Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 10
1.1. Стресс и адаптация 10
1.2. Механизмы влияния изученных экофакторов на живые организмы 17
1.3. Биохимические системы защиты генома и структур клеток от неспецифического и специфического действия экофакторов 30
1.4. Вода и диссипативные структуры 36
1.5. Метод газоразрядной визуализации 44
2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА 48
2.1. Объекты исследования 48
2.2. Методы исследования 50
2.2.1. Методика определения гидразина в водных и почвенных образцах
2.2.2. Комплексный цитолого-биохимический метод дифференциальной оценки активности генома в процессах репликации, трансляции, репарации и его устойчивости 52
2.2.3. Определение активности и содержания антиоксидантов 54
2.2.4. Методика определения митотического индекса 59
2.2.5. Методика культивирования лейкоцитов из крови человека, с последующим приготовлением препаратов хромосом (для подсчета митотического индекса). 61
2.2.6. Методика введения радиоактивной метки 64
2.2.7. Методика физико-химического анализа жидкостей с использованием метода газоразрядной визуализации вторичных излучений 65
2.2.8. Статистическая обработка результатов 70
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 71
3.1. Влияние физических и химических воздействий на степень структурированности воды, водных растворов и водно-этанольных смесей 71
3.2. Влияние физических и химических экотоксикантов на формирование ответных адаптивных реакций дрожжевых клеток штамма Cuf liver 78
3.3. Влияние условий произрастания на изменение физиолого-биохимических параметров клеток корневой меристемы проростков семян ольхи кустарниковой и березы тощей. 90
3.3.1. Изменение физиолого-биохимических параметров в клетках корневой меристемы проростков ольхи кустарниковой в зависимости от климато-географических условий места произрастания 90
3.3.2. Изменение физиолого-биохимических параметров клеток корневой меристемы проростков березы тощей при действии экотоксикантов 95
3.4. Роль конформационных перестроек надмолекулярных кластеров воды, ДНК и белков в ответных реакциях клеток лейкоцитов человека на действие экотоксикантов различной природы 100
ВЫВОДЫ 107
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 109
- Стресс и адаптация
- Объекты исследования
- Влияние физических и химических воздействий на степень структурированности воды, водных растворов и водно-этанольных смесей
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Термодинамическая открытость и сильная удаленность от равновесия биологических систем, а также нелинейность протекающих в них процессов (наличие положительных и отрицательных обратных связей) определяют их способность к самоорганизации и саморегуляции [Пригожим, Николис, Стенгерс, 1979, 2003, 2003; Чернавский, 2004; Князева, Курдюмов, 2002], которые обеспечивают сохранение целостности живой системы и гомеостаза благодаря процессам «... постоянной адаптации к постоянно изменяющимся условиям внешней среды (раздражителям)» [Селье, 1964]. Более того, только благодаря такого рода адаптациям к экологическим факторам среды биосистемы вообще могут существовать и эволюционировать как структурированные системы (с понижением энтропии) за счёт диссипации (рассеивания) энергии внешней среды.
В качестве экологических факторов среды, обеспечивающих термодинамическую открытость (энергетический обмен) и неравновесность (возможность возникновения диссипативных структур в энергетическом потоке с минимизацией скорости производства энтропии) могут выступать раздражители физической (низкофоновые электромагнитные излучения, ионизирующая радиация), химической (для человека также психической) природы, а также такие интегральные факторы, как климато-географические условия.
Известно, что ключевыми в этих процессах биохимической адаптации являются переключения функциональной активности генетического аппарата в реакциях репликации, репарации ДНК и направленных на трансляцию, сопровождающиеся (и, по-видимому, управляемые) изменениями конформаций этих биополимеров, образованных слабыми взаимодействиями [Бурлакова и др., 2003]. Вода является основным компонентом биологических систем, но понимание роли воды в жизнедеятельности до недавнего времени ограничивалось её участием в биохимических процессах.
