Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Экологические и физиологические особенности гидробионтов класса Hirudinea (литературный обзор) 13
1.1 Экология и физиология медицинской пиявки Hirudo medicinalis 13
1.2 Экологическая обусловленность микроэлементного статуса гидробионтов 32
1.3 Роль аминокислот в поддержании гомеостаза 49
Глава 2. Материалы и методы исследования 61
2.1 Общая характеристика экспериментального материала 61
2.2 Краткая характеристика основных водоёмов отлова лечебной (H.m.medicinalis) и аптечной (H.m.officinalis) пиявок 67
2.3 Методика исследования основного обмена 71
2.4 Методика определения микроэлементов 72
2.5 Анализ аминокислотного состава кожно-мышечной ткани медицинской пиявки 73
2.6 Лабораторный эксперимент по изучению динамики накопления тяжёлых металлов и состояния аминокислотного пула в тканях медицинской пиявки из природных популяций и выращенной на биофабрике 75
2.7 Статистические методы обработки полученных результатов 76
Глава 3. Экологические аспекты физиологического состояния медицинской пиявки из природных популяций и выращенной на биофабрике 78
3.1 Видовые и популяционные особенности основного обмена медицинской пиявки 78
3.2 Анализ содержания микроэлементов в тканях медицинской пиявки из природных популяций и выращенной на биофабрике 82
3.2.1 Содержание тяжёлых металлов в донных отложениях исследуемых водоёмов медицинской пиявки 82
3.2.2 Содержание микроэлементов в тканях пиявок из природных популяций различных географических зон 85
3.2.3 Содержание микроэлементов в тканях пиявок, выращенных на биофабриках различных регионов России 91
3.2.4 Сравнительный анализ содержания биологически активных металлов в тканях пиявок из природных популяций и выращенных на биофабрике 92
3.3 Состояние фонда свободных аминокислот в тканях медицинской пиявки 94
3.3.1 Содержание свободных аминокислот в тканях лечебной и аптечной пиявок из природных популяций различных географических зон 95
3.3.2 Взаимосвязь спектра свободных аминокислот и микроэлементов в тканях пиявок природных популяций различных географических зон 103
3.3.3 Сезонная изменчивость содержания свободных аминокислот в тканях пиявок из природных популяций 105
3.3.4 Содержание свободных аминокислот в тканях пиявок, выращенных на биофабриках различных регионов России 107
3.3.5 Сравнительная оценка аминокислотного состава тканей пиявок из природных популяций и выращенных на биофабрике 113
Глава 4. Оценка адаптационно-компенсаторных возможностей медицинской пиявки в условиях модельного эксперимента 119
4.1 Состояние аминокислотного пула и особенности накопления тяжёлых металлов в тканях медицинской пиявки в условиях длительного воздействия ионов меди и кадмия 119
4.1.1 Динамика накопления цинка, меди, кадмия, свинца и состояние аминокислотного пула в тканях медицинской пиявки при длительном воздействии ионов меди 119
4.1.2 Динамика накопления цинка, меди, кадмия, свинца и состояние аминокислотного пула в тканях медицинской пиявки при длительном воздействии ионов кадмия 126
4.2 Сравнительный анализ адаптационно-компенсаторных механизмов микроэлементного обмена и азотистого метаболизма в тканях медицинской пиявки из природных популяций и выращенной на биофабрике 133
Заключение 151
Выводы 162
Библиографический список 164
- Экология и физиология медицинской пиявки Hirudo medicinalis
- Краткая характеристика основных водоёмов отлова лечебной (H.m.medicinalis) и аптечной (H.m.officinalis) пиявок
- Содержание свободных аминокислот в тканях лечебной и аптечной пиявок из природных популяций различных географических зон
- Сравнительный анализ адаптационно-компенсаторных механизмов микроэлементного обмена и азотистого метаболизма в тканях медицинской пиявки из природных популяций и выращенной на биофабрике
Введение к работе
Актуальность проблемы. Проблема сохранения редких и исчезающих видов чрезвычайно важна для регионов с экстремальными условиями обитания, определяемыми как природными, так и антропогенными факторами. В исследованиях В.Н. Большакова (1972), С.С. Шварца (1980), В.П. Казначеева, (1980), П.Д. Горизонтова (1983), Э.И. Колчинского (1990), Ф.З. Меерсона (1993), Е.А. Коваленко (2000), Д.З. Шибковой, А.В. Аклеева (2006), показано, что организм при воздействии стрессирующих факторов внутренней и внешней среды мобилизует различные структурно-метаболические и молекулярные механизмы аварийного регулирования систем поддержания гомеостаза, снижая негативные последствия их влияния на патогенетические механизмы повреждения органов и систем.
