микроорганизмов 67
2.4. Получение нуклеотидных последовательностей бактерий 71
2.4.1. Приготовление неочищенного бактериального экстракта для ПЦР 71
2.4.2. Амплификация с помощью ПЦР 16S ДНК 72
2.4.3. Очистка продуктов ПЦР 74
2.5. Хранение культуры симбиотических бактерий 77
Глава 3 Результаты изучения симбиотических пар энтомопатогенная нематода – бактерия 79
3.1 Исследованные виды энтомопатогенных нематод семейства Steinernematidae и их симбиотические бактерии 79
3.1.1. Steinernema arenarium (Artyukhovsky, 1967) Wouts, Mracek, Gerdin, Bedding, 1982 79
3.1.2. Изученные изоляты Steinernema bicornutum Talossi, Peters, Ehlers, 1995 81
3.1.3. Steinernema carpocapsae (Weiser, 1955) Wouts, Mracek, Gerdin, Bedding, 1982 82
3.1.4. Изученные изоляты Steinernema ceratophorum Jian, Reid, Hunt, 1997 84
3.1.5. Steinernema cholashanense Nguyen, Puza, Mrcek, 2008 85
3.1.6. Steinernema costaricense Uribe-Loro, Mora, Stock, 2007 86
3.1.7. Steinernema everestense Khatri-Chhetri, Waeyenberge, Spiridonov, Manandhar, Moens, 2011
3.1.8. Изученные изоляты Steinernema feltiae (Filipjev, 1934) Wouts, Mracek, Gerdin, Bedding, 1982
3.1.9. Изученные изоляты Steinernema kraussei (Steiner, 1923) Travassos, 1927
3.1.10. Steinernema monticolum Stock, Choo, Kaya, 1997
3.1.11. Steinernema schliemannii Spiridonov, Waeyenberge, Moens, 2010
3.1.12. Steinernema siamkayai Stock, Somsook, Reid, 1998
3.2. Исследованные энтомопатогенные нематоды, не определенные до вида, и их симбиотические бактерии
3.3. Исследованные виды энтомопатогенных нематод семейства Heterorhabditidae и их симбиотические бактерии
3.3.1. Heterorhabditis megidis Poinar, Jackson, Klein, 1987
3.4. Выделение чужеродных (не симбиотических бактерий) из энтомопатогенных нематод
Глава 4. Анализ филогенетических отношений изученных энтомопатогенных нематод и их симбиотических бактерий
4.1. Филогенетические взаимоотношения изученных энтомопатогенных нематод выделенных из точек изолятов
4.1.1. Анализ филогенетических взаимоотношений изученных изолятов энтомопатогенных нематод рода Steinernema
4.1.2. Анализ филогенетических взаимоотношений изученных изолятов энтомопатогенных нематод рода Heterorhabditis
4.1.3. Генетическая близость, различных географических энтомопатогенных нематод
4.2. Филогенетические взаимоотношения изученных штаммов бактерий, выделенных из энтомопатогенных нематод
4.2.1. Анализ филогенетических деревьев симбиотических бактерий рода Xenorhabdus, построенных по последовательностям 16S
4.2.2. Анализ филогенетических деревьев симбиотических бактерий рода Xenorhabdus, построенных по последовательностям гена RecA
4.2.3. Анализ филогенетических деревьев симбиотических бактерий рода Xenorhabdus, построенных по последовательностям гена SerC
4.2.4. Анализ филогенетических деревьев симбиотических бактерий рода Photorhabdus, построенных по последовательностям 16S
4.2.5. Нуклеотидные различия между штаммами симбиотических бактерий рода Xenorhabdus
4.2.5.1. Нуклеотидные различия между штаммами Xenorhabdus bovienii по последовательности 16S ДНК
4.2.5.2. Нуклеотидные различия между штаммами видов Xenorhabdus: X. kozodoii, X. stockiae, X. ehlersii, X. griffinae и X. budapestensis по последовательности 16S ДНК
4.2.5.3. Нуклеотидные различия между штаммами видов Xenorhabdus: X. nematophila, X. miraniensis, X. szentirmai, X. mauleonii, X. doucetiae, X. beddingii, X. cabanillasi, X. hominickii, X. koppenhoeferi и X. japonica по последовательности 16S ДНК
4.2.5.4. Нуклеотидные различия между штаммами вида Xenorhabdus bovienii по гену RecA
4.2.5.5. Нуклеотидные различия между штаммами видов Xenorhabdus: X. stockiae, X. budapestensis, X. japonica, X. beddingii, X. ehlersii, X. griffiniae, X. romanii, X. kozodoii по гену RecA
4.2.5.6. Нуклеотидные различия между штаммами видов Xenorhabdus bovienii, X. budapestensis, X. stockiae, X. kozodoii по гену SerC
4.2.6. Анализ нуклеотидных данных по штаммам симбиотических бактерий энтомопатогенных нематод
4.2.7. Специфичность симбиотической связи между энтомопатогенными нематодами и их бактериями
Заключение
Выводы
Список использованной литературы
- Основные компоненты и особенности комплекса «энтомопатогенные нематоды –симбиотические бактерии
- Изучение таксономического разнообразия энтомопатогенных нематод
- Исследованные виды энтомопатогенных нематод семейства Steinernematidae и их симбиотические бактерии
- Филогенетические взаимоотношения изученных энтомопатогенных нематод выделенных из точек изолятов
Введение к работе
