Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Системы сапробности и токсобности и их место в оценке качества вод ...12
1.2. Инфузории как объекты биомониторинга 15
1.2.1. Инфузории в биотестировании 15
1.2.2. Протистопланктон в оценке качества вод 25
1.3. Применение светящихся бактерий в биотестировании 33
Глава 2. Материалы и методы 41
2.1. Характеристика водных объектов бассейна р. Енисей.. 41
2.1.1. Пруды-отстойники АО "Красфарма" 41
2.1.2. Пруд Бугач 45
2.1.3. Пруд Лесной 50
2.1.4. Красноярское водохранилище 52
2.2. Биология тест-объектов 61
2.2.1. Paramecium caudatum (Ehrb.) 61
2.2.2. Photobacterium phosphoreum (Cohn.) 63
2.3. Оценка чувствительности тест-объектов к модельному токсиканту 64
2.4. Методики оценки качества вод с использованием инфузорий 66
2.4.1. Методы биотестирования с Paramecium caudatum (Ehrb.) 66
2.4.1.1. Экспресс-метод 66
2.4.1.2. Хронический метод 68
2.4.2. Биоиндикация с использованием организмов протисто- планктона 69
2.5. Методика биотестирования с Photobacterium phosphoreum (Cohn.) 71
Глава 3. Токсичность вод в оценке по реакциям микроорганизмов 72
3.1, Хемотаксические реакции Paramecium caudatum (Ehrb.) 72
3.1.1. Пруды-отстойники АО "Красфарма" 72
3.1.2. Пруд Бугач 87
3.1.3. Пруд Лесной 93
3.1.4. Красноярское водохранилище 96
3.2. Взаимосвязь хемотаксических реакций и биомассы водорослей 101
3.3, Выживаемость Paramecium caudatum (Ehrb.) 103
3.3.1. Пруд Бугач 104
3.3.2. Пруд Лесной 107
3.4. Сравнительный анализ результатов токсичности вод по хемотаксическим реакциям и выживаемости Paramecium caudatum (Ehrb.) 108
3.5. Люминесценция Photobacteriumphosphoreum (Cohn.) 110
3.5.1. Пруд Бугач ПО
3.5.2. Пруд Лесной Ш
3.5.3. Пруды-отстойники АО "Красфарма" 112
3.5.4. Красноярское водохранилище 114
3.6. Сравнительный анализ токсичности вод по реакциям Paramecium caudatum (Ehrb.) и Photobacterium phosphoreum (Cohn.) 117
Глава 4. Пространственно-временная динамика структурно- функциональных характеристик протистопланктонных сообществ 120
4.1. Пруд Бугач 120
4.1.1. Видовой состав протозоопланктонного сообщества., 120
4.1.2. Численность и биомасса протозоопланктонного сообщества... 125
4.1.3. Продукция органического вещества 132
4.2. Пруд Лесной 134
4.2.1, Видовой состав протозоопланктонного сообщества 134
4.2.2. Численность и биомасса протозоопланктонного сообщества... 135
4.2.3. Продукция органического вещества 137
4.3. Пруды-отстойники АО "Красфарма" 138
4.3.1. Видовой состав и плотность протозоопланктонного сообщества 138
4.4. Красноярское водохранилище 141
4.4.1. Видовой состав протозоопланктонного сообщества 141
4.4.2. Численность и биомасса протозоопланктонного сообщества... 141
4.4.3. Продукция органического вещества 144
4.5. Оценка качества воды по индексу сапробности протозоо-планктонных сообществ... 145
4.5.1. Сезонная и пространственная динамика сапробности вод пруда Бугач 145
4.5.2. Сезонная и пространственная динамика сапробности вод пруда Лесной 155
4.5.3. Сезонная и пространственная динамика сапробности вод прудов-отстойников АО "Красфарма" 157
4.5.4. Сезонная и пространственная динамика сапробности вод Красноярского водохранилища 159
Глава 5. Анализ взаимосвязи методов биоиндикации и биотестирования .161
Выводы 174
Литература 176
- Инфузории в биотестировании
- Оценка чувствительности тест-объектов к модельному токсиканту
- Выживаемость Paramecium caudatum (Ehrb.)
