Содержание к диссертации
Введение
1 .ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1 . Пути и механизмы движения воды по растению 7
1.1.1 .Поглощение воды клетками 7
1.1.2. Пути проникновения воды в клетки 8
1.1.3. Движение воды по тканям. Соотношение апопластного транспорта и транспорта от клетки к клетке 10
1.1.4. Движущие силы и скорость потока воды по растению 12
1.1.4.1. «Нижний концевой двигатель» 12
1.1.4.2. «Верхний концевой двигатель». Водный потенциал листа и транспирация 14
1.1.4.3. Сопротивление движению воды по растению 16
1.2. Регуляция водного обмена при изменении внешних условий 18
1.2.1. Регуляция устьичной проводимости 21
1.2.2.Регуляция гидравлической проводимости 25
1.2.3. Генерация АБК- сигнала как фактор регуляции водного обмена 26
1.2.4. Быстрый ростовой ответ на изменение внешних условий как показатель водного обмена 29
1.3. Водный обмен при засухе и засухоустойчивость 32
1.3.1. Морфологические и физиологические реакции при длительном водном стрессе 32
1.3.2. Поиск физиологических критериев в селекции на засухоустойчивость 35
2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 39
2.1. Условия выращивания растений и проведение экспериментов 39
2.1 1. Объекты и условия выращивания растений 39
2.1.2. Проведение экспериментов при повышении температуры воздуха.40
2.1.3. Проведение экспериментов по подавлению флоэмного транспорта. 41
2.2. Методы исследования 41
2.2.1. Измерение роста растений 41
2.2.2. Определение коэффициента растяжимости 42
2.2.3. Определение транспирации, устьичной проводимости и относительного содержания воды в растениях 42
2.2.4. Измерение осмотического потенциала тканей растений 43
2.2.5. Измерение скорости потока ксилемного экссудата и расчет гидравлической проводимости корней 44
2.2.6. Экстракция, очистка и концентрирование гормонов 46
2.2.7. Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) 47
2.2.8. Статистическая обработка данных 47
3.Результаты и обсуждение 48
3.1. Рост и водный обмен растений 48
3.1.1. Торможение роста листа растений пшеницы при повышении температуры воздуха как показатель дефицита воды 54
3.1.2. Механизм восстановления роста листа растений пшеницы в условиях увеличения температуры воздуха 54
3.1.2.1. Роль осмотического приспособления в восстановлении роста при повышении температуры воздуха 54
3.1.2.2. Растяжимость листа при повышении температуры воздуха 57
3.1.2.3. Относительное содержание воды, транспирация и устьичная проводимость при восстановлении роста 59
3.1.2.4. Приток воды из корней и гидравлическая проводимость 61
3.2. Гормональная регуляция ответа растений на повышении температуры воздуха 69
3.2.1. Транспорт АБК с ксилемным соком при повышении температуры. 71
3.2.2. Роль флоэмного транспорта в распределении АБК между побегом и корнем растений пшеницы при повышении температуры воздуха 75
3.2.3. Реакция мутантных растений ячменя с низкой способностью к синтезу АБК на повышение температуры воздуха 78
3.3. Реакция устьиц разных сортов на увеличение транспирационного
запроса как диагностический признак в селекции на засухоустойчивость..81
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 94
- Пути и механизмы движения воды по растению
- Условия выращивания растений и проведение экспериментов
- Рост и водный обмен растений
Введение к работе
Актуальность. Поддержание оводненности тканей растений - одно из необходимых условий выживания растений и их приспособления к факторам окружающей среды. Сложность выполнения этого условия обусловлена тем, что большинство наземных растений теряет огромное количество воды за счет транспирации (за один час растения могут испарять количество воды, равное их весу) (Зялалов, 2004). Ограничение потерь воды за счет закрытия устьиц представляется рациональным решением данной проблемы. Поэтому не удивительно, что многочисленные исследования в области водного обмена были направлены на изучение регуляции устьичной проводимости (Tardieu, Davies, 1993; Matzner, Comstock, 2001; De Silva et al, 1985; Davies, Zhang, 1991; Gowing et al., 1993; Mansfild, McAinsh, 1995). В частности была предпринята попытка отбора растений на засухоустойчивость по их способности быстро накапливать АБК и закрывать устьица (Quarrie, 1999). Однако закрытие устьиц нарушает газообмен, фотосинтез и, как следствие, должно приводить к снижению продуктивности растений (Fisher et al., 1986; Чернядьев, 1993; Jones, 1998). Вероятно, по этой причине отбор растений по их способности быстро закрывать устьица привел к противоречивым результатам (Fischer