Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1.1. Содово-соленые озера Забайкалья 9
1.1.1. Физико-географическая характеристика Забайкалья 9
1.1.2. Описание содово-соленых озер Забайкалья 10
1.1.3. Химический состав вод содовых озер Забайкалья 12
1.1.4. Химический состав донных осадков в озерах Забайкалья 14
1.1.5. Органическое вещество в содовых озерах Забайкалья 15
1.2. Алкалофильное микробное сообщество 17
1.3. Экология сульфат- и железоредуцирующих бактерий 21
1.3.1. Численность сульфатредуцирующих бактерий (СРБ) в водоемах разного типа 21
1.3.2. Интенсивность сульфатредукции в донных отложениях 22
1.3.3. Численность железоредуцирующих бактерий (ЖРБ) в водоемах разного типа 23
1.4. Характеристика сульфатредуцирующих бактерий 26
1.4.1. Метаболизм СРБ 26
1.4.2. Алкалофильные сульфатредуцирующие бактерии 32
1.4.3. Роль СРБ в биотехнологических процессах 34
1.5. Характеристика железоредуцирующих бактерий 36
1.5.1. Метаболизм ЖРБ 36
1.5.2. Ранние формы микробного дыхания 39
1.5.3. Алкалофильные железовосстанавливающие микроорганизмы 40
1.5.4. Перспективы применения железоредукторов в промышленности 41
1.6. Заключение к обзору литературы 44
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 45
2.1. Объекты исследования 45
2.2. Методы исследования 48
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ 58
3.1. Физико-химическая характеристика исследованных содовых озер Забайкалья 58
3.2. Содержание Сорг в донных осадках и песчаных матах содовых озер 63
3.3. Влияние рН и солености на распространение и активность бактерий-деструкторов в озере Хилганта 64
3.4. Распространение сульфат- и железоредуцирующих бактерий в донных осадках и песчаных матах содовых озер 72
3.5. Интенсивность процесса сульфатредукции в донных осадках и микробных матах озера Соленое 77
3.6. Изотопный состав углерода донных осадков озера Соленое 78
3.7. Краткая характеристика накопительных культур алкалофильных сульфатредукторов 79
3.7.1. Условия выделения накопительных культур 79
3.7.2. Морфологическая характеристика 80
3.7.3. Сульфидогенез накопительными культурами 81
3.8. Краткая характеристика накопительных культур алкалофильных железоредукторов 83
3.8.1. Условия выделения накопительных культур 80
3.8.2. Морфологическая характеристика 84
3.8.3. Восстановление Fe(III) накопительными культурами 85
3.9. Характеристика выделенных чистых культур алкалофильных сульфат- и железоредукторов 88
3.9.1. Описание штаммов алкалофильных сульфатредукторов 88
3.9.2. Описание штамма алкалофильного железоредуктора 97
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 103
ВЫВОДЫ 106
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 107
ПРИЛОЖЕНИЯ 124
- Интенсивность сульфатредукции в донных отложениях
- Объекты исследования
- Интенсивность процесса сульфатредукции в донных осадках и микробных матах озера Соленое
Введение к работе
Актуальность темы. На территории Забайкалья насчитывается более 500 содовых озер, отличающихся по степени минерализации, рН и ионному составу воды (Дзюба и др., 1997; Намсараев и др., 2007) и представляющих тип экосистем, широко распространенных в аридных условиях. В озерах, характеризующихся щелочными значениями рН и повышенной минерализацией, функционирует алкалофильное микробное сообщество, включающее продуцентов и деструкторов органического вещества (Заварзин, 2007).
Одним из ключевых метаболитов, образуемых на первых этапах деструкции органического вещества является ацетат. В пресноводных экосистемах и кислых средах ацетат на конечных этапах деструкции используется сульфатредукторами. В содовых озерах использование ацетата вторичными анаэробами до сих пор до конца не изучено, хотя известно, что сульфатредукция является доминирующим процессом анаэробной деструкции (Горленко и др., 1999; Намсараев, Намсараев, 2007).