В этом аспекте несомненна актуальность исследований роли физиологических процессов в функционировании экологических групп животных, в поддержании численности, структуры вида и определении характера микроэволюционных преобразований в популяциях животных (Тимофеев-Ресовский, 1958; Одум, 1975; Слоним, 1982; Большаков и др., 1984, 1991, 2009; Вершинин, 2009).
Указанная проблема в полной мере приложима к медицинской пиявке (Hirudo medicinalis L.), на которую распространяется действие международной конвенции CITES. Медицинская пиявка - значимый биологический ресурс России, широко применяется в практической медицине. Используется она и как сырьё для получения лекарственных препаратов и пищевых биодобавок (Исаханян, 1991; Селезнев, 1996; Самойлов, 2001; Живогляд, 2001; Березовская и др, 2003; Геращенко, Никонов, 2005; Каменев, Барановский, 2006; Никонов, 2007).
Сохранение ресурсов медицинской пиявки в России и ее рациональное использование в современных условиях высокого спроса является одной из актуальных проблем природопользования. Спрос на медицинскую пиявку на фармацевтическом рынке, неконтролируемый браконьерский отлов, а также глобальное загрязнение привели к тому, что к настоящему времени медицинская пиявка является исчезающим видом (Каменев, 2007). Одним из факторов, приводящих к сокращению численности, а в итоге к исчезновению отдельных видов гидробионтов, считается и техногенное загрязнение водной среды такими поллютантами, как тяжёлые металлы (ТМ) - Си, Zn, Cd, Pb (Майстренко, 1996; Агаджанян, Скальный, 2001; Рахманин, Русаков и др., 2005;
Безель, 2006).
Исследованиями НА. Агаджаняна, А.В. Скального (2001), Д. Оберлис и др. (2008) показано, что в общую регуляторную систему организма на всех стадиях развития включена микроэлементная физиологическая система гомеостаза, определяющая реакцию организма на аккумуляцию загрязнителей изменениями в процессах метаболизма. Это тем более важно, так как медицинскую пиявку для лечебных целей выращивают в контролируемых условиях на биофабриках, изначально используя пиявок-маток из природных популяций.
Литературный обзор показал, что к настоящему времени подробно изучены фармакологические аспекты применения биологически активных соединений, продуцируемых медицинскими пиявками, тем не менее, комплексные сведения, касающиеся физиологического состояния медицинской пиявки из природных популяций и выращенной на биофабрике, практически отсутствуют. Нет полного представления о содержании микроэлементов (МЭ) в тканях пиявок, в том числе и о влиянии солей ТМ на жизнеспособность и лечебное действие медицинской пиявки. Исследования в эколого-физиологическом сравнительном аспекте медицинской пиявки из природных популяций и выращенной на биофабрике практически отсутствуют как на популяционном, организменном, так и на клеточном уровне, в то время как оценка физиологического состояния с позиции оптимального аминокислотного баланса в организме способна пролить свет и на резервные адаптивные возможности пиявок в перманентно изменяющихся условиях среды обитания.
Различия в образе жизни и в условиях содержания или обитания влияют на физиологию медицинской пиявки, а, следовательно, и на выбор правильной стратегии выживания. Актуальность и состояние вопроса об экологии, физиологии и адаптивных возможностях представителей гирудофауны - двух подвидов медицинской пиявки в современных условиях обитания в природных популяциях и при их воспроизводстве на биофабриках, предопределило цели и задачи нашего исследования.
Цель исследования: изучить эколого-физиологические особенности двух подвидов медицинской пиявки (Hirudo medicinalis L.)\ аптечной (Hirudo medicinalis officinalis) и лечебной (Hirudo medicinalis medicinalis) из природных популяций и выращенных на биофабрике.
Задачи исследования:
1. исследовать состояние основного обмена лечебной (Н.т.medicinalis) и аптечной (Н.т. officinalis) пиявок, обитающих в естественных условиях и
выращенных на биофабрике;
определить содержание микроэлементов (Си, Zn, Mn, Fe, Ni, Cd, Pb) в тканях медицинской пиявки (Hirudo medicinalis L.) из природных популяций и выращенной на биофабрике;
изучить состояние фонда свободных аминокислот в тканях лечебной и аптечной пиявок различных физиологических групп;
экспериментально, в контролируемых условиях, провести сравнительный анализ хронического воздействия экотоксикантов на динамику их накопления и состояние аминокислотного пула в тканях пиявок из природных популяций и выращенных на биофабрике.
