Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1. Влияние засоления на растения 8
1.2. Роль ионных каналов при засолении 11
1.3. Токсичное действие ионов Na+на растения .13
1.4. Влияние ионов хлора на рост растений 18
1.5. Трудности оценки устойчивости растений к ионам Na+ 20
1.6. Механизмы солеустойчивости 21
1.7. Гены, ответственные за синтез белков-переносчиков ионов 24
1.8. Регуляция водного обмена при засолении 31
1.9. Аквапорины 36
1.10. Роль абсцизовой кислоты в реакции растений на засоление 38
1.11. Ростовая реакция растений на засоление 42
2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 46
2.1. Условия выращивания растений и проведение экспериментов 46
2.2. Методы исследования 47
2.2.1. Определение скорости транспирации 47
2.2.2. Определение осмотического потенциала 47
2.2.3. Относительное содержание воды 47
2.2.4. Определение экспрессии гена HvPIP2;l 48
2.2.5. Концентрация хлорид-ионов 48
2.2.6.Измерение скорости потока ксилемного экссудата и расчет гидравлической
проводимости корней 49
2.2.7. Определение устьичной проводимости 50
2.2.8. Определение длины и площади листьев 51
2.2.9. Определение содержания хлорофилла 51
2.2.10. Экстракция, очистка и концентрирование гормонов 52
2.2.11. Твердофазный иммуноферментный анализ 52
2.2.12. Статистическая обработка 53
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 54
3.1 Влияние засоления на растения ячменя (Hordeum vulgare) и пшеницы (ТгШсит durum) 54
3.2. Изучение водных отношений и роль аквапоринов в реакции растений на засоление на примере двух линий ячменя Hordeum spontaneum ТІ и 20-45, контрастных по солеустойчивости 62
3.3. Использование сортов Прерия и Михайловский для изучения влияния засоления на растения ячменя 75
3.4. Сравнение действия натрий-хлоридного засоления на примере различных сортов растений ячменя 90
Выводы 106
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 107
- Влияние засоления на растения
- Условия выращивания растений и проведение экспериментов
- Влияние засоления на растения ячменя (Hordeum vulgare) и пшеницы (ТгШсит durum)
Введение к работе
Актуальность. Засоление - один из наиболее важных абиотических факторов внешней среды, приспособление к которому определяет способность растений выживать в этих условиях и давать урожай. Среди возделываемых растений нет галофитов и большинство важнейших сельскохозяйственных культур чувствительны к действию засоления (Балнокин и др., 2005). Однако среди них выделяются виды и сорта, обладающие относительной устойчивостью к неблагоприятному воздействию токсичных ионов (Строгонов 1962; Flowers, 2004). С точки зрения агрономии наиболее важным критерием солеустойчивости является урожайность растений на засоленных почвах. Однако отбор солеустойчивых форм в полевых условиях осложняет неравномерность распределения засоленных участков (Munns, 2005). Поэтому не прекращается поиск способов оценки солеустойчивости растений в контролируемых лабораторных условиях. Для того чтобы повысить эффективность отбора, необходимо хорошо понимать, как формируется солеустойчивость. В действии засоления на растения выделяют 2 фактора: токсический компонент, связанный с накоплением ионов (прежде всего, ионов натрия) в цитоплазме и дефицит воды (осмотический компонент), обусловленный присутствием избытка ионов в почве (Neumann, 1993). Основное внимание исследователей привлекает изучение механизмов, обеспечивающих ионный гомеостаз при засолении (Yeo, 1998). При этом осмотический компонент воспринимается скорее как фактор, маскирующих проявление токсического компонента (Munns et al., 2002). Вместе с тем, осмотический и токсический компоненты в какой-то мере взаимосвязаны: токсичные ионы поступают в растение
4 с транспирационным потоком, а их накопление нарушает водный обмен (например, функционирование устьичного аппарата (Robinson et al., 1997)). Однако в литературе можно найти не так много сведений об особенностях регуляции водного обмена у растений, различающихся по солеустоичивости, и эти сведения разрознены и противоречивы. Так можно встретить утверждения, что устьичная проводимость выше у солеустойчивых растений (Volkov et al., 2004), а также противоположные сведения о том, что она выше у чувствительных к засолению растений (Rivelli et al., 2002). Все сказанное свидетельствует о том, что водному обмену растений на фоне засоления уделялось недостаточно внимания, что определяет актуальность нашей работы.