et al., 1998; Quarrie et al., 1999). Альтернативный способ обеспечения оводненности растений заключается в увеличении притока воды из корней. Известно, что растения с хорошо развитой корневой системой более устойчивы к засухе (Альтергот и др., 1976; Blum, Sullivan, 1993). Но, вместе с тем, затраты пластических и энергетических ресурсов на развитие корневой системы снижают способность растения обеспечивать быстрый рост листьев и формировать фотоассимилирующую поверхность (Bolanos et al., 1993). Другая возможность повышения притока воды из корней заключается в снижении сопротивления тканей растений движению воды (иными словами, в увеличении гидравлической проводимости). Известно, что гидравлическая проводимость в растении может увеличиваться в ответ на возросший транспирационный запрос (Steudle, Peterson, 1998). Открытие специализированных водных каналов, регулирующих проницаемость клеточных мембран для воды (Chrispeels, Maurel, 1994; Kjellbom et al, 1999), стало стимулом для пристального внимания исследователей к проблеме регуляции гидравлической проводимости у растений. Одним из подходов в решении проблемы регуляции водного обмена у растений может быть сравнение реакции растений нескольких сортов, отобранных для возделывания в разных климатических условиях. Их изучение расширяет представление о возможных вариантах реагирования растений на возрастание дефицита воды в окружающей среде и может быть полезным в поиске новых критериев для отбора засухоустойчивых форм.
В связи со сказанным, цель данной работы состояла в том, чтобы оценить относительную роль устьичной и гидравлической проводимости в регуляции водного обмена у различных генетических форм растений пшеницы и ячменя при увеличении дефицита воды в воздушной среде.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. На одном из сортов растений пшеницы детально изучить влияние увеличения температуры воздуха на устьичную и гидравлическую проводимость, относительное содержание воды и рост растений растяжением.
2. Изучить динамику содержания АБК в растениях при повышении температуры воздуха для того, чтобы выявить возможную роль этого гормона в регуляции водного обмена при данном воздействии.
3. Исследовать роль транспорта АБК по флоэме и ксилеме в регуляции распределения гормона при повышении транспирационного запроса (нагреве воздуха).
4. Сравнить реакцию растений исходных и мутантных растений ячменя, отличающихся пониженной способностью синтезировать АБК, на повышение температуры воздуха.
5. Сопоставить реакцию растений нескольких сортов пшеницы на дефицит воды в воздухе в лабораторных и полевых условиях.
6. Сопоставить поведение устьиц растений разных сортов пшеницы со способностью формировать урожай в разных климатических и погодных условиях. Научная новизна. Впервые не только в лабораторных, но и полевых условиях обнаружена контрастная реакция устьиц растений разных сортов пшеницы на повышение дефицита воды в воздухе. В полевых условиях показано, что на фоне высокой влажности почвы закрытие устьиц в ответ на снижение относительной влажности воздуха характерно не для всех сортов: у растений сортов Безенчукская 139 и Ирень, устьичная проводимость не снижалась, а увеличивалась. Эта не описанная ранее особенность сортов коррелировала с их высокой урожайностью в отсутствие почвенной засухи. Эксперименты с мутантными растениями ячменя с пониженной способностью к синтезу АБК показали, что такие растения не могли поддерживать оводненность тканей при повышении температуры воздуха. Снижение способности мутантных растений поддерживать оводненность в этих условиях связано не с особенностью реакции их устьиц, а с регуляцией гидравлической проводимости корней. Это указывает на роль АБК в регуляции притока воды из корней в соответствии с транспирационным запросом. Показано, что быстрое накопление АБК в корнях растений при повышении температуры воздуха обусловлено как подавлением транспорта гормона из корней по ксилеме, так и активацией его притока из побега по флоэме. Практическая значимость работы. Показано, что быстрое закрытие устьиц было характерно для растений, способных давать стабильный урожай при почвенной засухе, в то время как растения с высокой устьичной проводимостью были более урожайными в условиях с хорошо увлаженной почвой. Особенность устьичной реакции, которая проявляется как в лабораторных, так и в полевых условиях, может быть использована для целенаправленного подбора пар для скрещивания и отбора растений в популяции для создания сортов с заданными свойствами.
