Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1.1. Мониторинг загрязнения окружающей среды 9
1.2. Биотестирование как метод оценки токсичности веществ и загрязнения морской среды 11
1.2.1. Обоснование целей и задач биотестирования 16
1.2.2. Краткое описание некоторых основных характеристик биотестов 19
1.2.3. Использование предличинок рыб в токсикологических экспериментах 24
1.2.4. Летальные концентрации веществ как типичные токсикологические параметры 28
1.2.5. Особенности применения биотестов в морской среде 29
1.3. Кадмий, цинк, свинец: содержание в воде и токсичность 31
1.4. Математические методы обработки информации при биотестировании 40
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 42
2.1. Тест-объекты 42
2.2. Условия сбора и лабораторного содержания предличинок рыб .46
2.3. Методы приготовления рабочих растворов токсикантов 47
2.4. Методы проведения острых токсикологических экспериментов 48
2.5. Методы статистической обработки результатов 51
Глава 3. ДЕЙСТВИЕ КАДМИЯ, ЦИНКА НА ВЫЖИВАЕМОСТЬ ПРЕДЛИЧИНОК РЫБ 53
3.1. Действие кадмия на выживаемость предличинок рыб 53
3.2. Действие цинка на выживаемость предличинок рыб 65
3.3. Действие свинца на выживаемость предличинок рыб 77
Глава 4. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ТОКСИКОРЕЗИСТЕНТНОСТЬ ГРЇДРОБИОНТОВ К ДЕЙСТВИЮ МЕТАЛЛОВ 89
4.1. Сравнительная токсикорезистентность гидробионтов к воздействию кадмия 90
4.2. Сравнительная токсикорезистентность гидробионтов к воздействию цинка 93
4. 3. Сравнительная токсикорезистентность гидробионтов к воздействию свинца 97
Глава 4. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ТОКСИЧНОСТИ Cd, Zn, Pb И СОДЕРЖАНИЯ ЭТИХ МЕТАЛЛОВ В ПРИБРЕЖНЫХ ВОДАХ
ПРИМОРЬЯ 100
ВЫВОДЫ 107
ЛИТЕРАТУРА 109
- Обоснование целей и задач биотестирования
- Методы статистической обработки результатов
- Действие свинца на выживаемость предличинок рыб
Введение к работе
Общепризнанно, что одним из основных негативных результатов хозяйственной деятельности человечества является загрязнение окружающей среды. В условиях интенсивного промышленного производства и сельского хозяйства, сопряженных с увеличением источников загрязнения и объемами сбрасываемых сточных вод, со всей серьезностью стоит задача изучения и оценки токсического влияния поллютантов на биоту (Помазовская, Дубровина, Флинк, 1990). Резкие колебания естественных экологических факторов, стремительное распространение нового мощного экологического фактора - антропогенного загрязнения - вызывают чрезвычайные напряжения приспособительных механизмов всех уровней организации живого, что все чаще приводит к необратимым повреждениям и гибели биосистем (Путинцев, 1990). Существенная роль при оценке качества морской среды и состояния ее обитателей принадлежит биотестированию (Патин, 1979, 2001; Cairns, 1981; Филенко, 1989; Лукьяненко, Карпович, 1989; Крайнюкова, 1990; Методологическое руководство..., 1991; Тюрин, Христофорова, 1995; Лукьяненко, 1998). Зарубежный опыт использования методов токсикологического анализа в системе оценки качества воды, значительные достижения отечественных ученых в области разработки биотестов свидетельствуют о целесообразности и возможности применения биотестирования в нашей стране (Васьковец, Крайнюкова, 1990; Патин, 2001).
Устойчивость живых организмов к воздействию неблагоприятных факторов в значительной степени зависит от особенностей биологии вида, в том числе их размеров, этапов и стадий развития (Никольский, 1974; Кушинг, 1979; Патин, 1979; Жирмунский, Кузьмин, 1990). Обычно наиболее
уязвимы к загрязнению и другим изменениям условий окружающей среды
мелкие гидробионты. К ним относится планктон, в том числе икра и
личинки промысловых объектов. Минимальные размеры, а, следовательно,
и наибольшая удельная поверхность контакта с окружающей средой,
являются одной из причин их пониженной устойчивости к неблагоприятным
воздействиям. Низкая резистентность на ранних стадиях онтогенеза, кроме
того, связана со спецификой интенсивности протекания
морфофизиологических и биохимических процессов в быстро
развивающемся организме. Очевидно, что водная среда в первую очередь
оказывает определяющее влияние на жизнедеятельность
эмбрионов и личинок, не обладающих еще развитыми защитными системами (Патин, 1979).