Введение к работе
С увеличением темпов технического прогресса все сильнее проявляется влияние человека на окружающую среду. Особая проблема заключается в усиливающемся антропогенном влиянии на природные водоемы (Брагинский, 1985, 1998; Факторы самоочищения..., 1974). Одним из следствий подобного влияния является разрушение естественных взаимосвязей в водных экосистемах, что ведет к сокращению и исчезновению большинства видов. Необходимость в решении данной проблемы определяет важность разработки методов оценки качества природных вод (Брызгало и др., 2000; Виноградов и др., 1999; Горюнова и др., 2000).
Состояние окружающей среды и ее антропогенное загрязнение начали привлекать внимание еще в середине прошлого века, но лишь несколько десятилетий назад стали появляться экспериментальные разработки, направленные на предупреждение загрязнения водоемов и организации контроля за их состоянием (Полищук и др., 1983). К настоящему времени появились конкретные разработки в области экотоксикологической оценки качества вод (Дмитриев, 1999; Зимбалевская и др., 1988; Илющенко, 1995; Яшнов, 1969). Первым этапом послужила регламентация поступления токсичных веществ в водоем путем использования системы предельно допустимых концентраций (ПДК) и норм сброса (ПДС) сточных вод и их компонентов в природные водоемы (Болдырева и др., 1987; Бур дин, 1985).
Гидробиологической науке принадлежит ведущая роль в обосновании мероприятий, направленных на охрану чистоты вод (Спивак и др., 1990; Ша-туновский, 1998; Яшнов, 1969). Широко используемые в приемах оценки качества воды физико-химические методы способны оценить концентрацию и свойства поллютантов, попавших в водоем, но не могут произвести интегральную оценку состояния экосистемы водоема. Подобную оценку состояния вод можно провести лишь биологическими методами анализа (Волков и др., 1997; Жданова и др., 1985; Оксиюк и др., 1993). Методы биотестирования позволяют учесть суммарное взаимодействие поллютантов (аддитив-
6 ность), совместное усиление воздействия (синергизм), их взаимной нейтрализации (антагонизм), биологическую аккумуляцию веществ, что позволяет не недооценивать степень загрязнения водоема. Именно поэтому в практику токсикологического контроля были введены биологические методы, что позволило усовершенствовать методику нахождения уровней биологически безопасного разбавления (УББР), последовательную корректировку предельно допустимых концентраций веществ и постоянный контроль за состоянием водных экосистем (Банина, 1983; Бойкова, 1991).
В настоящее время для оценки состояния водных экосистем широко применяются многие организмы, принадлежащие самой водной среде (Гольд и др., 2000; Кожова и др., 1999). В качестве тест-объектов используются не только живые организмы, но и выделенные из них ферменты. Нередко используемые в эксперименте биотесты, в случае неправильного подбора, не позволяют получить полную картину загрязнения. Это вызвано тем, что разные организмы обладают неодинаковой чувствительностью к различным классам токсичных веществ в водных средах. Поэтому в биотестировании принято оценивать состояние водоема не по одному, а по двум - трем биотестам, желательно, принадлежащих к разным трофическим уровням экосистем (Филенко, 1985; Форощук, 1989; Шадрин, 2002).
Основной проблемой биотестирования является перенос полученных в лаборатории результатов на экосистему (Корби и др., 1998). Поэтому так важно установить взаимосвязь между процессами, происходящими в водоеме, и полученными лабораторными данными. Для уменьшения ошибок наиболее целесообразно совмещать результаты биологических и физико-химических методов анализа, устанавливая взаимосвязь биологии, гидрохимии водоема и данными методов биотестирования. По мнению ряда авторов (Экологический мониторинг..., 1995), не целесообразно значительно расширять перечень тест-объектов, так как увеличивается сложность экспериментирования с культурами многих организмов при биотестировании, теряется
быстрота метода, что скажется на его эффективности и ценности полученных результатов (Дьячков, 1984; Строганов, 1977; Щур и др., 1997).
Объективность экспертных оценок качества воды и состояния водных экосистем обеспечивается комплексным анализом индикаторных показателей с позиций хорошо обоснованных концепций: вода - это среда обитания гидробионтов; экологическое состояние водного объекта зависит от баланса между самоочищением и вторичным загрязнением; информационная значимость биоты определяется региональной спецификой (Гольд и др., 2003).