Научная новизна исследования
Впервые на единой методологической (эколого-физиологической) основе проведены комплексные полевые и экспериментальные исследования энергетического обмена, аминокислотного фонда, микроэлементного состава тканей двух подвидов Hirudo medicinalis: аптечной и лечебной из природных популяций Тамбовской, Луганской областей, Краснодарского края и выращенных на биофабриках: ГирудИ.Н. (Саратовская область), «Международный Центр медицинской пиявки» (Московская область) и «Гирудо-Мед.Юг» (Краснодарский край).
Показаны особенности основного обмена лечебной и аптечной пиявок, обитающих в природных водоёмах и выращенных на биофабрике.
Выявлены внутривидовые и географические различия в содержании микроэлементов МЭ (Си, Zn, Mn, Fe, Cd, Pb, Ni) в тканях медицинских пиявок из природных популяций. Ранговый корреляционный анализ выявил статистически значимые положительные связи между содержанием в донных отложениях Си, Fe, Cd, Pb, Ni и их биоаккумуляцией в тканях медицинских пиявок из природных популяций (г = 0,8 - 0,95, при р<0,0001). Медицинские пиявки в условиях искусственного разведения аккумулируют в своих тканях Си, Cd, Pb и Ni в более высоких концентрациях, чем пиявки из природных популяций.
Установлено, что зависимость концентраций свободных аминокислот от времени воздействия ТМ указывает на их активное участие в процессах детоксикации и адаптации пиявок к избыточному присутствию токсикантов в водной среде и, соответственно, в тканях. В модельном эксперименте установлено, что пиявки, выращенные на биофабрике, обладают более высокой резистентностью к воздействию экстремально высоких концентраций ТМ.
Теоретическая и практическая значимость работы
Оценка физиологической валентности вида и подвидов медицинской пиявки даёт возможность по новому подойти к решению практических и теоретических задач экологии, связанных как с рациональным использованием биологических ресурсов, так и с возможностью глубокого и всестороннего понимания закономерностей эволюционного процесса.
Полученные экспериментальные результаты, дополняя данные других исследователей, показали, что ткани медицинских пиявок содержат высокие концентрации свободных аминокислот - жизненно необходимых биологически активных соединений, что является дополнительным показанием к использованию гомогенатов Н.т.officinalis и H.m.medicinalis в фармацевтике и косметологии при условии сохранения их численности и видового разнообразия в естественной среде обитания.
Материалы научных исследований используются в учебно-педагогическом процессе на кафедре биологии и медицинской генетики Уральской государственной медицинской академии г. Екатеринбурга. Результаты исследований внедрены в практическую работу лаборатории «Проблемы адаптации» при ГУ Средне - Уральского научного центра Российской академии медицинских наук и Правительства Свердловской области.
Основные положения, выносимые на защиту
Основной обмен лечебной (H.m.medicinalis) и аптечной (Н.т. officinalis) пиявок, обитающих в природных водоёмах и выращенных в условиях биофабрики, предопределяется биогеохимической обстановкой экосистем и существенно зависит от популяции и физиологического состояния гидробионтов.
Характер накопления и распределения микроэлементов в тканях аптечных и лечебных пиявок различен, зависит от природы и продолжительности воздействия фактора. Медицинские пиявки проявляют высокую кумулятивную активность по отношению к биофильным элементам и к ксенобиотикам.
Фонд свободных аминокислот достоверно различен у аптечной и лечебной пиявок из природных популяций и выращенных на биофабрике. В тканях медицинских пиявок, выращенных на биофабрике, повышено содержание свободных аминокислот, участвующих в процессах детоксикации
высоких концентраций ТМ.
4. Медицинские пиявки, выращенные в контролируемых условиях биофабрики, обладают механизмами защиты от повреждающего хронического воздействия смеси экотоксикантов.
Апробация работы. Материалы диссертационного исследования представлены на различных научных форумах международного, республиканского и региональных уровней:
Всероссийские конференции молодых ученых (Екатеринбург, 2005, 2006, 2008, 2009, 2010); I Съезд физиологов СНГ (Сочи, Дагомыс, 2005); IX Всероссийский популяционный семинар «Особь и популяция - стратегии жизни» (Уфа, 2006); II Международная научно-практическая конференция «Адаптация биологических систем к естественным и экстремальным факторам среды» (Челябинск, 2008); VIII молодежная научная конференция «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике» (Сыктывкар, 2009); Симпозиум «Эколого-физиологические проблемы адаптации» (Москва, 2009); Всероссийская научно-практическая конференция «Экология в высшей школе: синтез науки и образования» (Челябинск, 2009); IV съезд физиологов Урала (Екатеринбург, 2009); XXII Всероссийская ме дико-биологическая конференция молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Санкт-Петербург, 2009). 4 International FESTEM Symposium on Trace Elements and Minerals in Medicine and Biology (St. Petersburg, 2010); Первые Международные Беккеровские чтения (Волгоград, 2010); XXI Съезд Физиологического общества им. И.П.Павлова (Калуга, 2010); XI Международная научно-практическая экологическая конференция «Видовые популяции и сообщества в естественных и антропогенно трансформированных ландшафтах: состояние и методы его диагностики» (Белгород, 2010); Международная конференция «Наука, природа и общество» (Миасс, 2010).
