Введение к работе
Актуальность темы. Исследование цитогенетических характеристик древесных растений и закономерностей их изменений под действием различных экзогенных и эндогенных факторов представляет собой важную проблему, стоящую перед специалистами в области генетики, цитологии, экологии и смежных наук. Это обусловлено, с одной стороны, масштабным воздействием различного рода поллютантов на экосистемы, с другой - широким использованием древесных растений для озеленения городов, создания промышленно-парковых зон (леса являются своеобразными фильтрами, задерживающими пыль и вредные соединения; после аварии на Чернобыльской АЭС они стали ловушкой для радионуклидов), для рекультивации земель. В связи с этим возникает задача создания насаждений, устойчивых к стрессовым влияниям, обусловленным действием загрязнителей различной природы. Ее решение заключается в выявлении молекулярно-клеточных механизмов обеспечения резистентности растений к неблагоприятным факторам и отборе соответствующих генотипов.
Достаточно широк перечень исследований древесных растений по морфологическим, биохимическим и др. признакам (Дружкина, 2007; Матвеев, 2004; Онучин, 1993; Осколков, 1998а, б; Романовский, 1992; Федорова, 1997; Эрна, 1986 и др.), однако, особое внимание следует уделить цитогенетическим признакам, которые позволяют проследить изменения генетической системы, обусловленные загрязнением или другим стрессовым воздействием, на ранних стадиях их возникновения - еще до момента фенотипического проявления, или же выявить генетические особенности изучаемого материнского дерева, например, его мутантную природу.
В настоящее время как в России, так и за рубежом, активно проводятся исследования цитогенетических реакций древесных растений на воздействие различного рода модификаторов, но в большинстве случаев эти работы выполняются на видах хвойных (Изменчивость цитологических показателей …, 2005; Владимирова, 2005; Дорошев, 2004; Калашник, 2008; 2009; Квитко, 2009; Мазурова, 2009; Машкина, 2008; Муратова, 1991; 2004; Седельникова, 2008; Черкашина, 2007; Шафикова, 1999 и многие другие). В них отмечается, что механизмами адаптации к стрессовым условиям (краевой ареал, избыточная увлажненность почвы, аэротехногенное загрязнение) являются увеличение числа хромосом с вторичными перетяжками, появление кольцевых и добавочных В-хромосом, возможна также замена митоза на амитоз. Показано, что в условиях антропогенного загрязнения может происходить изменение ядрышковых характеристик, как правило, увеличение или уменьшение числа ядрышек в клетке, ядерно-ядрышковых отношений, возрастает уровень нарушений митоза, расширяется их спектр, возможно появление микроядер, изменение числа делящихся клеток. Для лиственных древесных растений подобного рода работ выполнено значительно меньше (Вострикова, 2006; 2007; Карпова, 2002; Миронов, 2002; Сенькевич, 2007 и др.). Так, установлено, что в условиях загрязнения возрастает уровень патологий митоза и расширяется их спектр, возможно появление остаточных ядрышек на стадии метафазы – телофазы митоза, которому приписывается адаптивное значение.
Для оценки воздействия стресс-факторов на цитогенетический аппарат древесных растений необходимо выявить в контролируемых лабораторных условиях чувствительность к этим факторам различных цитогенетических показателей. В природных условиях провести подобный эксперимент не представляется возможным, т.к. трудно подобрать территории со строго определенной концентрацией и составом загрязнителей.
Работы по изучению суточной ритмики цитогенетических показателей (патологических митозов, ядрышковых характеристик) у лиственных древесных растений практически не известны. Ранее на ряде видов травянистых было показано, что митотическая активность в пролиферирующих тканях подвержена изменениям в течение 24 часов (Гриф, 1994). Исследований суточной динамики патологических митозов и ядрышковых характеристик вообще не проводилось, хотя эти параметры также подвержены подобного рода изменениям. Хотелось бы особо отметить, что в научных периодических изданиях описания цитогенетических показателей древесных растений приводятся без указания сроков фиксации материала, соответственно, не учитывается факт колебаний величин изучаемых параметров в течение дня, что не позволяет провести корректного сравнения результатов, полученных разными авторами, между собой и зачастую приводит к ошибочным заключениям о характере наблюдаемых явлений.