В последнее время, большое значение в обеспечении саморегуляции
биологических систем придается также конформационным перестройкам
надмолекулярных кластеров водных и других сред биосистемы (также
образованных слабыми взаимодействиями) под действием факторов среды,
которые в свою очередь, влияют на конформации биополимерных молекул в
клетке, т.е. на их функциональную активность [Бульенков, 1991; Чиркова,
1994; Воейков, 2005]. Причём направленность и количественные
характеристики конформационно-функциональных перестроек
биополимерных и надмолекулярных структур биосистем, образованных слабыми взаимодействиями, в рамках ответных реакций биосистем зависят как от природы и количественных энергетических характеристик экофакторов среды (концентрации, дозы и ее мощности), так и от физиологического состояния и индивидуальных свойств самой биологической системы.
Вместе с тем, в доступной нам литературе, мы не нашли работ, в которых бы в рамках единого эксперимента исследовались бы адаптивные изменения активности и конформации нуклеопротеида ДНК в различных процессах, а также надмолекулярных кластеров воды в реакциях биологических систем на действие экофакторов среды.
Целью данной работы явилось изучение роли конформационных и функциональных изменений генома растущих клеток дрожжей, меристемы растений, лейкоцитов человека в реакциях репликации, репарации ДНК и направленных на трансляцию, а также трансформаций пространственных надмолекулярных структур воды в формировании ответных реакций данных биосистем на действие экологических факторов различной природы и интенсивности.
Для достижения цели работы решались следующие задачи;
1. Изучить физико-химические изменения воды при действии на неё физических (дистилляция путем обратного осмоса, ультрафильтрация,
природное геомагнитное поле) и химических (введение этанола, NaCl) экофакторов.
Исследовать изменения устойчивости, функциональной активности и степени структурированности генома дрожжевых клеток при протекании реакций репликации, репарации ДНК и направленных на трансляцию, а также физико-химические изменения воды (конформационные перестройки её надмолекулярных кластеров) при действии на них химических экофакторов (нитриты, колхицин, этанол) и малых доз радиации (20(Н700 мкР).
Изучить влияние климато-географического (Верхоянье по сравнению с Цент-ральной Якутией) и химического (предположительно гептил) экофакторов на устойчивость и функциональную активность генома меристемных растительных клеток на примере ольхи кустарниковой и берёзы тощей.
Исследовать изменения устойчивости, функциональной активности и степени структурированности генома лейкоцитов человека при протекании реакций репликации, репарации ДНК и направленных на трансляцию, а также физико-химические изменения воды (конформационные перестройки её надмолекулярных кластеров) при действии на них химических экотоксикантов (нитриты, колхицин, этанол) и малых доз радиации (20(Н700 мкР).
Управляющее влияние экологических раздражителей среды различной природы и интенсивности на различные биосистемы, обеспечивающее их способность к самоорганизации и саморегуляции, реализуется благодаря конформационным перестройкам надмолекулярных кластеров воды и информационных биополимеров клетки, приводящих к изменениям функциональной активности генома в ключевых процессах матричных биосинтезов: репликации, репарации ДНК и направленных на трансляцию. Совокупность этих процессов и определяет реакции биосистем на экофакторы среды.
Основные положения, выносимые на защиту:
Изменения функциональной активности клеточного генома в реакциях репликации, репарации ДНК и направленных на трансляцию являются ключевыми стадиями формирования ответных реакций биосистем (обеспечивающих их способность к самоорганизации и саморегуляции) на действие экофакторов среды, независимо от природы как биологической системы, так и качественных и количественных характеристик экофактора среды.
Адаптивные трансформации активности функциональных систем клетки взаимосвязаны как с их собственными конформационными перестройками, так и с физико-химическими изменениями водных диссипатнвных структур клеточных и внеклеточных сред, также образованных слабыми взаимодействиями.
Научная новизна. Впервые в едином эксперименте показана взаимосвязь изменений функциональной активности клеточного генома (в процессах репликации, репарации ДНК и направленных на трансляцию) и конформационных перестроек как нуклеопротеида ДНК, так и физико-химических изменений надмолекулярных кластеров воды, образованных слабыми взаимодействиями, а также их ключевое значение в формировании ответных биохимических адаптивных реакций биосистем на действие экологических факторов среды различной природы и интенсивности.