Декларация личного участия автора. Автором самостоятельно собран в полевых условиях и обработан в лаборатории материал по двум подвидам медицинской пиявки: аптечной (Н.т.officinalis) и лечебной (H.m.medicinalis) из природных популяций и выращенных на биофабрике. Определены концентрации микроэлементов: Си, Zn, Mn, Fe, Cd, Pb, Ni, проведён сравнительный анализ содержания заменимых и незаменимых аминокислот в тканях. Проведён эксперимент по исследованию адаптационно-компенсаторных возможностей микроэлементной физиологической системы гомеостаза и фонда свободных аминокислот, определяющих реакцию
организма на аккумуляцию техногенных загрязнителей изменениями в процессах метаболизма.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 работ, в рецензируемых журналах - 6, из которых 3 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 195 страницах и включает введение, 4 главы, заключение, выводы, библиографический список. Работа иллюстрирована 27 рисунками и 33 таблицами. Список используемой литературы включает 305 работ, в том числе 87 работ иностранных авторов.
Благодарности
Выражаю искреннюю благодарность к.б.н. Л.В. Черной, к.х.н. Н.В. Микшевичу, Е.А. Басмаджян, за оказанную помощь при сборе и обработке биологического материала. Искренняя признательность руководителю «Международного центра медицинской пиявки» д.б.н. Г.И. Никонову и директору биофабрики «Гирудо-Мед.Юг» Н.Т. Казиеву за предоставленный материал. Автор считает своим долгом выразить признательность зав. лаборатории Эволюционной экологии д.б.н. А.Г. Васильеву, д.б.н. И.М. Хохуткину, к.б.н. Ю.Л. Вигорову, к.б.н. К.И. Бердюгину, к.б.н. Н.И. Маркову, к.б.н. М.В. Чибиряку, а также всем коллегам и сотрудникам Института экологии растений и животных УрО РАН за участие в обсуждении результатов исследований. Автор признателен к.б.н. Н.В. Николаевой за ценные советы и проявленный ею искренний интерес к настоящим исследованиям.
Автор чрезвычайно признателен академику РАН, д.б.н. В.Н. Большакову за постоянную поддержку и научный интерес к исследуемой проблеме.
Особая благодарность моему научному руководителю д.б.н. Л.А. Ковальчук, которой я глубоко признательна за общее руководство работой, за оказанную повседневную помощь при проведении исследований и обработке полученных результатов, за ценные советы и критические замечания.
Экология и физиология медицинской пиявки Hirudo medicinalis
Обитатели пресных вод - пиявки медицинские Hirudo medicinalis (L. 1758) относятся к типу кольчатые черви {Annelida), подтипу поясковые (Clitellatd), классу пиявки (Hirudinea), подклассу настоящие пиявки (Euhirudined), отряду челюстные пиявки {Gnathobdellea, Arhynchobdellea), семейству челюстные пиявки (Gnathobdellidae) (Слока, 1983; Зоология ..., 2008).
Вид пиявок Hirudo medicinalis — наиболее изученный представитель своего класса. Однако, несмотря на широкое применение медицинских пиявок как «лечебного средства», в мировой литературе нет обобщающих сведений их экологии и физиологического состояния как в естественных условиях при возрастающем влиянии антропогенного фактора на континентальные водоёмы, так и при выращивании на биофабриках.
Морфологические признаки
Медицинские пиявки - это крупные длинные черви. Тело с обоих концов заканчивается присосками, сильно уплощенное, но в результате наполнения кишечника кровью становится в поперечном сечении более округлым.