Важным прикладным аспектом применения цитогенетических показателей древесных растений является осуществление цитогенетического мониторинга состояния окружающей среды с их использованием, т.к. древесные растения в качестве тест-объектов обладают рядом преимуществ: 1) являются многолетниками, что позволяет проводить лонгитюдные исследования; 2) широко представлены в защитных лесонасаждениях около промышленных предприятий; 3) в 10 – 12 раз более радиочувствительны, чем травянистые (радиочувствительность (LD50) сосны обыкновенной приближается к таковой человека), что позволяет допустить возможность экстраполяции результатов, полученных на древесных растениях, на человека (Радиоактивное загрязнение районов …, 1990). Знание реакций ядерного аппарата древесных растений на антропогенное загрязнение позволит разработать теоретические основы такого мониторинга.
Основная ценность цитогенетического мониторинга загрязнения окружающей среды состоит в получении сведений о том, будет ли среда генотоксична для человека. Выявление корреляционных связей между цитогенетическими показателями семенного потомства лиственных древесных растений, произрастающих около промышленных объектов, и уровнем аберрантных клеток буккального эпителия детей, проживающих в этих же районах, а в дальнейшем, возможно, установление математической зависимости между этими показателями, позволит, вероятно, ответить на этот вопрос. На возможность существования такой зависимости указывает обнаруженная нами ранее связь между частотой врожденных пороков развития у новорожденных и уровнем патологических митозов у семенного потомства сосны обыкновенной на изучаемой территории (Relationship between cytogenetic ..., 2000).
Принимая во внимание изложенное выше, становится очевидной необходимость исследования цитогенетических механизмов формирования устойчивости лиственных древесных растений на клеточном и субклеточном уровнях к антропогенному загрязнению и другим стрессовым воздействиям.
Целью диссертационной работы явилось выявление цитогенетических реакций лиственных древесных растений на примере дуба черешчатого (Quercus robur L.) и березы повислой (Betula pendula Roth) на антропогенное загрязнение и установление путей их адаптации к стрессовому воздействию на клеточном и субклеточном уровнях, а также перспектив использования древесных растений для оценки генотоксичности окружающей среды для человека.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
1) провести комплексное изучение основных цитогенетических показателей семенного потомства лиственных древесных растений, их роли в процессах морфогенеза в условиях антропогенного загрязнения и в норме (нестрессовых условиях);
2) выявить пути адаптации лиственных древесных растений к загрязнению окружающей среды, вызванному деятельностью человека, факторами физической и химической природы;
3) разработать шкалу чувствительности критериев цитогенетического мониторинга к стрессовым воздействиям различной интенсивности;
4) исследовать в течение суток динамику цитогенетических показателей проростков семян березы повислой и дуба черешчатого, собранных на территориях с разным уровнем антропогенного загрязнения, и установить закономерности их изменений в норме и в стрессовых условиях;
5) выявить отдаленные цитогенетические эффекты радиоактивного облучения в результате аварии на Чернобыльской АЭС у семенного потомства дуба черешчатого;
6) оценить степень генотоксичности среды для человека по данным цитогенетического мониторинга с использованием видов древесных растений.
Научная новизна выполненной работы.
Впервые установлена разная резистентность цитогенетических показателей растений к стрессовым факторам (на примере Zebrina pendula). Среди изученных параметров можно выделить чувствительные (изменения которых выявляются при самых незначительных отклонениях условий среды от оптимальных), например, ядрышковые характеристики и время прохождения клетками стадий митоза, и устойчивые (эти показатели изменяются только при сублетальных стрессовых воздействиях), например, появление клеток с микроядрами, депрессия митотической активности.