Цель работы состояла в выявлении особенностей регуляции водного обмена при натрий-хлоридном засолении у растений, различающихся по степени устойчивости к засолению, и их значения в формировании солеустоичивости. Для решения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Провести сравнительное изучение водного обмена
относительно солеустойчивых растений ячменя и более
чувствительных к засолению растений твердой пшеницы и выявить
особенности их устьичной реакции при кратковременном и
длительном действии засоления.
Оценить значение экспрессии гена аквапорина HvPIP2;4 в регуляции водного обмена при засолении путем сопоставления уровня экспрессии гена, гидравлической и устьичной проводимости у линий растений Hordeum spontaneum, различающихся по солеустоичивости.
С помощью изучения контрастных по засухоустойчивости растений ячменя выявить значимость регуляции устьичной
5 проводимости и транспирации в ограничении потока ионов и предотвращении их токсичного действия, а также поддержании газообмена, фотосинтеза и роста.
4. Провести сравнительное изучение уровня накопления АБК и
скорости закрытия устьиц при кратковременном действии хлорида
натрия для того, чтобы подтвердить (или опровергнуть) гипотезу о
том, что АБК контролирует высокую скорость транспирационного
потока при засолении.
5. Провести сравнительный анализ особенностей водного
обмена и роста на засолении растений пяти сортов из коллекции ВИР
с целью проверки воспроизводимости закономерностей,
обнаруженных при сравнительном изучении растений двух видов и
пар контрастных по солеустойчивости и засухоустойчивости сортов и
линий.
Научная новизна. Впервые проведено сравнение экспрессии гена аквапорина HvPIP2;4 растений разных линий Hordeum spontaneum (дикий вид ячменя) и показана связь уровня экспрессии с изменением гидравлической и устьичной проводимости, а также более выраженное снижение экспрессии гена, гидравлической проводимости и транспирации у более солеустойчивой линий. Сравнительное изучение устьичной реакции на засоление у относительно солеустойчивых и более чувствительных к засолению видов, сортов и линий растений показало, что способность растений быстро закрывать устьица при кратковременном действии засоления необходима для формирования солеустойчивости растений. Уровень накопления АБК в листьях растений при кратковременном действии хлорида натрия был выше у тех растений ячменя, у которых сильнее снижалась устьичная проводимость, что подтверждает роль этого
гормона в регуляции транспирационного потока при засолении. Обнаружена связь между уровнем накопления ионов хлора у растений ячменя и их способностью быстро снижать транспирационный поток при засолении. Показано, что характер связи между уровнем транспирации и солеустойчивостью меняется при длительном действии засоления: в этом случае, в отличие от кратковременного действия засоления более высокий уровень транспирации обнаружен у более солеустойчивый сортов ячменя, что коррелирует с их способностью к более быстрому накоплению биомассы.
Практическая значимость. Обнаружены особенности водного обмена у более солеустойчивых форм, которые проявляются в быстром снижении уровня экспрессии генов аквапоринов, снижении гидравлической проводимости и транспирации, что ограничивает приток токсичных ионов и их негативное действие на растения. Показано, что при длительном действии засоления признаком более высокой солеустойчивости растений является относительно высокий уровень их устьичной проводимости. Эти показатели могут быть использованы в системе оценки селекционного материала в процессе отбора солеустойчивых форм.
Апробация работы. Основные положения работы были представлены на международном симпозиуме «Сигнальные системы клеток растений: Роль в адаптации и иммунитете» (Казань, 2006), VI съезде общества физиологов растений России (Сыктывкар, 2007).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ, в том числе 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК России.
7 Список сокращений
L, Lp, Lpr -гидравлическая проводимость корней;
Jv - скорость потока ксилемного экссудата;
Ч? - водный потенциал; Д - разность водных потенциалов;
АБК - абсцизовая кислота
СВ - содержание воды в тканях растений;
ОСВ - относительное содержание воды в тканях растений;
ПЭГ - полиэтиленгликоль.