Пути и механизмы движения воды по растению
Поступление воды в растение и его клетки происходит под действием градиента водного потенциала, т.е. за счет того, что вода перемещается оттуда, где ее больше, туда, где ее меньше (из почвы в корни, по ксилемным сосудам в побег и т.д.). Принято считать, что водный потенциал дистиллированной воды равен нулю, а в присутствии растворенных ионов ее потенциал становится отрицательным. Рассмотрение процесса движения воды начнем с ее поглощения клеткой. В отличие от животных, клетки которых могут существовать только в изоосмотической среде, т.е. при равенстве концентрации осмотически активных веществ вне и внутри клетки, в клетке наземных растений всегда больше осмотиков, чем вне нее (Мелещенко, 1998). Это достигается за счет активного (с затратой энергии) поглощения ионов, происходящих в клетке синтетических процессов и т.д. Поэтому химический (иными словами осмотический) потенциал воды в клетке растений ниже, чем вне нее. Например, осмотический потенциал клеток листьев растений пшеницы и ячменя составляет около -1 МПа (10 атмосфер), в то время как осмотический потенциал ксилемного сока в несколько раз выше (т.е. он более разбавленный) (Vysotskaya, 2004). Это определяет способность клетки поглощать воду, в результате чего увеличивается ее объем (происходит эластическое, т.е. обратимое растяжение). Поэтому не удивительно, что поглощение воды связано с поглощением ионов. Однако поглощение воды клеткой не бесконечно: увеличение объема клетки ограничено жесткой клеточной стенкой. Давление воды на клеточные стенки и ее противодействие определяет тургор клетки. Его величина колеблется у клеток листьев растений ячменя и пшеницы в пределах 0,5-0,8 МПа (Fricke, 1997). Тургор противодействует поступлению воды в клетку, и поэтому ее водный потенциал определяется не только осмотическим потенциалом, но и тургором. Поглощение воды клеткой происходит до момента установления равновесия, т.е. равенства водных потенциалов клетки и окружающей среды. В растущей клетке складывается несколько иная ситуации. Здесь клеточная стенка способна к значительному пластическому (т.е. необратимому) растяжению. В результате биохимических процессов ослабляются связи между полимерами клеточной стенки, она становится рыхлой, в нее встраиваются новые химические компоненты, и в результате происходит ее растяжение и увеличение объема клетки в 10-100 раз (Cosgrove, 1993). Пока это происходит, тургор растущей клетки поддерживается на низком уровне, равновесие не наступает, и за счет роста клетки растяжением поддерживается постоянное поступление в нее воды (можно сказать и наоборот, что рост клеток растяжением поддерживается за счет поступления воды) (Воуег, 1968). Таким образом, поступление воды в клетку происходит благодаря накоплению осмотически активных веществ и разрыхлению клеточной стенки растущих клеток.