В настоящее время выделено и описано несколько представителей алкалофильных сульфатредуцирующих бактерий (СРБ), способных окислять Н2, формиат, лактат и некоторые и другие соединения с образованием Н2S (Pikuta, 1998; Pikuta, 2003; Zhilina, 2005). Способностью окислять ацетат среди сульфатредукторов, выделенных из содовых озер, обладает только Desulfonatronum cooperativum в бинарной культуре с Contubernalis alcalaceticum (Жилина и др., 2005). Выделение и описание СРБ, окисляющих ацетат до Н2S и СО2 в содовых водоемах представляет значительный интерес для понимания механизма стока водорода в алкалофильном микробном сообществе.
Изучению процессов восстановления железа (III) в пресноводных водоемах, термальных источниках и морских экосистемах уделено достаточно много внимания. Из этих экосистем выделено и описано более 30 культур (Слободкин и др., 1995; Slobodkin et.al., 1999; Coates et al., 1996; Finneran et al., 2002 и др.). В содовых водоемах в связи с низкой растворимостью окислов железа в щелочных условиях возможность процесса микробной железоредукции до последнего времени ставилась под сомнение. Лишь недавно были выделены и описаны единичные представители алкалофильных железоредуцирующих бактерий (ЖРБ) (Ye Q. et al., 2004; Заварзина и др., 2006; Жилина и др., 2009). К началу данных исследований железоредукторов из содовых озер выделено не было.
Исследование распространения и функционирования бактерий, восстанавливающих сульфаты и железо в щелочных условиях, имеет большое значение для понимания их роли в природе.
Целью настоящей работы являлось изучение распространения и активности гало-алкалофильных сульфат- и железоредуцирующих бактерий в содово-соленых озерах Забайкалья, выделение и характеристика культур.
Задачи исследования:
-
Охарактеризовать содово-соленые озера Забайкалья – места обитания алкалофильных микроорганизмов.
-
Определить численность алкалофильных сульфат- и железовосстанавливающих бактерий в донных осадках содовых озер.
-
Определить скорость сульфатредукции в донных осадках озер.
-
Выделить активные накопительные и чистые культуры сульфат- и железоредукторов.
-
Изучить экофизиологические и метаболитические характеристики выделенных чистых культур, определить филогенетическое положение бактерий.
Научная новизна и теоретическая значимость. Впервые проведена оценка численности железоредуцирующих бактерий в содовых озерах Забайкалья.
Из содового озера Хилганта выделена и описана культура диссимиляторных железоредуцирующих бактерий – облигатно алкалофильная (рНопт. 10,3) спорообразующая палочка, восстанавливающая цитрат железа (III) (штамм Х-07-2). Филогенетически штамм близкородственен недавно описанному железоредуктору Alkaliphilus peptidofermentans (98% сходства) (Жилина и др., 2009), однако имеются существенные отличия от типового штамма.
Из содового озера Алгинское выделен новый вид алкалофильных сульфатредуцирующих бактерий (штамм Al915-01), способный к окислению ацетата. По совокупности физиологических и филогенетических свойств штамм предлагается выделить в новый вид «Desulfonatronum acetoxidans».
Практическая ценность. Полученные результаты расширяют представление о разнообразии СРБ в природе, могут быть использованы для чтения курсов лекций по микробиологии в высших учебных заведениях. Выделенные штаммы сульфат- и железоредуцирующих бактерий представляют интерес для биотехнологии как продуценты солеустойчивых и устойчивых к высоким рН ферментов.
Апробация работы. Основные результаты работы доложены на Всероссийской конференции молодых ученых «Экология в современном мире: взгляд научной молодежи» (Улан-Удэ, 2007), 2-м Байкальском Микробиологическом Симпозиуме с международным участием «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек, водохранилищ» (Иркутск, 2007), III Международной Молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2007), Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2008), IV Международной Молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2008), научной конференции преподавателей, научных работников и аспирантов ВСГТУ (Улан-Удэ, 2009).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 научных работ, включая 4 статьи и 9 тезисов.
Объем и структура работы: Диссертационная работа изложена на ______страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Диссертация содержит ____таблиц, ____рисунков. Список литературы состоит из ____отечественных и ____зарубежных источников.