Зоопланктонные сообщества континентальных водоемов изучены достаточно хорошо, но до настоящего времени слабо изучена роль протозойного звена и его отдельных видов в оценке качества вод и состояния водных экосистем в целом. Пластичность, короткий цикл развития, быстрая реакция на изменения окружающей среды (экспресс-ответ) определяют поддерживаю-ще-регуляторную роль простейших в водной экосистеме, их чувствительность как тест-объекта на воздействие поллютантов (Инфузории в биотестировании..., 1998). Слабым местом остается взаимосвязь оценочных характеристик качества воды по результатам биотестирования и биоиндикации (Капустина и др., 1994; Макрушин, 1974; Мишель, 1992),
Используемая в российской и мировой практиках шкала сапробности нередко критикуется из-за экстраполяции индикаторной значимости организмов одного района на территории с иными отличными условиями. Са-пробный анализ качества вод, широко используемый в экологическом контроле, учитывает преимущественно степень органического загрязнения. Однако большинство водных объектов загрязнены поллютантами смешанной органической и неорганической природы, обуславливающих развитие токсичных ситуаций в воде. Модификация параметров индикаторной значимости видов протозоопланктона касается их интегральных реакций на смешанное загрязнение, совокупности сапробных и токсобных условий, формирующейся в окружающей среде, т.е. сапротоксобности.
В разработке и построении информационной модели состояния водной экосистемы Красноярского водохранилища, включающей блок оперативной оценки качества вод, требуются данные как по структурно-функциональным характеристикам всех составляющих биоты, так и по конкретным дескрипторам в оценке качества вод, включая сапротоксобный анализ. Ценной, высоко информативной составляющей в этом плане является протозоЙное звено биоты, которое в экосистемах бассейна р.Енисея до настоящего времени практически не изучено.
Разнообразие антропогенных воздействий на водоемы бассейна р.Енисея, комплексный анализ динамики структурных характеристик протистав и их реакций позволяют установить различные варианты индивидуальной сапротоксобности видов-протозоопланктеров, определить их место в унифицированной классификации качества вод по биологическим показателям, разработанной с учетом регионального фактора (Гольд и др., 2003).
Объект исследования. Протозоопланктонные сообщества и тест-объекты (микроорганизмы) в биомониторинге природных вод бассейна р. Енисей -пруды Бугач и Лесной, пруды-отстойники АО "Красфарма", Красноярское водохранилище.
Цель работы. Изучение комплексных оценок качества вод экосистем бассейна р.Енисей, находящихся в разных режимах антропогенной нагрузки, по структуре природного протозоопланктона и реакциям микроорганизмов на воздействие этих вод (в эксперименте).
Задачи работы:
1. Определить пространственно-временную динамику токсичности и уровней биологически безопасных разбавлений вод (УББР) водоемов бассейна р. Енисей (пруды Бугач, Лесной; пруды-отстойники промышленного предприятия - АО "Красфарма", Красноярское водохранилище) по реакциям микроорганизмов (в эксперименте) - инфузория Paramecium caudatum и светящаяся бактерия Photobacterium phosphoreum.
Проследить взаимосвязь динамики токсичности вод с динамикой доминирующих видов фитопланктона, концентрацией хлорофилла и гидрохимическими показателями.
Выделить структурообразующий комплекс видов протозоопланктона исследуемых водоемов.
Оценить качество вод исследуемых водоемов по индивидуальной са-пробности протистов и их численности.
Изучить взаимосвязь результатов биотестирования и биоиндикации с целью включения их критериев в комплексную оценку качества вод по биологическим показателям.
Выбор водоемов наблюдения был обоснован необходимостью анализа водных объектов, находящихся в разных режимах антропогенного воздействия: пруды-отстойники АО "Красфарма" - преобладающий фактор - промышленные стоки, пруд Лесной - селитебные факторы, пруд Бугач и Красноярское водохранилище - комплексное воздействие промышленного и селитебного фактора. Использование в качестве тест-объектов микроорганизмов -инфузории Paramecium caudatum и светящейся бактерии Photobacterium phosphoreum обосновано эффективным и быстрым ответом тест-объекта на загрязнение, легкостью культивирования, невысокой продолжительностью эксперимента (15-30 мин.).
Научная новизна работы. Впервые выделен структурообразующий комплекс видов протозоопланктона водоемов бассейна р. Енисея, установлены закономерности пространственно-временной динамики плотности и продукции протистов; дана оценка современного уровня сапробности вод на основе структурной организации протозоопланктонных сообществ. Впервые изучена динамика токсичности вод бассейна р. Енисея по реакциям инфузорий и светящихся бактерий. Выявлены эндогенные источники токсичности, стратификация токсичности, независимость уровня токсичности вод от сезона года и др. Впервые оценена экологическая ситуация различных по характеру антро-погенной нагрузки водоемов с использованием комплексного подхода - са-
протоксобной оценки качества вод по природным и лабораторным экспериментам с популяциями протозойного и бактериального звеньев.