Практическая значимость. Экспериментально показано, что степень физико-химических изменений (вторичного свечения) воды и её смесей, клеточных клонов характеризуют степень структурированности пространственных диссипатнвных структур, образованных слабыми взаимодействиями (нуклеопротеида ДНК, белков, кластеров воды). Это позволяет разрабатывать новые подходы для оценки степени благополучия и жизнеспособности биологических систем в различных экологических условиях.
Изучение закономерностей физико-химических изменений водно-спиртовых диссипативных структур в зависимости от концентрации этанола в них позволило предложить принципиально новый патогенетический механизм формирования алкогольной зависимости, на основе которого, в нашей лаборатории разработан метод патогенетического лечения алкоголизма и других аддиктивных состояний с применением рефлексотерапевтического прибора «ЭМАТ-экспресс-01».
Стресс и адаптация
Надежность организма проявляется в эффективности функционирования его защитных систем, в его устойчивости к действию неблагоприятных факторов внешней среды: высокой и низкой температуры, недостатка кислорода, дефицита воды, засоления почвы, ионизирующих излучений, инфекций и др. Эти неблагоприятные факторы называют стрессорами, а реакцию организма на любые отклонения от нормы -стрессом. Самые разнообразные неблагоприятные факторы могут оказывать сравнительно кратковременное, но сильное влияние или действовать длительное время. В первом случае, как правило, в большей степени проявляются неспецифические механизмы устойчивости, во втором -специфические [Гродзинский, 1983; Полевой, 1989].
Канадский ученый Г. Селье со второй половины 30-х годов ввел в медицину понятие "стресс" (от англ. stress - напряжение). По Селье СТРЕСС - это совокупность всех неспецифических изменений, возникающих в организме под влиянием любых сильных воздействий (стрессоров), включающих перестройку защитных сил организма. (Стресс - общая неспецифическая адаптационная реакция организма на действие любых неблагоприятных факторов).
В данном параграфе литературного обзора особенности классификации стрессоров и адаптивных реакций мы рассмотрели на примере растительных организмов. Для растений стресс, как реакция организма на неблагоприятное воздействие проходит три фазы: 1) первичной стрессовой реакции; 2) адаптации; 3) истощения ресурсов надежности.
Факторы, способные вызвать стресс у растительных организмов, можно подразделить на три основные группы:
1) физические: недостаточная или избыточная влажность, освещенность или температура, радиоактивное излучение, механические воздействия;
2) химические: соли, газы, ксенобиотики (гербициды, инсектициды, фунгициды, промышленные отходы и т.д.);
3) биологические (поражение возбудителями болезней или вредителями, конкуренция с другими растениями, влияние животных Хочачка, 1988].
Способность к защите от действия неблагоприятных абиотических и биотических факторов среды - столь же жизнеобеспечивающее свойство любого организма, как питание, движение, размножение и др. Эта функция появилась одновременно с возникновением первых живых организмов и в ходе дальнейшей эволюции развивалась и совершенствовалась. Поскольку повреждающих и уничтожающих факторов множество, возникшие способы защиты от них самые разные - от метаболических механизмов до морфологических приспособлений. Выживаемость и расселение по экологическим нишам определялись способностью организмов приспосабливаться к необычным условиям среды [Гродзинский, 1983].
Таким образом, адаптация - это приспособление организма к конкретным условиям существования [Полевой, 1989].
Защита растений от действия неблагоприятных факторов среды (стрессоров) обеспечивается на:
1) клеточном и органном уровнях;
2) организменном уровне;
3) популяционном уровне.
I. Клеточный уровень. К первичным неспецифическим процессам, происходящим в клетках растений при сильном и быстро нарастающем действии стрессора, относятся следующие:
1. Повышение проницаемости мембраны, деполяризация мембранного комплекса плазмолеммы.
2. Диффузия Са в цитоплазму из клеточных стенок и внутриклеточных компартментов: вакуолей, эндоплазматической сети, митохондрий.
3. Сдвиг рН цитоплазмы в кислую сторону.
4. Активация сборки актиновых микрофиламентов и сетей цитоскелета, в результате чего возрастает вязкость и светорассеяние цитоплазмы.
5. Усиление поглощения С»2, ускоренная трата АТФ, развитие свободиорадикальных, вслед за ними и антиоксидантних реакций.
6. Возрастание гидролитических процессов.