Актуальность исследования. Актуальность проблемы исследования определяется, в первую очередь, значительным интересом к симбиотическому комплексу «энтомопатогенные нематоды – симбиотические бактерии», как к уникальному продукту биологической эволюции. Эти две группы организмов с хорошо прослеживаемыми филетическими связями с другими обитателями почвы, сформировали надорганизменную систему, вступающую в совершенно особые трофические отношения с другими компонентами экосистем (Hunt, 2007). Особый интерес представляет факт двукратного, или даже трёхкратного, с учётом патогенных для наземных моллюсков нематод рода Phasmarhabditis, возникновения в эволюции таких трофических отношений между нематодами и беспозвоночными-хозяевами (Poinar, 1994). Также в пользу актуальности проведенной работы говорит факт широкого использования энтомопатогенных нематод в качестве агентов биологического метода борьбы с вредителями. Применение биопрепаратов на основе нематод в нашей стране не достигло уровня Западной Европы и США, однако изучение биологических особенностей симбиоза энтомопатогенных нематод и их бактерий может способствовать развитию их практического применения и в нашей стране. Так, понимание разнообразия симбиотических бактерий есть необходимая предпосылка к массовой наработке энтомопатогенных нематод, поскольку методы культивирования предполагают использование чистых культур симбиотических микроорганизмов (Gaugler, Han, 2002). Необходимо отметить, что разнообразие симбиотических бактерий родов Xenorhabdus и Photorhabdus на территории Российской Федерации ранее не исследовалось.
Цели и задачи исследования. Целью наших исследований было
изучение специфичности связи энтомопатогенных нематод с их
симбиотическими бактериями, а также реконструкция эволюционной истории
взаимоотношений между этими бактериями и переносящими их нематодами семейств Steinernematidae и Heterorhabditidae.
В задачи исследования входило выделение новых культур почвенных
энтомопатогенных нематод, их культивирование и молекулярно-
таксономическое определение. Также мы выделяли из энтомопатогенных нематод симбиотических бактерий и исследовали их микробиологическими и молекулярными методами. На основании этих исследований проводилось видовое определение симбиотических бактерий. Данные молекулярно-филогенетического анализа взаимоотношений самих энтомопатогенных нематод, а также их симбиотических бактерий использовали для определения уровня специфичности взаимосвязи этих организмов и путей их ко-эволюции.
Научная новизна. На территории Российской Федерации в различных
регионах: на Северном Кавказе, Поволжье, Якутии было выделено 14 культур
почвенных энтомопатогенных нематод. Было проведено таксономическое
определение этих культур. Полученные от других исследователей 22 культуры
почвенных энтомопатогенных нематод из Болгарии, Великобритании, Непала,
Кореи, и Китая нами были определены морфологическими и молекулярно-
таксономическими методами. Были выделены чистые культуры
симбиотических бактерий от 37 культур энтомопатогенных нематод, в том
числе от 11 лабораторных культур, выделенных на территории Российской
Федерации. Проведено молекулярно-таксономическое определение этих
бактерий. Проведён молекулярно-филогенетический анализ таксономического
положения обнаруженных в процессе исследований энтомопатогенных нематод
и выделенных из них бактерий. На основании молекулярных данных по трём
фрагментам ДНК проведён филогенетический анализ взаимоотношений,
выделенных нами и ранее описанных бактериальных штаммов, а также
специфичности взаимоотношений энтомопатогенных нематод и
симбиотических бактерий.
Теоретическое и практическое значение работы.
Полученные нами молекулярно-таксономические данные по нескольким видам почвенных энтомопатогенных нематод дополняют существующие представления о разнообразии этих организмов на территории Российской Федерации и других стран. Сведения, собранные о специфичности взаимоотношений энтомопатогенных нематод и их симбиотических бактерий, дают дополнительный материал для понимания их ко-эволюции и самого феномена возникновения таких симбиотических отношений. Выделенные и сохраняемые штаммы симбиотических бактерий сами по себе могут составлять объект биотехнологических исследований, направленных на разработку новых методов культивирования энтомопатогенных нематод и использования полезных свойств их симбиотических бактерий.
Депонирование нуклеотидных последовательностей нематод и бактерий в Генбанке (NCBI GenBank) представляет собой вклад в создание всемирной базы данных, обеспечивающей надежное определение этих живых организмов.