Интенсивность сульфатредукции в донных отложениях
Скорость сульфатредукции в донных осадках изучена в разных типах озер. Интенсивность процесса сульфатредукции в донных отложениях обычно в 100-1000 раз выше, чем в водной толще. Для протекания сульфатредукции в отложения должны постоянно поступать сульфаты или образовываться в поверхностном слое за счет окисления сульфида. Отмечено, что наиболее активно процесс осуществляется на глубине 0-2 см в илу, где окислительно-восстановительный потенциал составляет -100-И 50 мВ. Существенно, что численность сульфатредуцирующих бактерий не имеет прямой корреляции с интенсивностью процесса сульфатредукции. В водоемах, содержащих невысокие концентрации сульфатов, даже немногочисленная популяция может проводить активный процесс восстановления сульфатов. Показано, что СРБ в осадках пресных водоемов находятся в активном состоянии и в ряде случаев образуют вполне ощутимые количества сероводорода (Иванов, 1983).
Скорость сульфатредукции в донных осадках пресноводного озера Байкал варьировала от 0,000002 до 0,0385 мг S/(Kr сут). Максимальная скорость процесса выявлена в верхних горизонтах осадков (1-3 см) в зоне сброса сточных вод Байкальского целлюлозно-бумажного комбината. Близкие значения скорости (0,0238 мг S/(KT сут)) обнаружены в осадках, отобранных в районе развития микробных матов в бухте Фролиха. В осадках с глубоководной станции за сутки в 1 кг ила восстанавливалось до 0,0112 мг S.
Имеется немного данных о скорости процесса сульфатредукции в содовых и соленых озерах. Так в донных отложениях меромиктического соленого озера Шира, расположенного в северной части Хакасии, наибольшая скорость сульфатредукции (0,9 мг S/(KT сут)) отмечалась в поверхностных горизонтах (0-3 см). При углублении в толщу осадка интенсивность сульфатредукции снижалась. Результатом активности СРБ является закономерное снижение концентрации сульфата в осадках от 10 г/дм на поверхности до 0,75 г/дм на горизонте 20-25 (Пименов и др., 2003).
В донных осадках озера Солар Лэйк (Египет) скорость сульфатредукции достигала 240 мМ Б/(мл сут). В пробах цианобактериального мата скорость варьировала от 1000 до 2200 нМ S/(Mn сут) (Krekeler et al., 1997).
Интенсивность восстановления сульфатов в осадках соленого меромиктического озера Каике (Япония) изменялась в зависимости от времени года. Максимальная скорость сульфатредукции (5 нМ Б/(мл сут) выявлена в поверхностных и подповерхностных слоях (0-5 см) донных отложений, отобранных в июне. В осадках, отобранных в октябре, скорость редукции сульфатов была минимальной. В пробах этого месяца начиная с глубины 5 см и ниже, процесс сульфатредукции не зафиксирован (Koizumi et al., 2004).
В содовых озерах Забайкалья наиболее интенсивно процесс восстановления сульфатов (до 69,04 мг S/(Kr сут)) протекал в иловых отложениях при минерализации 3-30 г/л. Максимальные скорости сульфатредукции наблюдаются в верхних слоях донных осадков (оз. Хилганта - 5, 74 мг S/(Kr сут), слой 0-1 см). В нижних горизонтах изученных кернов скорость процесса заметно снижается (0,017 мг S/(KT сут) в слое 5-7 см). При повышении минерализации воды скорость процесса также снижается. В микробных матах исследуемы содовых озер скорости сульфатредукции значительно меньше (до 12 мг S/(Kr сут)). Интенсивность восстановления сульфатов в донных осадках щелочных озер Забайкалья и Монголии (0,08-69,04 мг S/(KT сут)) сравнима со значениями (2,7-19,2 мг Б/(кг сут)) в соленом озере Вейсово и превышает значения, полученные при исследовании соленого озера Шира (0,9 мг S/(Kr сут)) (Sorokin et al., 2004; Чеботарев и др., 1973; Пименов и др. 2003; Намсараев, Намсараев, 2007).
Объекты исследования
Объектами исследования являлись содовые и содово-соленые озера Забайкальского края (Хилганта, Горбунка, Доронинское, Зун-Торей) и Бурятии (Белое, Алгинское, Соленое и Нухэ-Нур). Микробиологические и гидрохимические исследования проводились с 2005 по 2008 гг. (приложение
1) Исследуемые озера делятся на несколько групп:
1- Онон-Борзинская группа: Хилганта, Горбунка, Доронинское, Зун-Торей
2- Баргузинская группа: Нухэ-Нур, Алгинское; 3 - Селенгинская группа: Соленое, Белое.