Липидный бислой клеточной мембраны в определенной степени проницаем для воды. Это видно из опытов с искусственными мембранами, полученными из липидов (Shaffiier, 1998). По этой причине долго шел спор о су ществовании в клеточных мембранах специализированных каналов для воды. Снижение проницаемости клеток под влиянием солей ртути свидетельствовало о значении белков в транспорте воды через мембрану (ртуть ингибирует активность белков, разрушая их сульфгидрильные связи) (Preston et al., 1992). Все это указывало на участие белковых каналов в поглощении воды клеткой. Однако еще 13 лет назад предполагалось, что вода поступает в клетку через ионные каналы. Открытие специализированных водных каналов аквапоринов резко изменило ситуацию (Agre et al., 1993; Chrispeels, Maurel 1994; Shaffner, 1998; Шапигузов, 2004). Оказалось, что они присутствуют в клеточной мембране некоторых клеток животных и растений в большом количестве, а синтез белков на мРНК аквапоринов растений в яйцеклетке лягушки резко увеличивало проницаемость мембран яйцеклеток для воды (они быстрее увеличивались в объеме в гипотоническом растворе) (Kammerloher et al., 1994). Методы молекулярной биологии позволили обнаружить большое количество различных генов и соответствующих белков аквапоринов. Часть из них встраивается в клеточную мембрану (плазмалемму), а часть - в вакуолярную (в тонопласт) (Hofte et al., 1992). Несмотря на разнообразие их первичной структуры, их пространственная организация сходна. Она позволяет аквапо-ринам располагаться в мембране таким образом, что внутри их молекулы образуется узкий просвет, достаточный для проникновения лишь таких мелких молекул, как вода (Chrispeels, Maurel, 1994). Показано, что фосфорилирова-ние остатков молекул серина в определенном положении первичной структуры аквапоринов приводит к их активации, а для поддержания активности некоторых из них (хотя и не всех) требуется наличие сульфгидрильного мостика между молекулами цистеина, что и определяет их чувствительность к действию ионов ртути. Обнаружено, что в растворе с повышенной концентрацией осмотически активных веществ быстро изменяется степень фосфорилиро-вания аквапоринов (Johansson et al., 1996; Kjellbom et al., 1999). В результате снижается проницаемость клеточный мембраны для воды, что замедляет процесс обезвоживания и дает клетке время включить иные механизмы защиты (например, накопление осмотически активных веществ, т.е. осморегуляцию).
Условия выращивания растений и проведение экспериментов
Исследования проводили на проростках твердой яровой (Triticum durum Desf., сорта Безенчукская 139,) и мягкой пшеницы (Triticum aestivum L., сорта Омская 20, Казахстанская 10, Башкирская 26, и Ирень) в лабораторных и полевых условиях. Проводились лабораторные опыты на растениях ячменя (Hordeum vulgare L.) сорта Steptoe и его мутантной формы Az 34 с пониженной способностью к синтезу АБК (Bacon et al., 1998.).
Сорт Безенчукская 139 - твердая пшеница - имеет среднею урожайность 24,3 ц/га. Среднеспелый, вегетационный период 73-86, среднеустойчив к полеганию и засухе. Масса 1000 зерен 38-42.
Сорт Омская 20 - мягкая пшеница - к засухе устойчива, урожайность сорта очень высокая и составляет в зонах районирования (зауральская лесостепь) 38 - 40 ц/га. В засушливые годы (1995) урожайность была: Московская 35 - 6,8 ц/га, Казахстанская 10 - 8,7 ц/га, Омская 20 17,9 ц/га. Вегетационный период 94-130 дней, среднепоздний. Масса 1000 зерен 38-42
Сорт Ирень - мягкая пшеница - имеет массу 1000 зерен 26,9-34,3 г. В среднем за урожайность в северных районах Башкортостана составила 17,6-21,1 ц/га. Раннеспелый. Созревает за 66-80 дней. Устойчивость сорта к полеганию и осыпанию высокая. Имеет хорошие хлебопекарные качества.
Сорт Башкирская 26 . Сорт среднеранний, вегетационный период 74-95 дней. Устойчив к полеганию, засухоустойчив. Масса 1000 зерен 29-39 г. Средняя урожайность в регионе составила 34,0 ц/га, превышение над стандартом 2-2,2 ц/га. Максимальный урожай 48,4 ц/га получен в 2001 г. в Зауральской степи Республики Башкортостан.
Полевые исследования проводили на двух госсортоучастках (ГСУ), расположенных в Буздякском и Хайбулинском районах Республики Башкортостан. Первый из них находится в предуральской степи. Это в целом благоприятная по влагообеспеченности зона для возделывания яровой пшеницы. Второй ГСУ находится в зауральских степях, подверженных воздействию частых засух и суховеев. Кроме того, эксперименты проводили на опытных полях БашНИИСХ РАСХН, расположенных в Чишминском районе, близком по климатическим условиям к Буздякскому району. В полевых опытах измерялась устьичная проводимость (см. раздел 2.2.3), а также температура и относительная влажность воздуха
В лабораторных условиях семена проращивали в темноте в течение трех суток на дистиллированной воде с добавлением 5х10"5 М СаСЬ, при 24 С. Трехсуточные проростки пересаживали на 10%-ную среду Хогланда-Арнона и выращивали при освещенности 18 клк и 14-часовой продолжительности светового дня. Температура воздуха в течение светового периода была в переделах 20-24С. Объектом исследования в лабораторных условиях служили 7-8-дневные проростки в фазе выхода первого листа. В этом возрасте побег растений представляет собой растущий первый лист, основание которого находится в рудименте колеоптиля. Поэтому при описании результатов термин побег и лист означает одно и то же для растений данного возраста и применяется далее как взаимозаменяемые.