Проведено систематическое исследование цитогенетических характеристик проростков семян Q. robur L. и B. pendula Roth, собранных на экологически «чистой» территории, в зонах антропогенного загрязнения (химического, радиационного, комбинированного), в разных лесорастительных условиях. Установлены пределы изменчивости цитогенетических показателей семенного потомства березы повислой и дуба черешчатого в норме (на экологически «безопасной» территории). Выявлены суточные ритмы изменения цитогенетических показателей проростков семян дуба черешчатого в норме и березы повислой на экологически «чистой» и антропогенно загрязненной территориях. Показан сдвиг (сбой) циркадных ритмов цитогенетических характеристик при стрессовом воздействии, обусловленный адаптацией к неблагоприятным факторам.
Дано формальное описание суточных ритмов цитогенетических показателей березы повислой и дуба черешчатого с использованием полиномиальных функций.
Предложена схема цитогенетических реакций двух видов лиственных древесных растений на стрессовые воздействия различной природы. Установлены пути адаптации Q. robur L. и B. pendula Roth на клеточном и субклеточном уровнях к условиям обитания.
Выявлены отдаленные цитогенетические эффекты у семенного потомства деревьев дуба черешчатого, подвергшихся радиоактивному облучению в результате аварии на Чернобыльской АЭС. Установлено, что мутационный процесс характеризуется волновой кинетикой. Показано модулирующее действие антропогенного загрязнения на проявление указанных эффектов.
Продемонстрирована возможность интегральной оценки загрязнения среды по совокупности цитогенетических показателей лиственных древесных растений с использованием методов кластерного анализа.
Установлены сходные тенденции в изменениях частоты встречаемости клеток с микроядрами в слизистой эпителия ротовой полости детей и морфологических характеристик ядрышек в клетках семенного потомства березы повислой. Методом регрессионного анализа была подобрана формула, описывающая зависимость между показателями ядрышковой активности (площадь поверхности одиночных ядрышек) семенного потомства березы повислой и частотой цитогенетических нарушений у человека (встречаемость клеток с микроядрами в эпителиоцитах ротовой полости детей). Опытная проверка предложенной математической формулы выявила хорошее совпадение прогнозируемых и экспериментальных данных.
Научно-практическое значение результатов исследований.
Научные положения диссертационной работы углубляют теоретические представления, касающиеся установления цитогенетических реакций лиственных древесных растений на стрессовые воздействия разной этиологии и выявления механизмов адаптации к неблагоприятным факторам среды на клеточном и субклеточном уровнях.
Полученные результаты по влиянию антропогенного загрязнения (химического, радиоактивного, комбинированного), лесорастительных условий на цитогенетические показатели проростков семян дуба черешчатого и березы повислой необходимо учитывать при проведении лесовосстановительных работ с использованием семенного материала, собранного на загрязненных территориях.
Представленные данные можно рассматривать как результаты мониторинга загрязнения окружающей среды в населенных пунктах Воронежской и Белгородской областей с использованием цитогенетических показателей древесных растений и микроядерного теста в буккальном эпителии человека. Предложенный метод кластерного анализа совокупности цитогенетических показателей древесных растений и человека позволяет произвести интегральную оценку состояния среды. Его использование дало возможность выявить наиболее загрязненные и чистые территории в местах проведения исследования.
Уравнение, связывающее изменения ядрышковых характеристик березы повислой и уровень клеток с микроядрами в буккальном эпителии человека на загрязненных территориях, позволяет проводить прогноз генотоксичности среды для человека по цитогенетическим показателям семенного потомства древесного растения.
В ходе проведения работы по математическому описанию суточных ритмов цитогенетических характеристик Q. robur L. и B. pendula Roth разработан способ, позволяющий на основе одного экспериментально полученного значения цитогенетического показателя провести расчет его величины в любой момент времени в течение суток. Получено два патента на изобретение способов изучения суточных ритмов цитогенетических показателей древесных растений. На их основе созданы 4 программы для ЭВМ: «Прогнозирование суточных ритмов цитогенетических показателей семенного потомства дуба черешчатого», «Прогнозирование суточных ритмов цитогенетических показателей семенного потомства березы повислой (Betula pendula Roth)», «Прогнозирование суточных ритмов цитогенетических показателей семенного потомства сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.)», «Прогнозирование суточных ритмов ядрышковых показателей семенного потомства сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.)».