Защищаемые положения:
1 .Токсичность вод, оцененная по хемотаксическим реакциям Paramecium caudatum и люминесценции светящихся бактерий Photobacterium phos-phoreum, определяется специфическими гидрологическими, гидрохимическими характеристиками и уровнем антропогенного воздействия на экосистемы исследуемых водоемов.
Структура протозойных сообществ характеризуется сезонной динамикой плотности, сменой доминирующих комплексов, специфичных для исследуемых водоемов.
Таксономический состав, уровень развития протозоопланктона по показателю сапробности дают выровненные оценки качества вод на уровне III класса.
В комплексную оценку качества вод включен сапротоксобный анализ, основанный на регистрации токсических эффектов по реакциям тест-объектов, динамике численности организмов протозоопланктона и их индивидуальных величин сапротоксобности.
По структурным характеристикам организмов протозоопланктона через индексы сапробности и сапротоксобности, по хемотаксическим реакциям Paramecium caudatum разработаны шкала токсичности природных вод и классификатор качества вод по протозойному звену биоты водоемов бассейна р.Енисея.
Практическое применение. Результаты проведенного исследования будут включены в разрабатываемую информационную модель Красноярского водохранилища (величины индивидуальной сапротоксобности протистов, динамика плотности, продукции и др.). Полученные результаты будут включены в программу экологического мониторинга, осуществляемого на Красноярском водохранилище и пруду Бугач. Они необходимы для экологического контроля: по линии биотестирования - острые и хронические эксперимен-
11 ты с Paramecium caudatum, биоиндикации - плотность популяций протозоо-планктона. С учетом хемотаксических реакций тест-объекта Paramecium саи-datum и протозойного звена природных сообществ дополнен унифицированный классификатор качества вод по химическим и биологическим показателям.
Апробация работы. Результаты исследований были представлены; на научно-практической конференции "Достижения науки и техники - развитию сибирских регионов" (Красноярск, 1999); на VII научно-практической и методической конференции, посвященной 100-летию Красноярского отдела РГО " География на службе науки и техники" (Красноярск, 2001); на краевой межвузовской научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Интеллект-2001" (Красноярск, 2001); на II Всероссийской научно-практической конференции "Проблемы экологии и развития городов" (Красноярск, 2001); на II конгрессе молодых ученых и специалистов "Науки о человеке" (Томск, 2001); Южно-Сибирской международной научной конференции студентов и молодых ученых "Экология Южной Сибири" (Абакан, 2001, 2002); на VIII Гидробиологическом съезде (Калининград, 2001); на Всероссийской конференции с участием специалистов из стран ближнего и дальнего зарубежья "Современные проблемы водной токсикологии" (Борок, 2002); на Международной конференции "Новые технологии в защите биоразнообразия в водных экосистемах" (Москва, 2002); на II Международной научной конференции "Озерные экосистемы: биологические процессы, антропогенная трансформация, качество воды" (Минск, 2003).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ (в виде тезисов и статей).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 5 глав, списка цитируемой литературы, включающего 163 наименования, из них 28 на иностранных языках. Материалы изложены на 175 страницах машинописного текста, включая 16 таблиц и 42 рисунка.
Место проведения работы. Работа выполнялась в лаборатории "Биотестирования вод" кафедры гидробиологии и ихтиологии Красноярского государственного университета (г. Красноярск). Полевые исследования проводились на водных объектах бассейна р.Енисей, расположенных в окрестностях г. Красноярска (пруды Бугач, Лесной, пруды-отстойники АО "Красфарма", Красноярское водохранилище).
Автор благодарит за предоставленные данные по физико-химическому составу воды, биомассе и численности организмов фито-, зоо- и бактерио-планктона прудов Бугач и Лесной сотрудников лаборатории экспериментальной экологии Института Биофизики СО РАН (г. Красноярск) - к.б.н. Дубовскую О.П., д.б.н, Колмакова В.И. и н.с. Кравчук Е.А.и декана эколого-биотехнологического факультета КрасГАУ к.б.н., Мучкину Е.Я. Автор вы-ражает признательность к.б.н.Оболкиной Л.А. - за обучение методикам работы с простейшими, д.б.н. Мыльникова AM. и к.б.н. Мыльникову З.М. — за помошь в получении г\енной литературы и освоении современных методов кино- и фотосъемки протистав. Особую благодарность - научному уково-дителю автора - к.б.н., проф. Гольд З.Г. за многолетнее руководство и помощь в работе; также автор благодарит всех сотрудников каф. гидробиологии и ихтиологии КрасГУза помощь и поддержку.