Величина медицинской пиявки варьирует, но средняя величина взрослых медицинских пиявок составляет в среднем 9,0-12,0 см. Ширина при указанной длине составляет около сантиметра. Однако в литературе упоминается об экземплярах, достигавших при максимальном растяжении 25,0-30,0 см (Стояновский, 2002). Вероятнее всего на величину медицинской пиявки сильное влияние оказывает режим питания. В связи с этим судить по величине пиявок об их возрасте следует с большой осторожностью. Вес пиявок тоже изменчив. Средний вес голодных половозрелых особей равен 2,0-3,0 г, а после насыщения кровью - 10,0-15,0 г. Отдельные экземпляры достигают (до кормления) значительно большей величины — 6,0; 10,0; 12,0; и даже 35,0 г. Гигантский экземпляр Щеголева весил 38,8 г (через месяц после кормления). Точные данные о продолжительности жизни и весе пиявок в природных популяциях отсутствуют. (Лукин, 1976)
Окраска тела Hirudo medicinalis обусловлена пигментными клетками, рассеянными у основания эпителиальных клеток, очень специфична и чрезвычайно сильно варьирует (Стояновский, 2002; Титова, 2002.). По середине спины идут две продольные узкие оранжевые полоски с неровными краями. К наружи от этих полосок с каждой стороны имеется по одной оранжево-черной полоске с явственными пережимами на всем протяжении. Края тела и со спинной, и с брюшной сторон желто-оранжевые. Окраска спины зависит и от среды обитания, может быть коричневой (разных оттенков), рыжеватой, оливково-черной, оливково-зеленоватой, оливково-желтоватой и т.д.
Тело пиявок одето кутикулой, под ней находится эпителий с железами, выделяющими слизь, способствующую передвижению. Плотные покровы и наличие паренхимы защищают тело от пересыхания и позволяют пиявкам длительное время пребывать на суше и совершать сухопутные миграции (Шарова, 2002). Подвижный образ жизни обеспечивается развитой мышечной системой.
Пиявка сосёт кровь с помощью передней присоски. Задняя присоска, предназначенная для фиксации тела довольно велика: ее диаметр больше половины наибольшей ширины тела. (Лукин. 1976). На брюшной стороне тела открываются 17 пар мочевых отверстий. Ближе к переднему краю на брюшке располагаются два половых отверстия: мужское и женское. Кожные покровы с сетью капилляров осуществляют дыхательную функцию (Стояновский, 2002; Титова, 2002). Имеется лакунарная система целомического происхождения, по которой течёт кровеподобная жидкость (Давид, 1990; Титова, 2002; Шарова, 2002).
Для практических целей различают три подвида H.medicinalis . (Каменев, Каменев, 2003; Стояновский, 2002; Лукин, 1977; Щеголев, Фёдорова, 1955; Иогансон, 1935) (рис. 1,2):
1. Аптечная, или аптекарская, медицинская пиявка Hirudo medicinalis officinalis: на спине хорошо развиты оранжевые желтые полоски (с перетяжками), брюхо без темных пятен с двумя широкими черными полосами в виде краевой каймы. Распространена в Молдавии, Краснодарском крае и Армении.
2. Лечебная медицинская пиявка Hirudo medicinalis medicinalis: спинные оранжевые полосы узкие с небольшими черными пятнами, правильно расположеными на этих полосах, брюхо усеяно темными пятнами. Распространена на Украине, но встречается и в других местах.
. Восточная или персидская, медицинская пиявка Hirudo medicinalis oriental is: спина ярко-зеленая, на продольных оранжевых полосах есть четырехугольные темные пятна, брюхо почти сплошь черное. Распространена в Закавказье. Все перечисленные подвиды могут быть использованы с медицинскими целями, хотя возможно, что эффективность гирудина, вырабатываемого ими, различна. (Лукин, 1977)
В своих лабораторных исследованиях Г.Г. Щеголев и М.С.Фёдорова, (1955), Д.Н. Стояновский, (2002), показали, что два подвида медицинских пиявок: лечебная и аптекарская легко скрещиваются и дают потомство, отличающееся большей жизнестойкостью.
Исследователи P. Trontelj et al. (2004), М.Е. Siddall et al. (Diverse molecular ..., 2007), A.S. Laufer et al. (2008), И.П. Баскова и др. (Стероиды ..., 2008), С.Я. Утевский и др. (Chromosome ..., 2009) разделяют вышеуказанные подвиды медицинской пиявки на три вида. Так, Trontelj и др. (2004), используя молекулярные маркерные гены RAPD, продемонстрировали, что H.m.medicinalis и H.m.officinalis — различные виды: Hirudo medicinalis и Hirudo verbana. Различие между Н. medicinalis и H.verbana было подтверждено и исследованиями ядерных микроспутников (Diverse molecular ...,2007).
Имеются данные, что H.orientalis и H.verbana отличаются по видовому составу их симбиотической микробиоты (Laufer et al., 2008). Анализ белка и состав пептида секрета слюнных желез показали различия между Н. medicinalis, H.verbana и H.orientalis, идентично предыдущим молекулярным филогенезам (Стероиды ..., 2008). И, наконец, у всех трех видов обнаружено различное гаплоидное число хромосом: H.medicinalis - 14, H.verbana - 13 и H.orientalis - 12 (Chromosome ..., 2009).