Апробация работы. Материалы данного исследования были
представлены на 2-м международном симпозиуме по энтомопатогенному и
микробиологическому контролю в Мугле, Турция в 2009 г., на международной
научной конференции «Теоретические и практические проблемы
паразитологии» в Москве в 2010 г., на 9-м симпозиуме Российского общества нематологов с международным участием в Петрозаводске в 2011 г., на 7-ой молодежной школе-конференции с международным участие «Актуальные аспекты современной микробиологии» в Москве в 2011 г., на Международной научной конференции «Современные проблемы общей паразитологии» в Москве, в 2012г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи в международных рецензируемых журналах, включённых в базу Web of Science, одна публикация в региональном журнале, входящем в список изданий, рекомендованных
ВАК, а также 5 публикаций в других изданиях (материалы научных совещаний и симпозиумов).
Положения, выносимые на защиту.
Уровень специфичности взаимоотношений между симбиотическими бактериями и переносящими их нематодами существенно различается между отдельными эволюционными линиями энтомопатогенных нематод.
Симбиоз энтомопатогенных нематод разных эволюционных линий с
микроорганизмами одного бактериального вида может быть объяснён
«горизонтальным» переносом симбионтов.
Территория Российской Федерации отличается низким уровнем биологического разнообразия энтомопатогенных нематод (9 видов, в том числе 2 неописанных) и ещё более низким уровнем разнообразия их симбиотических бактерий.
Структура и объём работы. Диссертация изложена на 240 страницах текста и подразделена на введение, 4 главы, заключение и выводы. Диссертация иллюстрирована 46 фотографиями, полученными в сканирующем электронном и световом микроскопе. В текст включено 11 таблиц.
Благодарности. Автор глубоко признателен своему научному руководителю
Сергею Эдуардовичу Спиридонову за всестороннюю поддержку и ценные
замечания при выполнении и подготовке рукописи. Мы приносим свою искреннюю
благодарность всем коллегам, предоставившим нам живые культуры
энтомопатогенных нематод для исследований: д-ру Денису Градинарову, главному ассистенту, доктору кафедры зоологии и антропологии биологического факультета Софийского Университета «Св. Климент Охридски» в Болгарии; д-ру Хари Бахадуру Кхатри-Четри из Министерства сельского хозяйства Непала; д-ру Ма Жуан из Академии сельского хозяйства провинции Хэбей в Китае; д-ру Миншаду Ансари из Университета Суонси в Уэльсе, Великобритания; д-ру Франсуазе Николь Нго Канга из Исследовательского центра сельского хозяйства Камеруна; гг. Владимиру Кочеткову, Сергею Климову и Марианне Щетининой, сотрудникам ООО
«Биоранта»; д-ру Сольвейг Хаукеланд-Салинас из Института «Биофорск» Министерства сельского хозяйства Норвегии и д-ру Нгуену Ба Хыонгу из Университета Флориды в Гейнсвилле.
Основные компоненты и особенности комплекса «энтомопатогенные нематоды –симбиотические бактерии
Между бактериями и нематодами в природе устанавливаются отношения различные по своей сути: от использования нематодами бактерий в качестве источника пищи или нападения бактерий на живых нематод (как это, например, делают Pasteuria) до сложных случаев симбиоза. Одним из ярких примеров симбиотических отношений являются таковые между энтомопатогенными нематодами и их симбиотическими бактериями. Энтомопатогенные нематоды распространены на всех континентах кроме Антарктики (Klein, 1990) и могут считаться одним из важных компонентов почвенной биоты.
Взаимоотношения бактерий рода Xenorhabdus Thomas & Poinar, 1979 и Photorhabdus Boemare, Akhurst & Mourant, 1993 с нематодами семейств Steinernematidae и Heterorhabditidae (соответственно) могут быть охарактеризованы как мутуалистические (Koppennhofer, 2007). Ниже дан очерк разнообразия нематодно-бактериальных комплексов и анализ некоторых адаптивных механизмов, обеспечивающих этот симбиоз.
Энтомопатогенные нематоды (семейства Steinernematidae и Heterorhabditidae) относятся к отряду Rhabditida. Ранее этот отряд объединял по большей части почвенных сапробиотических нематод (Парамонов, 1964, Малахов, 1986), однако ревизия нематод на основе молекулярно-филогенетического анализа, проведенная П. Де Леем и М. Блакстером (De Ley, Blaxter, 2002), завершилась объединением всех нематод бывшего подкласса Secernenetea в составе единственного отряда Rhabditida. С высокой степенью надежности сравнительный молекулярно-филогенетический анализ показал (Blaxter et al., 1998), что штейнернематиды несколько напоминают по нуклеотидному составу свободноживущих панагролаймид (Panagrolaimidae), но ближайшими их родственниками являются нематоды семейства Alloionematidae и yloididae. Эти семейства были объединены в рамках одного инфраотряда Panagrolaimomorpha. Представители другого семейства энтомопатогенных нематод – Heterorhabditidae, оказались близкими родственниками типичных рабдитид – т.е. представителей типового семейства Rhabditidae. Интересно, что в ближайшем родстве с этими двумя семействами оказываются многочисленные стронгилиды. Эти паразитические нематоды позвоночных ранее были объединены в составе отрядаylida, а ныне сведены в одно надсемейство Strongyloidea. В новой системе эти три группы со столь разными биологическими особенностями объединены в составе инфраотряда Rhabditomorpha (De Ley, Blaxter, 2002).