Инфузории в биотестировании
Использование инфузорий в оценке качества вод обладает рядом преимуществ по сравнению с другими тест-объектами (Бойкова, 1991; Межеви-кина и др., 19S4): культивирование простейших проще и дешевле, они удобны в использовании, эффективны при ограниченном времени, сложное строение организма позволяет переносить полученные результаты на человека и млекопитающих, а малое время эксперимента (до 15-30 минут) дает возможность использования инфузорий в биотестировании (Брагинский, 1987; Пожаров, 1994). Инфузория представляет собой сложный организм, чутко реагирующий на изменение внешних условий, при этом проявление реакций на внешнее воздействие можно достаточно легко зарегистрировать (Новосадова и др., 1991; Сазонова и др., 1998; Саратовских и др., 1997).
Несмотря на негативную реакцию на смену внешних условий инфузория способна адаптироваться к ним, что, в дальнейшем, позволяет зарегистрировать загрязнение среды, к которой организм уже адаптировался (Бирнштейн, 1949). При попадании инфузории из пресной среды в среду с высокой соленостью (7-12 промилле) довольно быстро происходила гибель организма (чему предшествовало сморщивание тела, быстрое беспорядочное плавание, утрачивание сократимости стебелька у сувоек). При этом лимитирующее воздействие (соленость ниже 6 промилле) проявлялось на личиночной стадии и стадии размножения. Но многие виды инфузорий способны переносить соленость до 5 промилле без вреда для себя. Среди пресноводных простейших, наряду с формами, обладающими пульсирующими вакуолями, и, следовательно, способными к активной осморегуляции, существуют некоторые виды инфузорий, лишенные органов осморегуляции и, очевидно пойкилоосмотич-ные. Различия между морской и пресноводной протозойной фауной тем значительнее, чем менее совершенны осморегуляторные способности той или иной группы инфузорий (Бурковский, 1984; Хлебович, 1960).
Нередко во время проведения экспериментов с тест-объектами {Paramecium caudatum, Tetrachymena pyriformis Muell.) требуются данные по устойчивости организмов к низким (в зимний период) и высоким (в летний) температурам. Низкие температуры - это те, которые расположены ниже оптимальной адаптивной температурной зоны организма или вида и которые вызывают специфическую реакцию биологической системы независимо от температурной шкалы. При понижении температуры в организме инфузорий появляются накопления жировых капель, но при месячной адаптации накопления исчезают. У инфузорий при температуре около 0С отмечается уменьшение размеров тела либо его округление. Наличие в среде избытка NaCL, KCL снижает холодоустойчивость инфузорий, а наличие CaCL2 и диметилсульфоне и да повышает. Адаптированные к холоду парамеции (0С) устойчивы к воздействию малоната и глюкозомонойодацетата (ингибиторов дыхания). Адаптированные тетрахимены в среде с пептоном, триптоном и диметилсульфоне идам способны выдерживать низкие температуры без вреда для себя (Ирлина, 1963; Лозина-Лозинский, 1972; Флеров, 1971).
Влияние ингибиторов дыхания-малоната, цианистого калия (KCN) и гликолиза-монойодацетата на парамеций, адаптированных к разным температурам, неодинаково. При высоких температурах (до +29С) ведущую роль играет дыхание, связанное с цитохром-цитохромоксидазной системой, У подобных адаптированных парамеций, чувствительных к цианистому калию, гликолитическая система не играет существенной роли. У контрольных организмов, адаптированных к температуре +14С, отмечалась высокая чувствительность к малонату и моноиодацетату, а влияние KCN было невелико. В данном случае, вероятно, немалое участие в дыхании принимают гликолити-ческие процессы. Влияние ингибитора гликолитического дыхания резко проявляется у парамеций, адаптированных к низким температурам (+ 4С). Это вызвано тем, что при низких температурах в клетке инфузории преобладают процессы гликолиза. Необходимо учесть, что температурный оптимум этого рода инфузорий лежит в пределах +25-+30С (Вопросы экологии..., 1978; Ирлина, 1963).