В то же время численность поколения определяется в основном именно условиями выживания икры и личинок рыб на ранних стадиях развития (Дехник, Расе, 1987), поскольку именно на ранних стадиях развития действуют факторы, имеющие первостепенное влияние на формирование численности поколений популяций (Wang, Houde, 1995). Максимальная смертность, по мнению Д.Х. Кушинга (1979) происходит в период дрейфа личинок. В некоторых случаях численность поколения определенных видов рыб может зависеть от абиотических условий, например от выноса личинок в районы, где температура, соленость и другие физико-химические параметры, в том числе загрязнение, неблагоприятны для выживания. Развитие икры и личинок, несомненно, обуславливается целым рядом абиотических и биотических факторов, и тем не менее многочисленные данные полученные в последнее время по целому ряду объектов, свидетельствуют о том, что среди их множества лишь немногие являются лимитирующими в конкретной ситуации (Степаненко, 1983).
Существенную опасность для биоты представляют такие широко распространенные и весьма токсичные загрязнители как тяжелые металлы (Ковековдова, 1993; Tkalin, Belan, Shapovalov, 1993, Христофорова, Шулькин, Кавун, 1994; Челомин, Бельчева, Захарцев, 1998; Long, Field, MacDonald, 1998; Ващенко, 2000; Шулькин, 2000; Лукьянова 2001). Специалистам хорошо известна повышенная уязвимость к их воздействию эмбрионов и личинок рыб (Патин, 1979; Методы исследований..., 1985). Поэтому проблема выявления и изучения приспособляемости и устойчивости гидробионтов к действию возрастающих концентраций тяжелых металлов во внешней среде, в условиях прогрессирующего антропогенного воздействия на гидросферу приобретает сугубо практическое значение.
Данная работа посвящена предличинкам рыб, обитающих в морских водах дальневосточного региона, расположенного в зоне Тихоокеанского рудного пояса, металлогеническая специализация которого (Sn, Pb, Zn и сопутствующие им As, Ag, Sb, Cd), в силу природных особенностей, проявляется в водотоках и прибрежных морских водах (Христофорова, Шулькин, Кавун и др., 1994). Кадмий, цинк и свинец являются одними из приоритетных микроэлементов терригенных стоков, оказывающих дополнительную нагрузку на прибрежные экосистемы вместе с высоким антропогенным воздействием. Таким образом, при выборе металлов для изучения мы исходили из металлогенической специализации района и характера природных и техногенных стоков.
Цель и задачи работы.
Целью настоящего исследования явилась оценка токсического воздействия кадмия, цинка и свинца на предличинок массовых, широко распространенных в дальневосточных морях России промысловых видов рыб - длиннорылой камбалы (Limanda punctatissima punctatissima) и японского анчоуса (Engraulis japonicus).
Для достижения намеченной цели необходимо было решить следующие задачи:
Разработать способ оценки токсичности тяжелых металлов с помощью предличинок морских видов рыб.
Сравнить устойчивость предличинок длиннорылой камбалы и японского анчоуса, используя одинаковые критерии токсичности, и выявить наиболее уязвимый вид для каждого металла.
Определить расчетные значения максимальных недействующих концентраций кадмия, цинка и свинца, не вызывающих гибель предличинок длиннорылой камбалы и японского анчоуса
Оценить возможность использования выбранных тест-объектов при установле нии предельно допустимых концентраций (ПДК) и ориентировочно безопасных уровней воздействия (ОБУВ) загрязняющих веществ для морских вод.
Сравнить полученные максимальные недействующие концентрации металлов с уровнями их содержания в прибрежных водах Приморья (Японское море).