7. Активация и синтез стрессовых белков (см. ниже).
8. Усиление активности Н+-помпы в плазмолемме, препятствующей неблагоприятным сдвигам ионного гомеостаза.
9. Увеличение синтеза этилена и АБК, торможение деления и роста, поглотительной активности клеток и других физиологических и метаболических процессов, осуществляющихся в обычных условиях. Торможение функциональной активности клеток происходит в результате действия ингибиторов н переключения энергетических ресурсов на преодоление неблагоприятных сдвигов.
10. Перестройка во времени и по интенсивности матричных биосинтетических процессов: репликации, трансляции, репарации ДНК и др.
11. Включение систем клеточного апоптоза для предотвращения некроза.
Объекты исследования
Дрожжи пекарские штамм Cuf liver. Ольха кустарниковая {Duschekia fruticosa (Rupr)). Летне-зеленый листопадный кустарник до 4 м высоты. Растет в хвойных и смешанных лесах, на гарях, вырубках, болотах, по берегам рек, на каменистых луговых склонах и россыпях практически во всех районах Якутии (Андреев и др., 1974).
Береза тощая {Betula exilis Sukacz) Кустарник высотой до 2-2,5 м Листья округлые или широкоовальные, толстоватые, сверху глянцевые, 5-15 мм длинной на коротких (2-10 мм) черешках. Сережки торчащие, толщиной 4-7 мм.
Культура клеток лейкоцитов человека. Вода, её растворы и водно-спитовые смеси. Характеристика точек сбора семян растений ольха кустарниковой (Duschekia fruticosa Rupr.,) и березы тощей (Betula exilis Sukacz.J
Семена растений были собраны в пяти точках исследованного района: устьях рек Догдо, Чибагалах, Хара-Сала, Балдымба и Солония. В устье р. Догдо отобрано 8 образцов семян ольхи кустарниковой. В устье р.Чнбагалах - 5 образцов семян березы тощей. В устьях рек Хара-Сала и Солония - по 1 образцу семян ольхи кустарниковой. В устье р. Былдымба - 1 образец семян березы тощей.
Точка №1. 100 метров восточнее лагеря. Семена собраны с 4 растений ольхи кустарниковой, росших возле небольшого водоема с илистым дном. Другая преобладающая растительность - злаковые, кустарнички (голубика).
Точка №2. Устье ручья Кимберели, впадающего в р. Догдо, нижняя точка. Семена собраны с 5 растений ольхи кустарниковой, росших вдоль ручья на каменистом берегу. Другой растительности здесь отмечено не было.
Точка №3. Ручей Кимберели, впадающий в р. Догдо, верхняя точка. Семена собраны с 4 экземпляров ольхи кустарниковой, росших на каменистом склоне, почти вплотную к ручью. Семенной урожай этих растений был низкий. Из травянистых растений встречались немногочисленные злаки.
Точка №4. Правый берег р. Догдо. Шесть растений ольхи кустарниковой с которых был проведен сбор, росли вдоль берега реки на расстоянии приблизительно 20-ти метров от воды. Заросли очень густые, кустарник крупный, 3-4 метра в высоту. Преобладающая растительность -злаки.
Точка №5. Левый ручей р. Догдо, верхняя точка. Семена ольхи кустарниковой собраны с 5 растений, на расстоянии 10-ти метров от ручья с густых зарослей, в небольшой низине. Из травянистой растительности встречались злаки.
Точка №6. Семена ольхи кустарниковой собраны в Центральной Якутии (контроль).
Точка №7. Устье правого притока р. Догдо. Ольха кустарниковая, с которой взяты семена, росла на затопляемом берегу, недалеко от ручья. Семена взяты с 5 крупных растений - 2,0-2,5 м высотой. Больше никакой растительности отмечено здесь не было.
Точка №8. р. Хара-Сала. Семена взяты с 5 растений ольхи кустарниковой. Кустарник высотой около двух метров, рос в небольшой ложбине. Из травянистой растительности встречались злаки.
Точка №9. р. Солония. Ольха кустарниковая, с которой были взяты семена, росла с лесу, на небольшом удалении от крупного озера. Семена собраны с 6 растений, росших, небольшими зарослями по 2-3 растения. Кроме кустарника здесь росли злаковые.