Озеро Хилганта (50 42 535" с.ш., 115 06 086" в.д.) расположено в мелкосопочной степной зоне Южного Забайкалья на водоразделе между реками Онон и Ага на высоте 668 м над уровнем моря в 8 км к северу от села Кункур. Озеро округлой формы, чуть вытянуто с северо-востока на юго-запад. Максимальные размеры озера 150 х 120 м, общая площадь водного зеркала составляет 1,8 кв. км, максимальная глубина 0,7-0,8 м в водный период. В зависимости от метеорологических условий глубина озера изменяется, В засуху на акватории озера остаются отдельные лужи, глубина которых составляет 0,05-0,10 м. В период дождей озеро с северной стороны частично опресняется. Дно озера блюдцеобразное и илистое. Поверх ила дно покрыто кожистым циано-бактериальным матом толщиной до 20-30 мм с хорошо выраженной слоистостью. Вода в озере соленая и прозрачная. Водно-солевое питание озеро получает за счет атмосферных осадков и вод поверхностного стока. Минерализация и рН воды в зависимости от погодных условий изменяется от 30 до 260 г/л и от 8,0 до 10,0, соответственно.
Озеро Горбунка (50 39 835" с.ш., 115 04 498" в.д ), расположено в 12 км к северу от села Кункур недалеко от оз. Хилганта на высоте 673 м над уровнем моря. Глубина озера в водный период 2,1 м, общая площадь водного зеркала 8 км2. Озеро имеет овальную форму и блюдцеобразное дно, покрытое черным восстановленным илом. Черный ил до 15-20 см имеет маслянистую консистенцию с разрывами газа и растительными остатками, ниже серый маслянистый ил без разрывов газа и растительности. Цвет воды в озере зеленовато-коричневый, вкус солоноватый. Значение рН варьируют от 9,1 до 9,9; общая минерализация изменяется от 6,5 до 14,0 г/л.
Озеро Доронинское (51 14 с.ш. и 112 14 в.д.) (устаревшее название Селитряное) расположено в 140 км от г. Чита во впадине на левом берегу реки Ингода. Озеро является одним из крупнейших минерализованных озер в Забайкалье. Относится к типу меромектических озер, в которых четко прослеживаются аэробная и анаэробная зоны. Площадь водной поверхности озера 4,5 км2, глубина около 6 м. Озеро бессточное и водный баланс находится в значительной зависимости от атмосферных осадков. Существенная роль в питании принадлежит порово-пластовым водам мезозойских отложений. Питающие воды гидрокарбонатные, с преобладанием кальция среди катионов. Рапа современного озера характеризуется средней степенью минерализации (до 36 г/л). Основным компонентом является карбонат, гидрокарбонат и хлорид натрия.
Озеро Зун-Торей - бессточное солоноватое озеро, расположено на границе Читинской области и Монголии (5022 35" с.ш. и 11557 6Г в.д.), в Ононском районе, в 5 км от с. Судунтуй. Его средняя глубина равна 4,0 м, площадь водного зеркала 302 км . Прозрачность воды составляет до 1,5 м. Форма круглая, с северной стороны есть морфологически выраженный полуостров Арал. Дно озера выложено каменистым грунтом, галькой и щебнем. Озера Доронинское и Зун-Торей примечательны тем, что в береговой зоне обнаружены песчаные маты, которые представляли собой рыхлый песок, проросший нитями цианобактерий.
Озеро Нухэ-Нур (54 01 912" с.ш., НО 16 776" в.д.). Находится в Курумканском районе в 15 км от с. Барагхан. Располагается в надпойменном понижении на степном участке долины по правому берегу реки Баргузин. Площадь водного зеркала составляет около 4 км , глубина достигает 2 м. Дно твердое и представлено мелкодисперсным илом, равномерно распределенным по всему озеру. Береговая почва покрыта в отдельные сезоны выцветами солей. Водно-солевое питание озеро получает за счет атмосферных осадков и ключа, выходящего вблизи южного берега среди болот. Тип воды - сульфатно-натриевый. Значения минерализации варьируют от 15 до 18 г/л.
Озеро Алгинское расположено в нижнем бассейне р. Баргузин, в 3 км севернее с. Алга. Площадь озера составляет 1,04 кв. км глубина 1,3 м. Относится к типу солоноватых озер евтрофного типа, имеет сульфатно-гидрокарбонатный натриевый тип воды. Значение рН изменяются от 8,6 до 9,62; ОМ варьирует от 45 до 50 г/л.