Научная новизна:
Разработан и апробирован способ оценки токсичности тяжелых металлов, позволяющий получать достоверные результаты о воздействии экстремальных факторов среды на выживаемость рыб в период раннего постэмбрионального развития.
Установлены максимальные недействующие концентрации кадмия, цинка и свинца для предличинок данных видов рыб. Определен менее устойчивый объект для каждого металла.
Исследована и обоснована возможность применения новых тест-объектов: предличинок длиннорылой камбалы и японского анчоуса при разработке региональных ПДК и ОБУВ загрязняющих веществ.
По теме работы получены два патента РФ (№ 2215290, № 2220415).
Практическое значение работы: Полученные результаты могут быть использованы при определении и решении конкретных практических задач:
Предложен новый способ оценки токсичности загрязнителей вод, с использованием предличинок морских рыб - длиннорылой камбалы и японского анчоуса, позволяющий достоверно определять и сравнивать токсичность тяжелых металлов.
Благодаря новым низкоустойчивым тест-объектам проведено сравнение токсичности различных загрязняющих веществ в водах дальневосточных морей в 96-часовых экспериментах при использовании 150-ти предличинок.
Предлагаемые новые тест-объекты могут быть успешно использованы при установлении региональных ПДК и ОБУВ загрязняющих веществ для морских вод, а так же при оценке пригодности отдельных морских районов для развития личинок данных видов рыб.
Защищаемые положения:
Максимальные недействующие на предличинок длиннорылой камбалы и японского анчоуса концентрации кадмия, цинка, свинца ниже ПДК этих металлов для рыбохозяйственных водоемов РФ в 25, 10 и 25 раз соответственно. Предличинки длиннорылой камбалы и японского анчоуса являются низкоустойчивыми тест-объектами и перспективными при разработке региональных ПДК и ОБУВ загрязняющих веществ для морских вод.
Значения максимальных недействующих концентраций кадмия, цинка, свинца для предличинок длиннорылой камбалы и японского анчоуса выше уровня их содержания в морских водах Приморья, за исключением наиболее загрязненных акваторий (б. Рудная, б. Находка (зал. Находка), внутренние районы зал. Посьета, и некоторые другие акватории залива Петра Великого), следовательно в большинстве случаев изученные
тяжелые металлы не способны оказывать отрицательного влияния на
выживаемость предличинок данных видов рыб.
Автор искренне благодарен д.б.н., профессору Н.К. Христофоровой, д.б.н., вед.н.с. О.Н. Лукьяновой и к.б.н., ст.н.с. Л.Т. Ковековдовой за критический анализ работы, ценные советы и консультации, к.б.н., н.с. М.В. Симоконь за определение концентраций тяжелых металлов в испытуемых растворах. Автор признателен научным руководителям д.б.н., директору ХоТИНРО В.А. Беляеву и к.б.н., ст.н.с. С.А. Черкашину, заведующему, к.б.н. В.В. Щеглову и сотрудникам лаборатории прикладной экологии и токсикологии "ТИНРО-Центр" за поддержку и научное сотрудничество.
Обоснование целей и задач биотестирования
Одно из наиболее авторитетных определений биотестирования было дано в докладе Временной научно-технической комиссии «О современном состоянии и перспективах развития научно-исследовательских работ по биотестированию природных и сточных вод»: «Под биотестом понимается оценка (испытание) в строго определенных условиях действия вещества или комплекса веществ на водные организмы путем регистрации изменений того или иного биологического (или физиолого-биохимического) показателя исследуемого объекта по сравнению с контролем» (цит. по Б.А. Флерову, 1983). Однако широта данного определения позволяет подвести под задачи биотестирования почти все вопросы экспериментальной водной токсикологии, включающие все уровни организации живого. Поэтому, по мнению К.СБурдина(1985), биотестирование должно включать в себя:
1. Изучение зависимости доза-эффект на живых организмах;
2. Изучение порога реакции на генетическом, клеточном, организменном и биоценотическом уровнях; зависимость продолжительности жизни от дозы вещества, влияние на плодовитость и потомство;
3. Изучение механизмов токсичности.