Как и большинство других рабдитид, гетерорабдитиды представляют собой нематод с удлинённым цилиндрическим или веретеновидным телом. Эта особенность лучше заметна у особей второго поколения, тогда как гигантские самки (гермафродиты) первого – гермафродитного поколения имеют длинное тело (до 2 см), имеющее почти одинаковый диаметр по все длине, за исключением переднего конца тела, сужающегося от уровня базального бульбуса к переднему концу, и хвостового конца, сужающегося до тонкого и острого терминуса. Заметной особенностью крупных особей гетерорабдитид является обширная первичная полость тела, в которой достаточно свободно размещены средняя кишка и половые трубки. Средняя кишка при изучении в световом микроскопе выглядит как темный цилиндр, без различимого просвета. На переднем конце тела самок (или гермафродитов) различим довольно мощный пищевод (Poinar, 1976). По своему строению он похож на пищевод Rhabditidae, однако значительно мощнее. На переднем конце пищевод соединяется с хорошо выраженной цилиндрической стомой. На краях стомы самок различимы 6 треугольных лепестковидных губ, заключающих в себе нервное окончание, различимое и в световом микроскопе. Кроме губных сенсилл при изучении в сканирующем микроскопе иногда можно найти окончания папилл наружного круга губных сенсилл и 4 головные сенсиллы. Амфиды обычно неразличимы, и лишь иногда в сканирующем электронном микроскопе можно выявить эти небольшие (менее 1 мкм в диаметре) поровидные образования. Экскреторная система самок гетерорабдитид открывается наружу довольно заметным и толстым экскреторным протоком с порой диаметром 2-3 мкм. От поры в латеральные валики тела отходят экскреторные каналы, постепенно утончающиеся и неразличимые вблизи головного и хвостового концов. Примечательно, что особенностью самок гетерорабдитид является наличие т.н. дополнительной экскреторной системы (Спиридонов, 1981), что еще более сближает их со свободноживущими рабдитидами (Chitwood, Chitwood, 1950).
На перегибе половых трубок самок гетерорабдитид можно различить иногда многочисленные мелкие спермии. Развитие яиц начинается почти сразу за перегибом половой трубки – в проксимальной, по отношению к яйцеводам, части матки. Если у молодых самок происходит откладка яиц внутрь тела погибшего насекомого, то у старых самок процесс яйцекладки почти полностью подавляется и личинки первой стадии вылупляются прямо в матку. Вскоре они разрывают матку и начинают активно двигаться внутри самки, пожирая её содержимое. При этом пищевод самки продолжает функционировать, поставляя внутрь такого мешка массу бактерий и лизированных тканей насекомого. Это явление называется “endotokia matricida” (Johnigk, Ehlers, 1999). Строение самок первого – гермафродитного – поколения и второго – амфимиктического (обоеполого) весьма сходно, не считая различий в размерах. Самки второго поколения редко превышают в длину 3-4 мм (Mrcek, Bednarek, 1992).
Строение самцов гетерорабдитид значительно менее изменено адаптациями к необычному образу жизни. По своим размерам и строению они вполне соответствуют самцам видов сем. Rhabditidae. Тело самцов Heterorhabditis прозрачное, поскольку их кишечник не заключает такого количества липидных гранул, как у самок. Половая система самцов гетерорабдитид трубчатая, с перегибом на некотором расстоянии за базальным бульбусом пищевода. Загнутая часть половой трубки содержит зону деления сперматоцитов, тогда как основная часть содержит зону роста, а также эякуляторный проток. Заметной особенностью строения самцов гетерорабдитид является наличия копуляторной бурсы. Это бурса, т.н. пелодерного типа, т.е. с крыльями, не охватывающими терминус хвоста. Бурса поддерживается 9 парами длинных папилл. Спикулярный аппарат гетерорабдитид состоит из двух тонких, прямых и почти прозрачных спикул и небольшого рулька. Строение спермиев гетерорадитид почти идентично строению спермиев нематоды Caenorhabditis elegans (Ward et al., 1981).
Морфология нематод семейства Steinernematidae в целом напоминает таковую у гетерорабдтид. К наиболее существенным отличиям в строении самок можно отнести иное строение средней кишки, которая у штейнернематид отличается большим просветом, а также отсутствием лепестковидных папилл на головном конце. Хвостовой конец самок штейнернематид (в особенности самок первого поколения) обычно куполовидный (не приострённый). Отличительной особенностью самок некоторых видов штейнернематид является присутствие в их половых трубках т.н. гигантских амёбоидных клеток (Spiridonov et al., 1999). Электронно-микроскопические исследования этих структур показали, что они являются сильно измененными спермиями, не участвующими в оплодотворении, но несущими на своей поверхности мелкие функциональные спермии (Yushin et al., 2007).