Одним из важных параметров парамеций, используемых в биотестировании, является динамика движения клетки. Наиболее часто у парамеций наблюдают два способа перемещения во внешней среде - передним концом вперед и попятное. Однако этим не исчерпывается все разнообразие форм движения простейших. Отмечено (цит, по Серавин, 1967), что у парамеций наблюдается 11 способов движения: 1) движение вперед с вращением вокруг продольной оси влево; 2) движение вперед с вращением вправо; 3) движение вперед по винтообразному пути с уклоном влево/вправо; 4) движение вперед без вращения вокруг продольной оси тела; 5) попятное движение; 6) воронкообразное движение; 7) вращение вокруг меньшей оси тела; 8) обходное движение; 9-10) круговое движение по замкнутой кривой влево/вправо; 11) движение, основанное на синхронном биении ресничек.
В норме парамеция плывет по прямой линии со скоростью 1,8-2,2 мм/сек по замкнутой траектории, проходя в сутки до 200 метров, вращаясь вокруг продольной оси влево; при встрече с зоной химического раздражителя, инфузория, натолкнувшись на эту зону, переходит к попятному движению (Серавин, 1967). Сначала она плывет по прямой линии задним концом вперед, вращаясь вокруг продольной оси вправо. Перемещаясь таким образом в течение 1,5 секунд, инфузория проходит расстояние равное шести длинам тела. Затем попятное движение замедляется, передний конец совершает воронкообразные движения с увеличением диаметра. Позднее попятное движение прекращается полностью; парамеция вращается на одном месте, описывая передним концом конус, а затем переходит к нормальному движению. Это называется реакцией избегания (Морфология и физиология простейших..., 1963; Серавин, 1967; Флеров, 1977).
Если парамеция попала в раствор с химическим реагентом, то попятное движение продолжается 20-30 секунд. Путь становится спиралеобразным, с постоянно увеличивающимся диаметром спирали. Затем совершается движение на одном месте с радиусом равным длине тела в течение 90 секунд. В дальнейшем (2-3 минуты) совершается движение вокруг точки, лежащей вне тела. Диаметр круга постепенно увеличивается, переходя в сильно растянутую спираль, а лишь затем идет постепенное возвращение к попятному движению. При нормальном движении гребни биения ресничек образуют лево-закрученную спираль, при попятном - правозакрученную, а в момент выхода из зоны действия химического агента нормальное биение ресничек восстанавливается на переднем конце тела, захватывая вскоре задний конец. В данный момент темп движения нарушен и инфузория вращается на одном месте несколько секунд (Движение и поведение..., 1978; Литвин и др., 1999; Серавин, 1967). У инфузории Paramecium caudatum и ряда других инфузорий попятное движение вызывается не только механическим раздражением, но и любыми одновалентными катионами, тогда как двухвалентные катионы, кислоты и не электролиты здесь не эффективны. Нередко различия результатов по одному виду у разных авторов вызваны состоянием организма в момент опыта (возраст культуры, ее состояние и т.д.), а не только концентрацией того или иного катиона в окружающей среде, К тому же поверхностная мембрана инфузории гетерогенна, т.е. ее разные участки по-разному реагируют на разные раздражители. Например, передний конец тела чувствительнее заднего к механическому и химическому раздражению (Вопросы экологии..., 1978; Литвин и др., 1999).
Оценка чувствительности тест-объектов к модельному токсиканту
Проверку готовности культуры тест-объекта Paramecium caudatum к анализу проводят по двум параметрам одновременно (Анализ воды на токсичность..., 1995; Биотестер..., 1995):
- по степени выхода инфузорий в контрольную чистую пробу со средой Лозина-Лозинского;
- по чувствительности к модельному токсиканту.
Для проверки выхода инфузорий в контрольную пробу заполняют три кюветы взвесью клеток, наслаивают среду Лозина-Лозинского и через 15-30 минут измеряют концентрацию в верхних зонах кювет на приборе "Биотес-тер-2". Усредняют результат по трем кюветам и определяют готовность тест-культуры к биотестовому анализу по условию: выход должен быть не менее 70% от концентрации рабочей взвеси, т.е. 900±200 клеток/мл.
Модельный токсикант готовят на основе сульфата меди CuS04 5H20 -маточный раствор (10 мг/дм ) в дистиллированной воде и хранят не более недели. Рабочие концентрации сульфата готовят перед самым экспериментом. Для проверки чувствительности к модельному токсиканту в три кюветы наслаивают раствор сульфата меди с концентрацией 0,1 мг/дм , приготовленный на среде Лозина-Лозинского. Через 15-30 минут измеряют концентрацию в верхних зонах кювет и рассчитывают индекс токсичности к раствору сульфата: при показателе равном 0,2 Т 0,7 культуру используют в биотестовом анализе (табл. 4).