Точка №10. Левый берег р. Чибагалах. Семена березы тощей были собраны с 6 растений, росших недалеко от реки.
Точка №11. Правый берег р. Чибагалах, подножье горы. Семена березы тощей были собраны с 8 растений, росших на оскудненном остепененном лугу недалеко от озера.
Точка №12. Озеро №2 р. Чибагалах. Семена собранны с 10 растений березы тощей, росших на болотистой, неровной местности возле промерзающего озера (50x200 метров), где явственно ощущался запах сероводорода. Из травянистой растительности здесь встречались злаки.
Точка №13. Правый берег р.Чибагалах. Восемь деревьев березы тощей, с которых были собраны семена, росли вдоль реки. Преобладающая окрестная растительность - злаки и лишайники.
Точка №14. Озеро №1 р. Чибагалах. Семена березы тощей собраны с 9 растений, росших на болотистой местности вдоль ручья, который впадает в озеро (200x1000 метров).
Точка №15. р. Балдымба. Семена собраны с 4 деревьев березы тощей, росших на сколе горы. Растения на момент сбора уже находились под снегом. Так же здесь были отмечены редкие злаки.
Влияние физических и химических воздействий на степень структурированности воды, водных растворов и водно-этанольных смесей
Методом газоразрядной визуализации (ГРВ) вторичных свечений на аппарате «Коррекс» изучены изменения физико-химических свойств воды, а именно её 1втор.свсч, после очистки с помощью системы обратного осмоса фирмы Milllipor (рис.3.1.), а также в зависимости от: размеров пор фильтров и ультрафильтров при пропускании воды через фильтрационную установку фирмы «Sartorius», Германия (рис.3.2.); напряженности геомагнитного поля (рис.3.3.), информация о которой любезно предоставлялась сотрудниками ИКФИА СО РАН (г. Якутск); концентрации NaCl в водном растворе (рис.3.4).
Для оценки влияния физических и химических воздействий а степень структурированности воды и её смесей нами был выбран метод газоразрядной визуализации (ГРВ). Для этого мы провели первый эксперимент, где исследовали изменение надмолекулярной структуры воды, после её очистки методом обратного осмоса. Обратный осмос согласно изученной нами литературе полностью разрушает надмолекулярные структуры воды (кластеры). Что и было нами отмечено (рис. З.1.). После чего согласно тем же литературным данным [Зенин, 2000], происходит восстановление кластеров воды. Что опять-таки подтверждается нашими данными. Таким образом мы доказали пригодность метода ГРВ как аналитического метода для запланированных нами исследований.
Следующим этапом наших исследований было определение размеров кластеров воды. Для этого нами был использован набор фильтров фирмы Sartorius с разным диаметром пор (от 5 до 1200 нм). Непосредственно после отфильтрованной воды. Наблюдается явно выраженная нелинейная зависимость площади свечения воды от размеров пор фильтров. При размерах пор ультрафильтра - 5, 22 и 1200 нм 1В1оРхвсч воды увеличивалась в 3,3: 4,0 и 6.0 раз, соответственно (рис. 3.2.).
По-видимому, это происходит благодаря кооперативным переходам (капиллярному эффекту) всей массы воды в структуру определенного уровня при соизмеримости размеров пор фильтра размерам кластеров воды того или иного уровня структурообразования.
Эти данные свидетельствуют о воде как о сложной структурированной системе, состоящей из надмолекулярных структур обладающих свойством диссипативных систем (ДС), различающихся по стабильности во времени. Наряду со кластерированной водой при нормальных («нативных») условиях всегда остается часть молекул некластерированной (диффузной) воды.
Это подтверждено экспериментально при изучении влияния NaCl в диапазоне концентраций от 0,4 до 4,0% на интенсивность ВИ воды (рис. 3.3.). При концентрациях NaCl. соответствующих концентрациям в физиологическом растворе (0,9%) и в морской воде (3,2%), ІІІІ()р.свсч снижается (2 прогиба на кривой), соответственно на 8,7 и 10,0% по сравнению с максимумом при концентрации 1,5%, т.е. при этих «биогенных» концентрациях NaCl в растворах увеличивается доля диффузной воды.