ПЦР - полимеразная цепная реакция
Влияние засоления на растения
История показывает, что проблема засоления не является новой. Примером может служить упадок Шумерской цивилизации в Месопотамии, где сельское хозяйство сильно пострадало от засоления. (Jacobson and Adams, 1958). Засоление является одной из наиболее серьезных проблем для мирового сельского хозяйства (Greenway and Munns, 1980; Bui et al., 1998). В настоящий момент более 800 миллионов га подвержено засолению, что составляет около 6 % всей поверхности суши. В связи с этим засоление почв очень сильно ограничивает производство сельскохозяйственных культур (Greenland, 1984). Засоление земель, в основном - результат естественных явлений: аридности климата или/и действия грунтовых вод (Szabolcs, 1994; Rengasamy, 2006). Однако существенный вклад в увеличение засоленных площадей оказывает и ирригационное земледелие. Постепенное засоление орошаемых земель в будущем будет все больше осложнять земледелие на большинстве продуктивных площадей Земли (Ashraf, 1984). Проблема засоления почв существует на всех континентах, главным образом в засушливых и полузасушливых регионах, где системы орошения связаны с большими реками (McWillam, 1986). От засоления страдают многие районы на земле. Так оно является серьезной проблемой для Австралии, Турции, Пакистана, Ирана, Индии, Китая, Мексики и многих других стран Азии, Африки и Южной Америки (Shainberg and Letey, 1984; Gupta and Abrol, 1990).
Как установлено многочисленными исследователями, сущность процесса засоления в условиях аридного климата заключается в том, что высокий уровень инсоляции резко усиливает испарение почвенной влаги, в результате чего происходит накопление легкорастворимых солей грунтовых вод в верхнем, корнеобитаемом слое почвы. Кроме того, в долинах рек засоление может вызываться высоким уровнем минерализованных грунтовых вод.
Основными компонентами засоленных почв являются катион натрия (в отдельных случаях также магния) и анионы хлора, сульфата и карбоната (или бикарбоната). Засоление почвы каким-либо одним видом соли в природных условиях практически не встречается. Обычно в почве присутствуют смеси солей. В зависимости от состава солей в почве и грунтовой воде выделяют карбонатное, сульфатное, хлоридное и смешанное засоление (Гедройц, 1932). Одним из самых опасных видов засоления считается натрий-хлоридное, поскольку повреждающее действие на растения оказывают как ионы натрия (Munns, 2005), так и хлора (White and Broadly, 2001). Также известно, что высокие концентрации ионов натрия оказывают негативное влияние и на структуру почвы (Tester and Davenport, 2003).
Снижение степени засоления производят путем мелиоративных и агротехнических мероприятий. С этой целью традиционно применяют гипсование и другие методы рассолонцевания почв (Гедройц, 1932; Ферсман, 1934). Фитомелиорация, т.е. высев солеустойчивых диких растений на засоленных почвах с целью улучшению их свойств, применялась издавна (Янтурин и др., 1994). Однако и после этих мероприятий на мелиорированных почвах должны высеваться солеустойчивые растения.
Легко приспосабливаться к высокому содержанию солей в почве способны лишь галофиты, растения засоленных местообитаний. Большинство же культурных растений являются гликофитами и обладают ограниченной способностью выживать в условиях засоления. Однако среди них выделяются виды и сорта, обладающие относительной устойчивостью к неблагоприятному воздействию токсичных ионов (Munns et al., 2006).
Существуют разные пути отбора устойчивых к засолению растений: 1) селекция более устойчивых видов и сортов (Flowers and Yeo, 1995); 2) использование мутагенов для отбора мутаций, позволяющих повысить устойчивость (Wu et al, 1996); 3) внедрение в растительный геном с помощью методов генной инженерии генов, увеличивающих способность клеток выдерживать вредное действия токсичных ионов (Bohnert and Jensen, 1996).
Однако все эти подходы требуют либо много затрат времени, либо больших денежных вложений. А генетические манипуляции с растениями до сих пор не привели к определенным положительным результатам.