Ареал медицинской пиявки в России и на сопредельных территориях
Изучение географии обитания пиявок имеет, прежде всего, практическое значение, так как существующая в настоящее время технология их разведения в искусственных условиях на биофабриках требует постоянного отлова особей из природных популяций. В нашей стране сохранились естественные водоемы, в которых еще обитает значительное количество этих кровососов. Естественно, что мелиорация и повсеместное загрязнение вод отрицательно сказались на численности пиявок. Поэтому, встают вопросы охраны этих водоемов и регулирование отлова пиявок, который иногда приобретает хищнический характер.
География распространения пиявок на территории России и сопредельных государств изучена недостаточно, хотя к исследованию этого вопроса биологи приступали неоднократно. Последние сообщения на эту тему датируются серединой прошлого века. Наиболее полно освящен этот аспект в монографии Лукина Е.И. (1976).
Более поздние систематические сведения по этой проблеме отсутствуют. В настоящее время имеются лишь отдельные упоминания о встречаемости медицинской пиявки в некоторых регионах России (Кустов, 2003; Михайлов, 2006; Рассадина, 2006; Каменев, 2007; Кадастр..., 2007; Чужекова и др., 2008).
Медицинская пиявка является палеарктическим видом, заселяющим большую часть территории Палеарктики. Существующие сведения о ее численности для некоторых регионов весьма противоречивы, однако общую картину ее распространения составить возможно. В Палеарктике Hirudo medicinalis особенно многочисленна в южных районах. В Европе пиявка встречалась повсюду, вплоть до Дании и южной Швеции (Remy, 1937; Bennike, 1943; Bazyluk, 1957). Особенно многочисленна она была в южной Европе, в странах Пиренейского, Апеннинского и Балканского полуостровов. Достаточно обычна она во Франции, Венгрии, Румынии. Если говорить о странах, лежащих севернее, например Германии, то некоторое время считалось, что она там почти полностью истреблена. Однако, другие исследователи позже полностью опровергли это утверждение, приведя множество точек нахождения медицинской пиявки на территории Германии (Hesse, 1920; Hecht, 1929; Zick, 1931; Dathe, 1934; Herter, 1937), а также в Прибалтийских государствах (Лукин, 1957). Такая же ситуация наблюдалась и в других странах центральной Европы, например, в Польше (Pawlowski, 1936; Sandner, 1951). Можно говорить о повсеместном распространении медицинской пиявки в центральной Европе, где она встречалась довольно спорадично. В северной Африке Hirndo medicinalis встречалась эпизодически (Moquinandon, 1846; Autrum, 1958). Также она немногочисленна и в Средней Азии (Лукин, 1976; Klemm, 1982).
Краткая характеристика основных водоёмов отлова лечебной (H.m.medicinalis) и аптечной (H.m.officinalis) пиявок
Тамбовская область (Мичуринский район, река Лесной Воронеж:) Тамбовская область лежит в южной части Восточно-Европейской равнины, в центральной части Окско-Донской равнины, в зоне лесостепи. Количество осадков в Тамбовской области колеблется не только по годам, но и по сезонам. В среднем на территории области выпадает от 430 до 510 мм осадков в год. В силу своей маловодности, низкой скорости самоочищения реки сильно страдают от хозяйственного воздействия человека.
Мичуринский район расположен в западной части Тамбовской области, Климат умеренно-континентальный, территория района представляет собой равнину, слабо пересеченную долинами рек и балок. Почвенный покров района представлен в основном черноземами, серыми лесными почвами. Типичная равнинная река Лесной Воронеж берет начало у деревни Пушкино Ухоловского района Рязанской области на высоте 152 м над уровнем моря, далее впадает в р. Воронеж, длина которой составляет 520 км. Важнейший водоохранный объект Мичуринска, определяющий качество воды в низовье реки Лесной Воронеж и верховье реки Воронеж -Мичуринские городские очистные сооружения. Очистка сточных вод, содержащих простые и комплексные ионы высокотоксичных тяжелых металлов (Си, Cd, Ni и др.), точнее недоочистка, всегда создавала серьезную экологическую напряженность (Вигдорович, Цыганкова, 1996). Случаи повышенного загрязнения стоков отмечаются периодически и главным образом из-за того, что неэффективно работают локальные очистные сооружения.