Таблица 4 65
Проверка чувствительности тест-объекта Photobacterium phosphoreum Cohn, к модельному токсиканту осуществляется с целью оценки возможности его использования в токсикологических экспериментах (Определение токсичности..., 1997). В качестве модельного токсиканта используют сернокислую медь (CuS04 H20), которую предварительно высушивают в сушильном шкафу при температуре +105С в течение одного часа и охлаждается в эксикаторе в течение 40 минут. На контрольной среде с 3% концентрацией солей NaCL готовится ряд растворов модельного токсиканта с концентра-циями: 1 г/дм , 0,1 г/дм , 0,03 г/дм , 0,01, г/дм . Если уровень биолюминесценции уменьшается при действии сернокислой меди в концентрации 0,03 г/дм3 не менее, чем на 50% через 15 минут, то биотест может использоваться в биотестировании (табл. 5).
Методики оценки качества вод с использованием инфузорий 2.4.1. Методы биотестирования с Paramecium caudatum (Ehrb.)
Сущность метода (Анализ воды на токсичность..., 1995; Биотестер,.., 1995):
Метод определения токсичности жидких сред основан на способности тест-объекта реагировать на появление в водной среде веществ, представляющих опасность для жизнедеятельности организма, и направленно перемещаться по градиенту концентраций этих веществ (хемотаксическая реакция), избегая их воздействия.
Хемотаксическая реакция реализуется при условии наличия стабильного и воспроизводимого градиента концентраций химических веществ, создающийся путем наслоения в вертикальной кювете на взвесь инфузорий в загустителе испытуемой водной пробы. При этом образуется стабильная граница, не препятствующая перемещению инфузорий.
Критерием токсического действия является значимое различие (по критерию Стьюдента) в числе клеток инфузорий, наблюдаемых в верхней зоне кюветы в пробе, не содержащей токсичных веществ (контроль), по сравнению с этим показателем, наблюдаемым в исследуемой пробе (опыт). Оптимальная концентрация клеток инфузорий для процедуры экспресс-анализа токсичности вод на приборе "Биотестер-2"составляет 1000±200 кл./мл (Анализ воды на токсичность..., 1995).
Прибор предназначен для реализации методик биологического тестирования, позволяя определять концентрацию живых движущихся клеток микроорганизмов типа инфузорий, используемых в качестве тест-объектов. Прибор представляет собой специализированный импульсный фотометр. Импульсный монохроматический световой поток от источника излучения проходит через верхнюю часть кюветы с испытуемой пробой и преобразуется фотодиодами и предусилителем с синхронным детектором в электрический сигнал. При наличии в пробе движущихся клеток изменяется коэффициент пропускания жидкой среды, находящейся в кювете. Происходит усреднение сигнала по заданному интервалу времени и показания выводятся на информационном табло. Показания (в условных единицах) характеризуют среднюю концентрацию движущихся клеток, находящихся в пробе. Индекс токсичности вод (ТО определяется по формуле: Tj=(JK-J0)/JK, где -контрольные, Jo-опытные показания прибора; порог допустимой токсичности при 0,00 Т; 0,25; умеренной 0,26 Tj 0,70; высокой Т; 0,71. Токсичность - это степень проявления ядовитого действия разнообразных соединений и их смесей, которые повреждают, ингибируют, стрессируют, вызывают генетические изменения или убивают организмы в воде, почве и воздухе (Жмур, 1997). Определение концентрации подвижных клеток проводят по предварительно построенной градуировочной кривой (рис. 7).
Выживаемость Paramecium caudatum (Ehrb.)
Для выявления хронического токсичного воздействия на выживаемость и смертность тест-объекта - инфузории Paramecium caudatum за период с 03.07.02. по 24.07,02. проводились эксперименты с неразбавленной водой прудов Бугач (ст. 1, 2а, 5а) и Лесной. Целью было сопоставление результатов по токсичности вод прудов бассейна р.Енисей по экспресс-методу (хемотак-сические реакции) и хроническому методу (выживаемость в ряду поколений), оценка информативности качества вод по тест-объекту Paramecium caudatum.