Ионы поступают из почвы в корни растений вместе с водой. Существует много концепций о том, как вода движется по растению и механизмах регуляции водного тока (Самуилов, 1972, Гусев, 1974; Карманов, 1974; Жолкевич 2001; Лялин, 1989; Зялалов, 1983, 1984, 1999, 2004; Мелещенко, 1997, 1998; Steudle, 2000). Изучение химических свойств клеточных стенок растений показало, что поток ионов вместе с водой свободно идет по межклетникам молодых тканей корня благодаря гидрофильное клеточных стенок (Steudle, 2000). С открытием поясков Каспари (отложений гидрофобных веществ: суберина и лигнина, расположенных в области эндодермы и экзодермы корня) стало ясно, что в дифференцированной части корня образуется барьер на пути воды и ионов. Было обнаружено, что засоление ускоряет и усиливает отложение гидрофобных веществ в корне (Tester and Davenport, 2003).
Условия выращивания растений и проведение экспериментов
Исследования проводили в лабораторных условиях на растениях ячменя {Hordeum vulgare, сорта Golf; ТІ и 20-45; Прерия и Михайловский; Ранний, Красноярский 1, Красноярский 80, Porvenir и Riso-1058), и яровой твердой пшеницы {Triticum durum Desf., сорт Безенчукская 139) в водной культуре. Семена ячменя и пшеницы проращивали в темноте в течение 2-3 суток на дистиллированной воде с добавлением 10"5 М СаС12, при температуре 24 С. Семисуточные проростки пересаживали на 10 % среду Хогланда-Арнона-I и выращивали при освещенности 18000 лк и 14-часовой продолжительности светового дня.
Для длительных экспериментов растения пересаживали на 100 % питательную среду Хогланда-Арнона-I и выращивали в контейнерах из оргстекла. Для предотвращения оксидативного стресса питательную среду непрерывно аэрировали с помощью микрокомпрессоров. Контейнеры оборачивали светонепроницаемой бумагой во избежание подавления роста корневой системы.
Условия проведения опытов по засолению. Засоление вызывали добавлением в питательный раствор хлорида натрия до конечной концентрации 100 шМ. Эта концентрация NaCl наиболее часто используется в физиологических экспериментах по изучению действия засоления (Fricke, 1997; Munns, 1993; Neumann, 1997).
Условия проведения опытов по водному дефициту. Водный дефицит создавали, добавляя непроникающее из питательного раствора в корни растений нейтральное осмотически активное вещество полиэтиленгликоль 6000 (ПЭГ) до конечной концентрации 13 % .
Транспирацию определяли весовым методом. Для этого по пять растений рассаживали в пластиковые стаканчики, которые затем накрывали фольгой, чтобы не происходило испарения с поверхности раствора, и периодически взвешивали через каждые 10-15 мин. По разнице веса стаканчика рассчитывали количество испарившейся воды, в расчете на одно растение в час.
Осмотический потенциал определяли с помощью осмометра CAMLAB (Великобритания) по температуре замерзания. Для анализа отбирали в среднем по 7 - 10 растений на каждую точку, сначала замораживали, а затем оттаивали. Клеточный сок, используемый для анализа, собирали с помощью шприца.
Определяли в дифференцированной части листа проростков пшеницы. В растущей части листа определяли содержание воды. Измерение проводили согласно методике описанной Pardossi et al. (1992). ОСВ рассчитывали по формуле:
Сырой вес определяли сразу после отделения листа от растения. Дифференцированную часть листа для определения тургорного веса помещали в закрытые стеклянные банки с дистиллированной водой при 20С на 24 часа в условиях тусклого света. Для определения сухого веса образцы из растущей зоны и дифференцированную часть листа высушивали при 85С в течение 24 часов (Pardossi et al., 1992).
Влияние засоления на растения ячменя (Hordeum vulgare) и пшеницы (ТгШсит durum)
Среди возделываемых растений нет галофитов и большинство важнейших сельскохозяйственных культур чувствительны к действию засоления (Балнокин и др., 2005). Однако среди них выделяются виды и сорта, обладающие относительной устойчивостью к неблагоприятному воздействию токсичных ионов. Представляется важным использовать более устойчивые к засолению сельскохозяйственные культуры в областях с повышенной засоленностью почв.