Температуру воздуха повышали на 4+ 1С за несколько минут потоком горячего воздуха от тепловентилятора "Ветерок-2" и поддерживали на постоянном уровне в течение 1,5 ч. В ряде экспериментов за 15 мин до повышения температуры для уменьшения водной проницаемости мембран в питательный раствор добавляли HgCb до конечной концентрации 50 мкМ и через 5 мин заменяли раствор на исходный или на раствор, содержащий 5 мМ ди-тиотрейтола (ДТТ). В опытах по изучению влияния АБК на транспорт воды через корни в питательную среду добавляли экзогенный гормон до конечной концентрации 2 10" М. Во всех опытах образцы на анализ брали непосредственно перед воздействием и через 5, 15, 30, 60 минут после начала воздействия, что соответствует определенной ростовой реакции растений на повышение температуры воздуха - отрицательный рост, отсутствие роста, возобновление роста и восстановление роста соответственно.
Рост и водный обмен растений
Условия, в которых растения существуют в природе, постоянно меняются, что сказывается на относительной влажности воздуха и, как следствие, на испарении воды растением, т.е. транспирации. Для нас было важно изучить реакцию растений на быстрые изменения относительной влажности воздуха. Один из наиболее простых способов смоделировать это в эксперименте состоит в повышении температуры воздуха.
Для того, чтобы оценить роль устьичной и гидравлической проводимости в регуляции водного обмена, необходимо было проследить быстрые изменения оводненности тканей растений при внешних воздействиях. Как отмечалось в обзоре литературы, быстрые изменения скорости роста листьев растений могут быть хорошим показателем оводненности побега. Поскольку быстрый рост растений возможен благодаря растяжению клеток в результате поглощения ими воды, использование датчика роста позволяет быстро зарегистрировать изменения в доступности воды для роста.
На начальном этапе нашей работы эксперименты проводили с растениями сорта твердой пшеницы Безенчукская 139. Мы использовали высокочувствительный датчик роста, который позволял регистрировать изменение положения кончика листа на 5-Ю микрометров. Как видно из рис. 1, повышение температуры воздуха на 3-4 градуса в течение нескольких минут приводило к прекращению роста листьев пшеницы.
Сравнение рис. 1 а и б позволяет заметить, что ростовая реакция совпадала с возрастанием скорости транспирации. В литературе широко обсуждается конкуренция между потоками воды, поддерживающими рост и транс-пирацию (Wetsgate, Boyer, 1984). Увеличение скорости испарения воды - закономерное следствие нагрева воздуха, которое приводит к уменьшению относительной влажности воздуха и соответственно - его водного потенциала
(Jones, 1983). В результате увеличивается градиент водного потенциала между листом и воздушной средой и возрастает скорость испарения воды через устьичные щели.
Подъем уровня потери воды растением за счет транспирации может нарушить ее сбалансированность со скоростью притока воды из корней и к снижению водного потенциала листьев. О том, что это было действительно так, в наших экспериментах свидетельствуют результаты измерения относительного содержания воды (ОСВ).
Как видно из рис. 2, повышение температуры воздуха приводило к снижению ОСВ. ОСВ характеризует способность дифференцированных, не растущих листьев поглотить воду из дистиллированной воды в атмосфере, насыщенной водой. Эта способность зависит от степени насыщения клеток листа водой в исходном состоянии, т.е. от их водного потенциала. Таким образом, относительное содержание воды является показателем, тесно связанным с водным потенциалом (Jones, 1983). Он также позволяет судить о дефиците воды в листе, который равен (100 - ОСВ) %. Снижение ОСВ у растений при повышении температуры воздуха свидетельствует о дисбалансе между поступлением воды из корней и транспирацией.