На основании проведенных исследований создан интернет-ресурс (), посвященный цитогенетическим исследованиям древесных растений.
Материалы работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского госуниверситета при подготовке выпускных квалификационных работ и кандидатских диссертаций. Они вошли в курсы лекций «Экологическая генетика», «Радиационная генетика», «Анатомия, генетика, радиобиология», «Человек», в программы лабораторных занятий Большого практикума для студентов кафедры генетики, цитологии и биоинженерии.
Материалы диссертационной работы по биотестированию представлены в виде информации для внедрения (Информационный листок № 150-98 «Цитогенетический мониторинг загрязнения территорий», Воронежский ЦНТИ, 1998 г.).
На защиту выносятся следующие положения.
1. Разработанная шкала чувствительности цитогенетических показателей к экзогенным и эндогенным факторам позволит выбирать адекватные силе их воздействия цитогенетические критерии при проведении цитогенетического мониторинга и оценке генотоксичности среды/химических соединений.
2. Цитогенетические показатели дуба черешчатого и березы повислой подвержены суточным колебаниям, ритмы которых могут изменяться в стрессовых условиях.
3. Суточная динамика изменений цитогенетических показателей древесных растений описывается и прогнозируется с помощью полиномиальных функций.
4. На территориях, подвергшихся радиоактивному загрязнению в результате аварии на Чернобыльской АЭС, после нормализации радиационного фона у семенного потомства лиственных древесных растений выявлена волновая кинетика мутационного процесса.
5. Крайние минимальные и максимальные величины исследованных цитогенетических характеристик березы повислой и дуба черешчатого могут служить показателями пределов изменчивости изучаемых параметров в нестрессовых условиях и учитываться при проведении цитогенетического мониторинга состояния окружающей среды с использованием указанных видов.
6. Антропогенное загрязнение (радиоактивное, химическое, комбинированное) и определенные лесорастительные условия вызывают разнонаправленные изменения процессов протекания митоза и ядрышковых характеристик в клетках апикальной меристемы проростков семян лиственных древесных растений, которые являются отражением реакций адаптации на клеточном и субклеточном уровнях к стрессовому воздействию.
7. Использование методов кластерного анализа совокупности цитогенетических показателей семенного потомства лиственных древесных растений позволяет дать интегральную оценку состояния среды.
8. Обоснование прогноза генотоксичности окружающей среды по цитогенетическим показателям древесных растений значимо для оценки генетического гомеостаза организма человека
Личный вклад.
Диссертационная работа является результатом многолетних (1994 – 2009 гг.) комплексных исследований, выполненных лично автором или под его руководством совместно с сотрудниками, магистрами и студентами-дипломниками кафедры генетики, цитологии и биоинженерии Воронежского госуниверситета. Автором разработаны теоретические и методические положения, обоснованы цели и задачи исследования, проведён сбор и анализ экспериментального материала, обобщены результаты исследований. Статьи и научные доклады подготовлены самостоятельно и в соавторстве.
Апробация результатов исследования.