Взаимодействие среды и живых систем можно определять на различных уровнях биологической организации (Евгеньев, 1999). Например, встречаются предложения о еще большем расширении понятия биотестирования и включении в его задачи исследований надорганизменного уровня. В качестве тест-объектов в этом случае предполагается использовать искусственные лабораторные экосистемы, экспериментальные пруды и изолированные участки естественных экосистем (Веселов, 1957; Строганов, Филенко, Лебедева, и др., 1983; Виноградов, Маврин, Кореневаи др., 1991). На организменном уровне слежение за средой возможно по устойчивости или чувствительности к повреждающим воздействиям, по отдельным физиологическим функциям, по протеканию онтогенеза, по поведенческим реакциям и т.п. (Федоров, 1970; 1974; Израэль, 1984; Бурдин, 1985; Черкашин, 1986; Терновенко, 1989; Черкашин, 2001).
Подходы к анализу состояния среды различаются в той мере, в которой дифференцируются ауто- и синэкологические исследования, т.е. в зависимости от уровней организации биологических систем (Одум, 1975; Рикфлес, 1979). Для современного состояния водной токсикологии характерно доминирование аутоэкологического подхода, при котором основное внимание уделяется токсическим эффектам на уровне организма, характеристикам выживаемости особей (особенно промысловым гидробионтам и их кормовым объектам) и физиолого-биохимическим изменениям в них в зависимости от дозы и длительности остротоксического воздействия в эксперименте (Лукьяненко, 1998; Черкашин, 2001).
Однако основными задачами биотестирования большинство исследователей считают оценку качества природных и сточных вод (Лесников, 1983а; Флеров, 1983; Соколова, Айвазова, 1983; Строганов, Филенко, Лебедева и др., 1983; Побегайло, Новосадова, 1983; Колупаев, 1983; Бейм, 1986; Лукьяненко, Карпович, 1989; Евгеньев, 1999). Еще одной задачей биотестирования является оценка качества потребляемой воды. В Голландии все водозаборы снабжены устройствами для контроля воды, которые для оценки ее качества используют реакции живых организмов (Смит, 1979). Необходимость использования биотестов для контроля воды для водопользования населения отмечают отечественные специалисты (Красковский, Желдакова, 1983). Существуют и практические работы по оценке качества питьевой воды с помощью биотестирования (Христианова, Чекалова, Мирошниченко, 1983).
Наибольшие дискуссии вызывает вопрос: относится ли проблема определения ПДК загрязнения к задачам биотестирования? При этом одни авторы утверждают, что при помощи биотестирования решается один из основных вопросов водной токсикологии - установление рыбохозяйственных ПДК (Данильченко, 1983; Флеров, 1983; Патин, 1984). Другие авторы определяют основную: цель биотестирования как способа получения оперативного сигнала о степени токсичности вод, то есть получение сведений об «острой токсичности». Выявление слабой токсичности в этом случае никак не согласуется с основной задачей биотестирования и имеет отношение к биологической регламентации поступающих токсических веществ с помощью ПДК (Лукьяненко, 1983). Поэтому основным отличием признается длительность разработки ПДК и оперативность получения информации при биотестировании (Лесников, 1983а).
В другой работе Л.А. Лесникова (19836) отмечается, что биотестирование противоположно нормированию. При установлении ПДК мы задаем определенную концентрацию и наблюдаем за реакциями живых организмов. При биотестировании же по реакциям организма судят о концентрации веществ. Поэтому предлагается различать тест-организмы для нормирования и биотесты для биотестирования (Лесников, 19836). Обращает на себя внимание и различие в использовании информации, полученной при данных подходах. Так если нормирование представляет стандарты для расчета необходимой степени очистки и разведения стоков при проектировании предприятий и населенных пунктов, то биотестирование предназначено для текущего контроля качества вод (Филенко, 1983).
По мнению, некоторых других исследователей основной задачей любого токсикологического эксперимента является определение максимальной недействующей концентрации веществ, при которой не обнаруживается никаких отклонений в жизнедеятельности организмов (Тюрин, Христофорова, 1995).