Озеро Соленое (координаты 50 35 757" с.ш. 105 44 228" в.д.), находится в Кяхтинском районе Республики Бурятия в долине реки Киран на высоте 612 м над уровнем моря. Озеро расположено в 30 км восточнее г. Кяхты и окружено горно-степным ландшафтом. Площадь водного зеркала составляет 0,36-1 кв. км, глубина - 2,5-3м. Значения водородного показателя варьируют от 9,3 от 9,9; ОМ изменяется от 6,9 до 8,12 г/л.
Озеро Белое (5132 40" с.ш. и 10702 42" в.д.) расположено в 3 км к северо-востоку от села Оронгой в Иволгинском районе Республики Бурятия. Площадь его составляет 2,6 км . Котловина озера сложена отложениями третичного периода. Почва вокруг озера солончаковая, покрыта выцветами солей, солевой режим устойчивый. Значение рН составляет 8,2-8,5. Минерализация воды 1,4-2 г/л. В 80-е гг прошлого века здесь проводилась добыча поваренной соли. В донных осадках озера встречается значительное количество мирабилита. Вода в озере имеет сульфатно-натриевый состав.
Интенсивность процесса сульфатредукции в донных осадках и микробных матах озера Соленое
В содовых озерах сульфатредукция является наиболее активным процессом на заключительных этапах деструкции органического вещества (Горленко и др., 1999). В донных осадках и микробных матах озера Соленое была определена скорость сульфатредукции и произведен расчет органического вещества, затрачиваемого на этот процесс. Наиболее интенсивно процесс восстановления сульфатов протекал в пробах цианобактериального мата- 1,80 мг S/(KT сут) (табл. 3.5.1).
Полученные данные сравнимы с имеющимися в литературе. Сравнительный анализ с полученными ранее данными по интенсивности метаногенеза (Солоноватые и соленые озера Забайкалья, 2009) указывает на преобладание сульфатредукции на терминальных этапах деструкции ОВ.При исследовании вертикальной стратификации донных осадков оз. Соленое изотопный состав углерода органического вещества и карбонатов составлял от -26.14%о до -29.60%о и от -11.21%о до -14.3%о, соответственно. В слое 6-7 см происходит облегчение органического вещества и карбонатов, по-видимому, здесь находится зона анаэробной деструкции органического вещества. В результате образования газов изотопно-легкой фракции в анаэробных условиях и их потребления микроорганизмами органическое вещество оказывается обедненным изотопом С. В толще донных осадков к нижним горизонтам изотопный состав углерода утяжеляется, что свидетельствует о разложении, в первую очередь, более легкой фракции органического вещества (рис. 3.6.1). Вниз по слоям донных осадков до 5 см происходит накопление органического вещества и карбонатов. На глубине от 5 до 7 см наблюдается резкое снижение и от 7 до 13 см происходит обратное увеличение содержания органического вещества и карбонатов (рис. 3.6.2).
Накопительные культуры сульфатредуцирующих бактерий были получены на двух, характерных для вторичных анаэробов, субстратах -лактате и ацетате. Конечная концентрация субстрата в среде составляла 0,4%.
Значения рН и солености в среде устанавливались в соответствии с гидрохимией озер, из которых выделялись накопительные культуры. Значение водородного показателя составляло 8,5 - 9,5. Концентрация NaCl в среде изменялась от 0 до 50 г/л.
Шесть из двенадцати накопительных культур алкалофильных СРБ были выделены при рН 8,5 и концентрации NaCl 15 г/л. Одна - при рН 9,5 и содержании NaCl 15 г/л. При этих условиях из каждого исследуемого озера была изолирована одна накопительная культура, за исключением озера Хилганта. Из данного озера было получено две накопительные культуры: одна - из проб микробного мата, отобранного в ходе экспедиции 2000 г., вторая - из пробы воды, отобранной в этом же году. Не смотря на то, что посев проб был произведен относительно давно, из них удалось получить активные накопительные культуры СРБ. В качестве донора электронов и ростового субстрата при этом использовался лактат. Пять накопительных культур СРБ из корки цианобактериального мата (пробы 2006 г.) были получены на градиенте рН и солености, при этом активные накопительные культуры были получены только при рН 9,5 и концентрации NaCl 0, 1,5, 10, и 50 г/л. В качестве единственного источника углерода и донора электронов использовали ацетат.