В отличие от самцов гетерорабдтид самцы штейнернематид не имеют бурсы. На поверхности задней части их тела видны лишь отдельные папиллы, расположенные в двух субвентральных рядах. Обычно имеется 22 или 24 такие папиллы. Кроме субвентральных папилл имеется непарная папилла перед клоакальным отверстием (Nguyen et al., 2007).
Изучение таксономического разнообразия энтомопатогенных нематод
Поскольку основной задачей нашей работы было изучение в сравнительном аспекте разнообразия энтомопатогенных нематод и их симбиотических бактерий, то в основе нашей работы было выделение в природе и лабораторное культивирование как можно большего количества этих симбиотических организмов. В значительной степени наша работа опиралась на коллекцию, поддерживаемую уже в течение многих лет в лаборатории систематики и эволюции паразитов. Однако, на пути использования таких «старых» культур мы столкнулись с проблемой постепенной утери симбиотических бактерий некоторыми культивируемыми изолятами энтомопатогенных нематод (или, по крайней мере, существенного ослабления их жизнеспособности). Такие факты указывали на важность выделения в природе новых полноценных изолятов. Поэтому в процессе работы нам пришлось, хотя и в ограниченном объёме, проводить первичное выделение энтомопатогенных нематод из почвы. Особый интерес у нас вызывали неизученные или малоизученные до настоящего времени регионы Российской Федерации.
Поскольку в настоящее время в мире функционирует не менее 2-3 десятков лабораторий по изучению почвенных энтомопатогенных нематод, стало возможным получить некоторое количество изолятов от других исследователей. Именно таким образом нами были получены культуры энтомопатогенных нематод из Болгарии, Великобритании, Камеруна, Китая. 2.1.1. Выделение новых изолятов энтомопатогенных нематод
Для выделения новых культур энтомопатогенных нематод мы использовали метод живых приманок (Bedding, Akhurst, 1975). Для этого во время полевых выездов собирали пробы почвы. Проводилось фотографирование мест сбора, для того, чтобы иметь возможность вернуться для дополнительного отбора почвы. Собрав в поле 1-2 килограмма почвы из каждой обследуемой точки, мы доставляли такие пробы в лабораторию. Здесь, отделив не содержащую нематод составляющую (дерновина, корни, крупные камни), мы наполняли такой гомогенной по составу почвой пластиковые контейнеры объёмом от 500 до 1000 мл (в зависимости от типа контейнера, который удавалось закупить). Контейнер полностью заполняли почвой, не оставляя пространства под крышкой. Если почва были очень сухой и сыпучей – в центр контейнера из лабораторной «промывалки» добавляли 50-70 мл воды. Проделав в центре блока почвы углубление карандашом, в образовавшееся отверстие помещали 5 особей гусениц последнего возраста большой вощинной моли (Galleria mellonella L.). Через 2-4 дня после начала экспозиции почву удаляли из контейнера и помещали на лист полиэтилена или бумаги. Пинцетом разбирали почву, ставя себе задачей отыскать всех помещенных в почву гусениц. Живых гусениц возвращали в контейнер, куда затем вновь помещали всю почву, а погибших гусениц помещали на влажную фильтровальную бумагу на дне малых чашек Петри (диаметром 40 мм). Чашки Петри обтягивали парафильмом для предотвращения высыхания подложки. Через 1-2 дня после перекладывания на фильтры гусениц осматривали и пытались определить причины их гибели. Как показал опыт разных лабораторий (Woodring, Kaya, 1988), если окраска погибшего насекомого ровная, желтоватая или коричневатая (а в некоторых случаях малиново- или кирпично-красная), если от гусеницы не исходит гнилостный запах, а ощущается лишь своеобразный «лекарственный аромат» (напоминающий запах раствора пенициллина или других антибиотических средств), то высока вероятность поражения данного хозяина именно почвенными энтомопатогенными нематодами. К сожалению, не всякое успешное заражение и не всякая гибель от него насекомого завершается формированием «колонии» развивающихся нематод . Некоторые нематоды рода Steinernema обычные в средней полосе России з а ч а с т у ю прекращают развитие на стадии гигантских самок . При этом преждевременное вскрытие м о ж е т и с а м о по с е б е прекратить развитие нематод. Все это о з н а ч а е т , ч т о при выявлении погибших гусениц необходимо бережное отношение к таким образцам: недопущение как высыхания, т а к и чрезмерного увлажнения, приводящего в образованию плесени. Т а к же важно своевременно заметить появление первых инвазионных личинок и снизить при этом в л а ж н о с т ь камеры (п о с к о л ь к у т.н. « прединвазионные» личинки могут быть повреждены водой из-з а осмотического шок а). Полностью устойчивы к воздействию воды т о л ь к о сформировавшиеся инвазионные личинки . П о я в л е н и е пер вых инвазионных личинок л е г ч е в с е г о диагностировать по их появлению на к р ы ш к е чашки П е т р и . Поскольку к этому в р е м е н и парафильм с чашки удаляется , а влажность резко понижается необходимо не реже раза в день с м ы в а т ь личинок с к р ы ш к и чашки П е т р и . На 2-3 день по сле начала появления инвазионных личинок на поверхности трупа насекомого выявляются многочисленные инвазионные и прединвазионные личинки , а также взрослые нематоды 2-г о (или редко 3-г о ) поколения. Взрослых нематод извлекают с помощью ловчей иглы и фиксируют с нагреванием в формалине для получения временных или постоянных препаратов. Это также подходящий момент для фильтрации содержимого погибшего насекомого. Разорвав насекомое на ч а с т и , его о с т а т к и по мещают на тонкий ватный ф и л ь т р , помещённый в воронку с водой (снизу на воронку о д е в а ю т обрезок силиконовой трубки, в которую вставляют с т е к л я н н у ю пробирку объёмом 4-10 м л – воронку заполняют водой, изгоняя пузырьки воздуха). При появлении на дне стеклянной пробирки осадка нематод, пробирку снимают с о шланга и с л и в а ю т содержимое в «фальконовскую» бутыль для культивирования культур клеток. Затем пустую пробирку о п я т ь надевают на шланг. Бутыль надписывают, у к а з ы в а я дату фильтрац ии и данные изолята. Вторая и третья фильтрации немато д из погибшей гусеницы содержат, по большей ч а с т и , взрослых н е м а т о д и прединвазионных личинок. Эти о с а д к и использовались н а м и для извлечения Д Н К из данной культуры нематод.