Проведенный нами анализ отечественной и зарубежной литературы позволил выявить основные характеристики, относящиеся к нормированию и биотестированию, которые свидетельствуют об общности их методической основы. Основные из них: системность оценки, разрешающая способность, адекватность, экологическая значимость, оперативность, универсальность, технологичность и воспроизводимость. Данные характеристики довольно подробно описаны О.Ф. Филенко (1989) и С.А. Черкашиным (2001).
Методы статистической обработки результатов
При обработке данных острых токсикологических экспериментов нами был использован метод пробит-анализа (Прозоровский, 1962; Беленький, 1963; Лакин, 1973; Ordog, 1981), рекомендованный для
токсикологических исследований (Патин, 1979; Rice, Short, Karinen, 1977
и др.). С его помощью можно точно определить не только значение концентрации, вызывающей смертность 50% особей за определенный промежуток времени (ЛК5о), но и значения концентраций, вызывающих любой процент смертности от 0 до 100%. Однако, поскольку крайние значения распределения имеют так называемую «смещенную оценку», то значения расчетных летальных концентраций мы определяли по методу наименьших квадратов, предложенным В.Б. Прозоровским (1962). Сущность т этого метода сводится к нахождению такой прямой линии летальности, расстояние от которой у всех экспериментальных точек было бы наименьшим. При расчете учитывается также и вес точек, который тем больше, чем точка ближе к 50%. В своих расчетах за исходное количество погибших в ходе экспериментов организмов мы принимали среднее значение процента гибели животных из всех повторностей в каждой концентрации токсиканта. Поскольку в ходе эксперимента наблюдался постепенный прирост гибели испытуемых животных в контрольных группах, для нивелирования данного эффекта при расчете среднего процента гибели мы применяли поправку Аббота, которая выражается формулой: где к - процент гибели в концентрации, а К - процент гибели в контроле. В связи с тем, что пробитов, определяющих летальность 0 и 100% теоретически не существует (Прозоровский, 1962), нам пришлось находить «исправленные» значения пробитов. По Барлету (Bartlett, 1937) «исправленный» пробит для дозы, не приводящей к гибели ни одного из животных в опытной группе, равен:
где п — число животных в данной группе. Эти «исправленные» значения пробитов мы применяли в том случае, когда эффект гибели в концентрации с учетом поправки Аббота был равен 0 или 100%, а также при расчете ЛКо и ЛКюо Расчет ошибки ЛК5о мы проводили по одному из наиболее распространенных методов, предложенному Миллером и Тейнтером (цит. по Прозоровский, 1962). Вычислив, каким дозам соответствуют пробиты 6 (84%) и 4 (16%), находим разность между этими дозами, которая равна величине двух средних квадратичных ошибок:
Найденное значение 2ai подставляли в предложенную Миллером и Тейнтером формулу: где m - ошибка ЛК5о, а N - общее число животных в группах, летальность в которых была не меньше 6,7% (пробит (3,5) и не больше 93,3% (пробит 6,5). Проведенные при температуре 17,0 - 17,5 С эксперименты показали, « что за первые 12 ч экспозиции предличинок длиннорылой камбалы в различных концентрациях кадмия не происходит гибели ни одной предличинки ни в одной из взятых нами концентрациях. По истечении 24 ч даже в максимальной концентрации (0,1 мг/л) процент гибели предличинок достоверно не отличался от контроля, в котором при этом не погибло ни одной особи.
При дальнейшем увеличении времени экспозиции до 48 ч в контрольной группе была отмечена гибель одной предличинки (6,7 %). В концентрациях 0,001; 0,002 и 0,02 мг/л смертность была та же, что и в контроле на данный час эксперимента, и лишь максимальная концентрации кадмия (0,1 мг/л) вызывала достоверную по сравнению с контролем гибель организмов (табл. 2).
Изучение воздействия кадмия на выживаемость предличинок длиннорылой камбалы при времени экспозиции 48 ч показало, что значение медианной летальной концентрации (ЛК5о) кадмия оказалось равным 0,081 мг/л, а значение максимальной расчетной недействующей концентрации (ЛК0) составило 0,021 мг/л (табл. 3).