Наши исследования проходили на участке с медленным течением реки Лесной Воронеж, расположенном выше г. Мичуринска (30 км), вдали от населенных пунктов, автомобильных и железных дорог (не менее 10 км) (рис.7).
Краснодарский край (Каневской район, река Челбас) Каневской район, на территории которого мы проводили полевые исследования, расположен в северо-западной части Краснодарского края. Через лиманы имеет выход к Азовскому морю. Западная часть района равнинная и включает плавни и озера, а восточная — слегка всхолмлена, изрезана балками, руслами реки Челбас с ее притоками и другими небольшими речками.
Район расположен в зоне умеренно-континентального климата. Безморозный период продолжается 183-195 дней. Самый холодный месяц -январь, самый теплый - июль. Лето жаркое с преобладанием ясной и сухой погоды. Сумма осадков за период активной вегетации составляет 270-300 мм. Осадки летнего периода в условиях высоких температур и низкой относительной влажности (62-65%) усиленно испаряются.
В центральной части района прослеживается хорошо разработанная долина реки Челбас с пологими и сильнопокатыми склонами. В ней явно выражена широкая заболоченная пойма с многочисленными старицами, озерами, плесами. Река относится к категории типичных равнинных степных рек Кубано-Приазовской низменности. Река Челбас - самая большая река Каневского района. Длина реки Челбас 288 км, водосборный бассейн имеет площадь 3950 км2. В настоящее время дно рек Каневского района выстлано гумусированными отложениями мощностью от 30-40 см в верховьях и до 150-200 см в низовьях. На дне реки Челбас накоплен слой ила толщиной 5-7м (Физическая география ..., 2007). На реке Челбас и ее притоках имеется много прудов, частично используемых для орошения, рыболовства и как зоны отдыха. Сильно заросшая камышом, тростником, осокой и заиленная река Челбас является ярким примером реки, находящейся в состоянии «старости» и угасания.
Для отлова аптечных медицинских пиявок нами был выбран участок реки Челбас, расположенный в 10 км восточнее станицы Каневская (рис.8).
Луганская область расположена на востоке Украины, по обе стороны среднего течения реки Северскии Донец. Территория области представляет собой волнистую равнину, которая повышается от долины Северского Донца на север и на юг, где располагается Донецкий кряж. В пойме реки Северскии Донец на левом берегу, на северо-восток от Луганска находится Станично-Луганский филиал Луганского национального заповедника НАН Украины. В его состав входит часть Кондрашевского лесничества с семью пойменными озерами, пригодными для поселения и воспроизведения редчайшего мехового реликтового зверька - выхухоли. Территория заповедника вытянулась узкой полосой, занимая пойму и часть боровой террасы.
Местность характеризуется умеренно континентальным климатом. Здесь длинное солнечное лето и относительно холодная зима с неустановившимся снеговым покровом в январе. Средняя температура в самом теплом месяце июле +20С-+28С, а в самом холодном месяце январе - -6С. Период с температурами выше +10С длится 160-175 дней. Половина осадков выпадает в теплый период года.
Вокруг русла, занимая значительную часть поймы вдоль Северского Донца и вдоль стариц, по берегам озер и в котловинах раскинулись леса из вербы белой и осокоря (тополя черного). Они занимают в заповеднике свыше 10% территории. В переходной зоне к центральной части поймы растут вязовые леса. Далее, в притеррасной части поймы, на илисто-болотистых грунтах, распространены ольховые леса. На заповедной территории Станично-Луганского филиала более всего распространены пойменные дубовые и вязово-дубовые леса. На песчаных холмах боровой террасы в послевоенные годы высажены монокультуры сосны обыкновенной с отдельными экземплярами сосны крымской.
Наши исследования проходили в прибрежной части озера Глубокое, расположенного на территории Луганского заповедника в 500 м от села Станично-Луганское, на границе лесной и лесостепной зон (рис.9).
Содержание свободных аминокислот в тканях лечебной и аптечной пиявок из природных популяций различных географических зон
Аминокислотный фонд тканей медицинских пиявок из различных географических популяций представлен 22 свободными АК. Сравнительный анализ состояния аминокислотного спектра у двух подвидов медицинских пиявок природных популяций Тамбовской области и Краснодарского края показал достоверные различия по суммарным концентрациям АК (4545,97±35,707 мкмоль/л и 6020,57±59,37 мкмоль/л - соответственно при р 0,05). Суммарная концентрация (фонд) свободных аминокислот: в тканях аптечных пиявок выше на 32,4%, чем у лечебных (табл.7).