В данной работе использовался материал, собранный в различных регионах России, а также привезённый из других с т р а н . Все исследованные н а м и виды н е м а т о д приведены в таблице 2.1.
Исследованные виды энтомопатогенных нематод семейства Steinernematidae и их симбиотические бактерии
Данный изолят нематод был выделен на территории Уржумского лесничества в Республике Марий-Эл из песчаной почвы, характерной для этого района.
Инвазионные личинки этих нематод были исследованы на материале суспензии, содержащей личинок, хранившихся при 4-5 С в течение 4 месяцев после миграции из погибшего хозяина. Длина личинок составляла 1026 (924 – 1147) мкм при диаметре в середине тела 32 (28 – 35) мкм. Латеральное поле состоит из 9 хорошо различимых линий, отделенных друг от друга равными интервалами. Длина пищевода составляла 145 (139 – 151) мкм. Экскреторная пора находилась на расстоянии около 72-73 мкм от головного конца. Хвостовой конец личинок конический, с чётко выделяющейся гиалиновой частью на расстоянии порядка 38-40 мкм. Длина хвостового конца составляет 80 (77 – 86) мкм.
Головной конец с головной капсулой несколько отделен от остального тела, слабо выраженная перетяжка находится на расстоянии 8-9 мкм от головного конца. У 4-месячных личинок липидные гранулы окружают пищевод, сильно заполняют среднюю часть и заканчиваются в середине хвостового отдела. Половой зачаток плохо различим из-за обилия липидных гранул. Несколько попыток получить последовательность методом прямого секвенирования (т.е. с праймерами, использованными для ПЦР) не увенчались успехом: хроматограммы демонстрировали множественные пики по нескольким позициям. Секвенирование полученных 6 клонов ПЦР-продукта, полученного от одной инвазионной личинки, выявило присутствие двух гаплотипов ITS-участка рДНК.
Различия между двумя выявленными гаплотипами составляло 12 п .н. (1.6%) для участка выравнивания длиной в 789 п. н. BLAST-поиск этих последовательностей в базе данных Генбанка NCBI показал высокую схожесть с уже депонированными последовательностями, полученными от S. arenarium. Анализ полученных последовательностей показал, что первый клон (№1) изолята из Уржумского лесничества отличался от изолята S. arenarium, выделенного в Рязани (AY230160) на 12 п. н., а от изолята из Болгарии (HM160094, HM160095) на 19 п. н. Последовательность второго клона (№3) отличалась от последовательности болгарской нематоды на 18 п. н., а от рязанского изолята на 4 п. н. Таким образом, гаплотипы S.arenarium изолята «Уржум» таксономически более близки к рязанскому изоляту S.arenarium, чем к болгарскому. Таким образом, данный изолят энтомопатогенных нематод принадлежит к штейнернематидам группы «glaseri». Морфология личинок с их значительной длиной также соответствует результатам молекулярно-таксономического определения
Была получена нуклеотидная последовательность 16S ДНК бактерий, выделенных из инвазионных личинок этого изолята нематод. BLAST-поиск (Altschul et al., 1990) в базе данных Генбанка NCBI показал их принадлежность к виду Xenorhabdus kozodoii. Отличия от типовой последовательности этого бактериального вида составили 18 п. н. 3.1.2. Изученные изоляты Steinernema bicornutum Talossi, Peters, Ehlers, 1995 Изолят «1/2011» из Земенского ущелья в Болгарии Этот изолят был любезно предоставлен д-ром Денисом Градинаровым, который обнаружил этих нематод в почве Земенского ущелья в 2011 году.