До сих пор нет ясности в вопросе, когда можно обнаружить видимые различия в реакции чувствительных и устойчивых к засолению видов. Одни считают (Munns, 1995), что такие различия можно уловить только через месяц роста растений в условиях засоления, другие считают, что это различие становится заметным гораздо раньше (Neumann, 1997).
Выявление солеустойчивых и солечувствительных сортов ячменя представляет значительные трудности из-за произрастания этой культуры в различных климатических зонах на почвах, отличающихся ионным составом и т.д. В связи с этим определение солеустойчивости часто проводят в контролируемых условиях и в качестве стрессового фактора используют высокие концентрации NaCl. (Flowers, 2004).
Для проведения опытов нами были выбраны растения ячменя и пшеницы. Оба вида являются важными зерновыми культурами, которые, судя по данным литературы, могут различаться по солеустойчивости (Munns et al., 2000).
Ранее в нашей лаборатории изучалось влияние на растения кратковременного действия хлорида натрия. Уже в течение первых часов после начала действия засоления были выявлены некоторые различия в реакции растений ячменя и пшеницы (Fricke et al., 2004; Ахиярова и др., 2005; Веселое и др., 2007). Интересно было проследить, как эти первоначальные различия проявятся при более длительном действии на растения засоления.
Добавление в питательную среду хлорида натрия до конечной концентрации 100 мМ привело к снижению устьичнои проводимости растений пшеницы и ячменя по сравнению с контрольными растениями (рис. Поскольку растения ячменя и пшеницы различались по уровню устьичнои проводимости, результаты представлены как процент от значений контрольных растений, которые не подвергались действию засоления. На вторые сутки засоление вызывало снижение устьичной проводимости на 30 % у растений пшеницы и на 40% у растений ячменя. На третьи сутки снижение составило 40% у более чувствительного вида (пшеница) и 70% у относительно устойчивого (ячменя).
Таким образом, сначала уменьшение устьичной проводимости было сильнее выражено у более устойчивых растений ячменя. Но уже на четвертые сутки экспозиции картина изменилась. В то время, когда устьичная проводимость подвергнутых засолению растений пшеницы оставалась низкой, у растений ячменя этот показатель вернулся к контрольным значениям.
В результате добавления в питательный раствор хлорида натрия до конечной концентрации 100 мМ происходило снижение его водного потенциала, что затрудняло поглощение воды растениями. Вода переставала поступать в корень из-за исчезновения градиента водного потенциала между средой корнеобитания и клетками корня (осмотический компонент действия засоления). Закрытие устьиц является реакцией на снижение доступности воды. Все ионы, и токсичные в том числе, попадают в растения с транспирационным потоком. Хотя поддержание ионного гомеостаза зависит от функционирования переносчиков, тем не менее, в начале действия засоления падение устьичной проводимости позволяет ограничить транспирацию, а вместе с ней и поступление токсичных ионов. На основании полученных нами данных по устьичной проводимости, мы можем предположить, что в первые трое суток засоления растения ячменя, снижая уровень транспирации, ограничивали поступление токсичных ионов в побеги с восходящим током воды. В отличие от них растения пшеницы, после небольшого снижения, сохраняли скорость транспирации на одном уровне на протяжении последующих трех суток. Однако длительное закрытие устьичного аппарата может привести к подавлению фотосинтеза из-за нарушения газообмена. Это проявляется в уменьшении активности тилакоидов и скорости ассимиляции углекислого газа (Yordanova et al., 2000). Также снижается активность фотосинтетических ферментов. Например, при высоком уровне водного стресса активность рубиско в листьях пшеницы Triticum aestivum уменьшается на 27% (Kicheva et al., 1994). Кроме того, в результате длительного закрытия устьиц уменьшается снабжение побега питательными элементами и ингибируется рост.
Похожие диссертации на Особенности роста и водного обмена растений пшеницы и ячменя с различной солеустойчивостью при натрий-хлоридном засолении