Расчетные данные, представленные в виде зависимости пробитов («единиц вероятности», соответствующих каждому проценту смертности предличинок исследованных видов рыб) от логарифма концентрации кадмия изображены на рисунке 4 а и 4 6. Кроме того, на этих и последующих рисунках указаны значения ЛК5о- . Логарифмы этих концентраций соответствуют абциссам точек пересечения каждой из прямых с линией пробита 5, при котором смертность подопытных тест-организмов равна 50%. Коэффициент корреляции, указанный на рисунке 4 а, очень высокий (0,996), а диапазон эффективных концентраций узок, - это говорит о том, что данный металл является весьма токсичным для предличинок исследованного вида рыб уже при 48 ч экспозиции.
Действие свинца на выживаемость предличинок рыб
Воздействие свинца на выживаемость предличинок длиннорылой камбалы изучалось при температуре растворов в диапазоне 19,0 - 20,5 С. В первые 12 ч экспозиции в различных концентрациях свинца не было отмечено гибели ни одной предличинки ни в одной из взятых нами концентраций. По истечении 24 ч даже в максимальной концентрации (0,1 мг/л) процент гибели предличинок достоверно не отличался от контроля, в котором не погибло при этом ни одного тест-объекта.
При дальнейшем увеличении времени экспозиции до 48 ч в контроле была отмечена гибель, которая составила 6,7 % (табл. 20). Достоверное отличие смертности предличинок длиннорылой камбалы от контроля наблюдалось в максимальной концентрации свинца (0,1 мг/л) смертность в которой к этому часу составила 33,3 %.
Изучение воздействия свинца на выживаемость предличинок длиннорылой камбалы при времени экспозиции 48 ч выявило, что значение медиальной летальной концентрации оказалось равным 0,660 мг/л, а значение максимальной недействующей концентрации составило 0,0004 мг/л (табл. 21).
Г( Уравнение, отражающее зависимость процента смертности предличинок длиннорылой камбалы, выраженного в пробитах, от логарифма концентрации свинца приведено на рис. 10 а. Не смотря на то, что все взятые нами концентрации привели к гибели тест-организмов, ни одна, даже максимальная, концентрация не вызвала эффект превышающий значение пробита равное пяти, что говорит о том, что токсический эффект данных концентраций на этот час экспозиции не превысил 50%-го порога.
Проведенные при температуре 19,0-20,5С эксперименты показали, что первые 12 ч экспозиции в различных концентрациях свинца предличинок японского анчоуса не привели к гибели ни одного объекта.
По истечении 24 ч смертность предличинок наблюдалась в максимальной взятой нами концентрации (0,1 мг/л), но достоверно не отличалась от контроля.79 С увеличением длительности экспозиции до 48 ч наблюдалась гибель (6,7 %) предличинок японского анчоуса в контрольной группе (табл. 20). Тот же эффект вызывала концентрация 0,0005 мг/л. Достоверное увеличение смертности от контроля вызывала максимальная из взятых нами концентрация (0,1 мг/л) гибель предличинок в которой превысила 50 и составила 60 %.
Анализ воздействия свинца на выживаемость предличинок японского анчоуса показал, что 48 ч ЛК5о оказалась равной 0,043 мг/л (табл. 22), а значение максимальной недействующей концентрации оказалось таким же (0,0004 мг/л), как и в 48 ч экспериментах на предличинках длиннорылой камбалы.
Обработка экспериментальных данных опытов со свинцом на предличинках японского анчоуса по методике пробит-анализа показала (рис. 10 а), что все взятые нами концентрации оказали токсический эффект, а угол наклона прямой, отражающей смертность, оказался несколько круче, чем в тех же опытах с длиннорылой камбалой. Следовательно, тот же диапазон концентраций оказывал на предличинок японского анчоуса больший эффект.
Продолжение экспериментов на предличинках длиннорылой камбалы показало, что к 72 ч экспозиции достоверное отличие значения смертности организмов от контроля наблюдалось в концентрациях 0,01 и 0,1 мг/л, гибель в контроле при этом составила 6,7 % (табл. 23).
Похожие диссертации на Оценка воздействия кадмия, цинка, свинца на выживаемость предличинок длиннорылой камбалы и японского анчоуса и перспективы их использования как тест-объектов