Инвазионные личинки Steinernema bicornutum характеризуются наличием так называемых «рожек» (кутикулярных выступов) на головном конце тела. Эта нематода принадлежит к небольшой группе видов (т.н. группа «bicornutum-ceratophorum»), для которых одной из главных характеристик является наличие таких структур на головном конце инвазионной личинки.
Инвазионные личинки этих нематод исследовались спустя 8 месяцев после их миграции из насекомого. Это небольшие нематоды с длиной тела 826 (765 – 885) мкм. Диаметр в середине тела составляет 26 (21 – 28) мкм. Латеральное поле состоит из 9 линий. Пищевод имеет длину 123 (120 – 131) мкм. Экскреторная пора находится между головным концом и бульбусом на расстоянии порядка 58-60 мкм от головного конца. Хвостовой конец сужается и заканчивается острым кончиком. При этом длина его составляет 72 (64-77) мкм.
После анализа полученной последовательности, проведенного в программе BLAST для ITS-участка рибосомальной ДНК этого изолята, выявилось 100% сходство с Steinernema bicornutum (AF121048) из Югославии, а с изолятом Steinernema bicornutum из Краснодара (AY171279) исследованный нами изолят показал 98% сходство.
От данного изолята нематод была выделена чистая бактериальная культура, от которой была получена только нуклеотидная последовательность по гену RecA. Полученная последовательность этого гена не менее информативна, чем обычно используемая в данной работе последовательность 16S, и также позволяет точно определить видовую принадлежность бактериального штамма. BLAST-поиск в базе данных Генбанка NCBI показал их принадлежность к виду Xenorhabdus budapestensis. Отличия от типовой последовательности этого бактериального вида составили лишь 1 п. н.
Изолят «2Rp2» из окрестностей города Земен, левый берег реки Струма в Болгарии
Изолят этой энтомопатогенной нематоды был также предоставлен нашей лаборатории доктором Денисом Градинаровым, который указал место сбора этих нематод, как окрестности города Земен, левый берег реки Струма, Болгария. По морфологическим данным этот изолят был отнесен доктором Градинаровым к нематодам группы «bicornutum». Проведенные молекулярные исследования ITS участка рибосомальной ДНК для этого изолята полностью подтвердили определение доктора Градинарова. В BLAST изолят на 100% совпадает с изолятом Steinernema bicornutum (AF121048) из Югославии, а с изолятом Steinernema bicornutum из Краснодара (AY171279) проявил 98% сходство.
Филогенетические взаимоотношения изученных энтомопатогенных нематод выделенных из точек изолятов
На рис. 4.1 представлены результаты филогенетического анализа последовательностей ITS участка рибосомальной ДНК изученных нематод методом максимальной парсимонии. Кроме изученных нами видов в кладограмме присутствуют и виды, последовательности для которых получены из Генбанка NCBI. Число последних существенно сокращено, чтобы все полученные нами последовательности для наглядности уместились на одном древе. В качестве внешней группы сравнения была использована последовательность нематод yloides procyonis – паразитов позвоночных, поскольку известно (Dorris et al., 1999), что нематоды семейства Steinernematidae близки кyloididae и Alloinematidae. На этой кладограмме видно, что на данном древе образуются отдельные группы из видов или изолятов штейнернематид, которые получают при этом достаточно высокую бутстрэп-поддержку. Так, например, поддержка вида Steinernema feltiae представленного многочисленными изученными нами изолятами, достигает 98%. В то же время данный анализ по методу максимальной парсимонии не выявил значительной поддержки для узла объединяющего отдельные исследованные нами виды группы «feltiae-kraussei-oregonense». На данной кладограмме все они объединяются в узел с низким уровнем поддержки в 75%. К этому узлу присоединяется представители других эволюционных линий, такие как штейнернематиды группы «bicornutum ceratophorum», штейнернематиды группы «glaseri», представленные в нашем анализе видом Steinernema arenarium, а также несколькими неописанными видами из Африки.
Группа «monticolum» представлена в нашем виде анализа тремя изученными видами и двумя последовательностями, полученными из Генбанка NCBI. Эта группа получает 100-процентную поддержку. К этой же группе примыкает и вид Steinernema schliemannii, но при поддержке лишь 85%. Базальное положение во всей кладограмме занимают представители группы «affine - intermedium». Наш анализ показал, что изученные нами неопределенные до вида штейнернематиды из Эстонии и из города Троицка объединяются с невысокой бутстрэп поддержкой с видом Steinernema affine.