Протестированные природные воды пруда, отобранные 03.07.02., не приводили к достоверному снижению темпа выживаемости парамеций в вариантах вод со ст.1 в первые 24ч эксперимента. Данная динамика выживаемости парамеций сохранялась все 72ч эксперимента (табл. 7): LK±mK =5,6+0,75; L0±m0 =4,5+0,64. Следовательно, природные воды пруда на центральной реперной ст.1 по динамике выживаемости парамеций характеризовались по критерию Стьюдента как нетоксичные (Р 0,05).
Воды со ст.1, отобранные 10.07.02,, снижали выживаемость парамеций по сравнению с контролем в 3 раза к исходу 72ч эксперимента, что свидетельствует о хронической токсичности вод (Р 0,05): LK+mK =9,1 ±0,89; L0+m0 =3,0+0,63.
Природные воды, отобранные 17.07.02., в варианте вод со ст.1 вод в первые 24ч эксперимента стимулировали рост численности парамеций в опыте, по сравнению с контролем, более чем в 2 раза: LK+mK =9,1+2,41; L0±mo=22,2+3,07. В последующие сутки эксперимента тестируемые воды не вызывали значительного стимулирования темпа выживаемости клеток парамеций или смертности парамеций по сравнению с контролем: LK±mE =11,2+2,27; L0+m0 =15,2+2,04. Следовательно, воды пруда Бугач в варианте вод со ст. 1 характеризовались как хронически токсичные (Р 0,05) первые 24ч эксперимента (на уровне стимулирования численности парамеций) и данный эффект снимался в последующие 48ч, т.е. происходила адаптация парамеций по истечении 72 ч.
Природные воды, отобранные в конце июля 2002 г. - 24,07.02., в варианте вод со ст. 1 вод в первые 48ч эксперимента ингибировали рост численности парамеций в опыте, по сравнению с контролем, более чем в 2 раза: LK±mK =10,0±2,72; ЬДт0=4,5+0,54. В последующие сутки эксперимента (72ч) тестируемые воды не вызывали изменения роста численности парамеций по сравнению с контролем: LK±mK=10,3±l,67; Lo+mo=10,2±2,l 1.
Следовательно, воды пруда Бугач, отобранные 3 июля 2002 г.на центральной ст. 1, не оказывали токсического эффекта за все 72 ч эксперимента (Р 0,05); воды, отобранные 10 июля, оценивались как хронически токсичные к исходу 72 ч (Р 0,05). Воды пруда Бугач в варианте вод со ст. 1, отобранных 17 и 24 июля 2002 г., характеризовались как хронически токсичные (Р 0,05) в первые 24ч эксперимента и данный эффект не отмечался в последующие сутки - 72ч (Р 0,05), что, по-видимому, связано с адаптацией клеток парамеций к тестируемой воде в ряду поколений.
Воды пруда, отобранные 17.07.02., в варианте со ст. 2а не приводили к снижению темпа выживаемости парамеций в опыте, по сравнению с контролем в первые сутки эксперимента: LK+mK =9,1+2,41; L0±m0-15,1+3,53 (отмечен только некоторый стимулирующий эффект, что свидетельствует о неблагоприятном воздействии тестируемых вод на выживаемость парамеций). Следовательно, воды пруда Бугач в вариантах вод со ст. 2а характеризовались как хронически токсичные (Р 0,05).
Воды пруда, отобранные 24.07.02., в варианте со ст. 2а приводили к стимулированию темпа выживаемости парамеций в опыте, по сравнению с контролем в первые сутки эксперимента: LK±mK =4,0±0,72; Lo+m0 =7,1 ±0,59. По истечении 72ч опыта хронический эффект проявлялся на уровне ингибирова-ния темпа деления клеток: LK±mK =10,3±1,67; Lo±m0 =4,3±0,84. Следовательно, воды пруда Бугач в вариантах вод со ст. Т характеризовались как хронически токсичные (Р 0,05).
Природные воды пруда (ст. 5я, 17.07.02.), отобранные у плотины, приводили к стимулированию выживаемости парамеций на 50 % в первые 24ч эксперимента: LK+mK =4,2±0,53; Lo±m0 =6,5+0,58. К исходу 72ч. произошло снижение темпа выживаемости клеток в 3 раза по сравнению с контролем: LK±mK=16,3±3,28; ЬДт0 =5,4±1,22. По-видимому, это вызвано адаптациями парамеций к тестируемой воде в первые 24ч., но данные адаптации к исходу 72ч. оказались временными, т.е. сменились ингибированием темпа размножения. Таким образом, воды пруда Бугач в варианте вод со ст. 5а характеризовались как хронически токсичные к исходу 72ч, (Р 0,05).