Результаты диссертационной работы были представлены на 11 World Forestry Congress (Antalya, Turkey, 1997); conference of IUFRO Working Party 2.08.05 held Oct. 12-17, 1997, College of Agricultural Sciences, The Pennsylvania State University, University Park, Pennsylvania, U.S.A. «Diversity and Adaptation in Oak Species»; Symposium of IUFRO Cytogenetics Working Party. S2.04 – 08 «Cytogenetic Studies of Forest Trees and Shrubs – Review, Present Status, and Outlook on the Future» (Graz, 1998); Международном совещании «Методы оценки состояния и устойчивости лесных экосистем» (Красноярск, 1999); Международном симпозиуме «Радикальное повышение экологических функций леса в 21 веке» (Воронеж, 1999); Международной научно-практической конференции «Интеграция фундаментальной науки и высшего лесотехнического образования по проблемам ускоренного воспроизводства, использования и модификации древесины» (Воронеж, 2000); International conference «Modern problems of radiobiology, radioecology and evolution dedicated to centenary of N.W. Timofeeff-Ressovsky» (Dubna, Russian, 2000); 2 съезде ВОГиС (Санкт-Петербург, 2000); Международной конференции «Биологические эффекты малых доз ионизирующей радиации и радиоактивное загрязнение среды (Биорад-2001)» (Сыктывкар, 2001); Международной научно-практической конференции «Интеграция науки и высшего лесотехнического образования по управлению качеством леса и лесной продукции» (Воронеж, 2001); 7 международной научно-практической экологической конференции «Приспособления организмов к действию экстремальных факторов» (Белгород, 2002); Международной научной конференции, посвященной 25-летию кафедры ботаники Сыктывкарского университета, «Экологическая ботаника: наука, образование, прикладные аспекты» (Сыктывкар, 2002); International Conference DYGEN «Dynamics and conservation of genetic diversity in forest ecosystems» (Strasbourg, 2002, France); 4 и 5 мiжнародноi науковоi конференцii (м. Донецьк, 2003; 2007 р.р.); 8 международной научной экологической конференции «Актуальные проблемы сохранения устойчивости живых систем» (Белгород, 2004); 3 съезде ВОГиС «Генетика в 21 веке: современное состояние и перспективы развития» (Москва, 2004); Second international conference Dedicated to the 105th anniversary of the birth of N.W. Timofeeff-Ressovsky and the 70th anniversary of the paper “On the nature of gene mutations and gene structure” by N.W. Timofeeff-Ressovsky, K.G. Zimmer, and M. Delbruck «Modern problems of genetics, radiobiology and evolution» (Yerevan, Armenia, 2005); 5 международном Совещании и школе молодых ученых по кариологии, кариосистематике и молекулярной систематике растений «Кариология, кариосистематика и молекулярная филогения растений» (Санкт-Петербург, 2005); 2 международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ботаники и методики преподавания биологии» (Белгород, 2007); итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007 – 2012 годы» (Москва, 2007); 8 и 9 международных научно-методических конференциях «Информатика: проблемы, методология, технологии» (Воронеж, 2008; 2009); 15 международной научной конференции «Математика, компьютер, образование» (Дубна, 2008); 10 международной научно-практической экологической конференции «Живые объекты в условиях антропогенного пресса» (г. Белгород, 2008); Всероссийской конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы ботаники в начале 21 века» (Петрозаводск, 2008); Международной научной конференции «Генетика и биотехнология 21 века. Фундаментальные и прикладные аспекты» (Минск, 2008); Международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения К.В. Горбунова «Фундаментальные аспекты биологии в решении актуальных экологических проблем» (Астрахань, 2008); 5 съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009); на отчетных научных сессиях биолого-почвенного факультета Воронежского государственного университета (Воронеж, 1999 - 2009 гг.).
Исследования, выполненные при подготовке диссертационной работы, поддержаны грантами Президента РФ для молодых ученых - кандидатов наук и их научных руководителей (грант № МК-2587.2004.4 и № МК-3481.2007.4); НИОКР Министерства природных ресурсов РФ «Биогеосферные исследования состояния и динамики природной среды в условиях интенсивного воздействия антропогенных факторов на территории Центрально-Черноземного региона», (государственный контракт № ВК-02-47/301); государственным контрактом Минобрнауки России от 25 июня 2007 г. № 02.512.11.2130 «Цитогенетические реакции древесных растений (на примере лиственных и хвойных) на стрессовые условия, обусловленные антропогенным загрязнением, и оценка генотоксичности окружающей среды для человека по цитогенетическим показателям древесных растений»; грантом РФФИ № 09-04-97503-р-центр-а. Исследование «Оценка генотоксичности окружающей среды в районах г. Воронежа и Воронежской области по цитогенетическим реакциям человека и древесных растений», являющаяся частью представленной диссертации, удостоена премии администрации Воронежской области для молодых ученых за лучшую научную работу в 2001 г.
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 90 научных работ, в том числе 16 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации материалов докторских диссертаций по биологическим наукам, 2 патента, 2 свидетельства на регистрацию программ для ЭВМ.
Структура и объем работы.