На рис. 4.2 представлены результаты филогенетического анализа той же выборки последовательностей, а именно ITS участка рибосомальной ДНК, методом присоединения ближайшего соседа. Можно видеть, что в целом кладограмма, построенная по этому методу, совпадает с предыдущей. Однако ещ` более слабую поддержку получает объединение между собой изученных нами видов группы «feltiae-kraussei-oregonense». В нашем случае это большое количество изолятов вида Steinernema feltiae и изолятов Steinernema kraussei, примыкающие к ним виды Steinernema cholashanense и Steinernema everestense из Непала, а также неописанный изолят Steinernema sp. «№137» из штата Небраски в США. На кладограмме, построенной по методу присоединения ближайшего соседа, находим несколько групп с высоким уровнем поддержки, как, например, группа «monticolum» вместе с Steinernema schliemannii. На кладограмме находятся и другие группы видов, представленные тем же составом и при сходных поддержках, как и на предыдущей кладограмме, а именно эволюционная линия из видов группы «glaseri» (в составе Steinernema arenarium и Steinernema sp. «MW8A»), группы «bicornutum-ceratophorum» и «carpocapsae-siamkayai». Базальный характер группы «affine-intermedium» не проявляется столь же явно, как на предыдущей кладограмме. Steinernema sp. США, Небраска "№137" Steinernema feltiae РФ, Петропавловск-Ka мчат. Steinernema feltiae РФ, Карачаево-Черкесия Steinernema fettiae РФ, "Захарове" Steinernema feltiae РФ, "Камчатка, пляж" Steinernema feltiae РФ, Якутия, "Маган" Steinernema feltiae РФ, Якутия, "Жатай" Steinernema feltiae РФ, Карелия, "Чупа 7" Steinernema feltiae Болгария, "Земен Rp7" Steinernema feltiae Болгария, "Шайтан-дере" Stein em ema feltiae Б о л rap и я, " 3 є м є н HDR-1" Steinernema fettiae Швейцария, "Сен-Бернар Steinernema feltiae Болгария, "Среднагора" Steinernema feltiae Великобритания, "M2" Steinernema feltiae Великобритания, "M3" Stein ern em a feltiae Великобритания, " M 4" Steinernema feltiae РФ, "Ижевск" AY171246 Steinernema feltiae США, "Каслвуд" Steinernema fettiae Болгария, "Катунцы" Steinern ema feltiae A p ivi en и я Steinernema cholashanense Китай EF431959 Steinernema cholashanense Непал, "SLK-1" Steinernema oregonense США AY230180 Steinernema kraussei Польша KC608624 Steinernema kraussei Болгария, "ChV" Steinernema kraussei РФ, Карелия, "Картеш" Steinernema kraussei Великобрнт. AY230176 Steinernema kraussei Болгария, "Купена" Steinernema kraussei Словения EU914856 Steinernema kraussei Болгария, "Мантарица" Steinernema kraussei РФ, "Эльбрус-31" Steinernema kraussei Великобрит. AY230161 Steinernema everestense Непал, "BKP-4" Steinernema costaricense США, "Буш-Августа Steinernema ЫсотиШт Иран FJ860036 Steinernema ЫсотиШт Болгария, "1/2011" Stein ern ema b icorn и turn b() j 11 a p и я," le м с 11 2 Щ 2 " Steinernema ЫсотиШт Югославия AF121048 Steinernema ceratophorttm Китай, "40" Steinernema ceratophorttm Китай, "JJJ" Steinernema siamkayai Непал, "K.L-1" Steinernema carpocarsae РФ, "Мел еж a" Steinernema carpocarsae Мексика GQ421605 Steinernema sp. "Камерун" Steinernema sp. Танзания, "MW8A" Steinernema sp. 3d HonnH,"Mosisa" JN651413 Steinernema sp. Эфиопия, "Dero8" JN651414 Steinernema arenarium Болгария, "Варна" Steinernema arenarium РФ, Марий-Эл Steinernema scltliemannii Германия Steinernema mont tcolum Корея Steinernema sp. Япония "MY5" AB243437 Steinernema sp. РФ, Приморский край, "KI19" Steinernema ashiuense Япония DQ354694 Steinernema intermedium США AF122016 Steinernema sp. РФ, "Троицк" Steinernema affine Франция KC287224 Steinernema sp. Эстония, "EE2" Strongyloides procyon is
На рис. 4.3 представлено филогенетическое древо взаимоотношений между изученными нами изолятами нематод в сравнении с теми последовательностями, которые депонированы в Генбанке NCBI для изученных нами видов, построенное методом максимального правдоподобия. На данном рисунке представлено консенсусное древо, являющееся результатом объединения 6 равновероятных деревьев. Можно видеть, что все изученные последовательности Steinernema feltiae образовали единую, хотя и слабо поддерживаемую эволюционную линию, в пределах которой можно выделить несколько групп изолятов с более надежными поддержками объединения. Так, нематоды этого вида из Якутии образовали единую группу, правда, с низким уровнем поддержки, с изолятом Steinernema feltiae «Чупа 7» из Карелии (форма Северной Евразии). Также единую группу образовали некоторые европейские виды, такие как Steinernema feltiae «Среднагора» из Болгарии и изоляты нематод «М2», «М3», «М4» из Уэльса, Великобритания. Эти последние – уэльские – изоляты образуют единую группу с высоким уровнем поддержки. Также в отдельную группу с сильной поддержкой в 93% объединяются изоляты Steinernema feltiae «Катунцы» из Болгарии и Steinernema feltiae из Армении.