Следует отметить и достоверные внутривидовые отличия по содержанию в тканях 19 АК у лечебных и аптечных медицинских пиявок. Наблюдается повышенное содержание этих аминокислот у аптечных пиявок в сравнении с лечебными. Лечебные пиявки в отличие от аптечных имеют достоверно повышенное содержание у-аминомасляной кислоты и изолейцина.
Высокое содержание аспарагиновой кислоты, ответственной за детоксикационные процессы, отмечается как у лечебных, так и у аптечных пиявок. Аспарагиновая кислота, максимальные концентрации которой наблюдаются у аптечных пиявок (25,1%), оказывает антигипоксическое действие (Глутаминовая и ..., 1978; Глотов, 1973). Для тканей пиявок обеих подвидов характерны следовые количества таурина и аспарагина. Следовое содержание аргинина отмечается у лечебных пиявок. При сравнительной оценке аминокислотного фонда тканей медицинских пиявок не обнаружено достоверных популяционных различий в содержании аспарагиновой кислоты.
Сравнительный анализ лечебных пиявок из природных популяций Луганской и Тамбовской областей показал географическую изменчивость аминокислотного фонда тканей. При этом суммарные концентрации свободных АК в тканях медицинских пиявок из Луганскойї области (6489,2±54,99 мкмоль/л) почти в полтора раза выше, чем у тамбовских особей (4545,97±35,707 мкмоль/л) (табл.8).
Пул свободных АК пиявок из Луганской области повышен за счет аспарагиновой кислоты, серина, глутаминовой кислоты и глутамина, пролина, глицина, аланина и цистеина. У пиявок, обитающих в Тамбовской области, в больших количествах содержатся глицин, валин, метионин, изолейцин, лейцин, тирозин, орнитин, лизин и гистидин (р 0,05) (табл.8). Для тканей пиявок обеих популяций характерны следовые количества таурина и аспарагина. Достоверных различий по количеству цистеиновои кислоты, валина, лейцина, орнитина и гистидина в тканях пиявок обеих популяций не отмечено (р 0,05). Общий фонд свободных АК у лечебных пиявок увеличен за счёт важнейших заменимых аминокислот: глутаминовой и аспарагиновой кислот, аланина.
На долю глутаминовой кислоты и глутамина приходится 41% от суммарной концентрации всех свободных АК в тканях «луганских» пиявок. Глутаминовая кислота служит предшественником при синтезе белков и других биологически активных соединений и обеспечивает синтез заменимых аминокислот. Она обладает противогипоксическими свойствами, повышая компенсаторные возможности организма, участвует в образовании комплексов металл-белок. Алании является одним из источников глюкозы в организме. Усиленное образование аланина в мышцах и выход его в циркуляцию наблюдается при мышечной деятельности и гипоксии (Западнюк и др, 1982). Особенно высокое содержание аланина в мышцах и плазме отмечено у плавающих и ныряющих животных (Шарманов, Мухамеджанов, 1981) и медицинские пиявки не являются исключением. Содержание аланина в их тканях составляет (12,4-13,6%). Вместе с тем, ткани пиявок, отловленных в Луганской области, содержат более чем в 6,6 раза больше цистеина - аминокислоты, связывающей тяжелые металлы в нетоксичные хелатные комплексы (табл.8).
При оценке состояния свободных АК у пиявок обнаружен дисбаланс заменимых и незаменимых АК, наиболее ярко выраженный у лечебных пиявок из Луганской области (Нохрина, 20106). В тканях пиявок, обитающих в промышленной Луганской области, содержание незаменимых аминокислот составляет всего 8,70%, в то время как у тамбовских особей эти параметры достигают 12,96% от суммарного фонда (табл.9).
В условиях повышенной техногенной нагрузки, в тканях медицинских пиявок на фоне снижения содержания незаменимых аминокислот, происходит количественный рост аминокислотного фонда, обеспечивающий усиление детоксикационных процессов.
Поскольку суммарные концентрации свободных АК в тканях изучаемых групп пиявок достоверно отличаются между собой (р 0,05), в дальнейшем при сравнительном анализе рассматривалось количественное Из рисунка видно, что у всех групп пиявок более 70% от всех АК приходится на аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту и глутамин, аланин. Значительный вклад (12-14%) в суммарный аминокислотный фонд тканей медицинских пиявок вносят серии, глицин и лейцин. Для всех изучаемых групп пиявок характерны достаточно высокое содержание глутаминовой кислоты и глутамина (35-41%) - важнейшей заменимой аминокислоты и ее производной.
Высокий уровень глутаминовой кислоты в тканях пиявок, по-видимому, является благоприятным метаболическим условием, обеспечивающим адекватную субстратную поддержку и регенераторных, и детоксикационных процессов в организме. Она в определенной мере берет на себя биохимические функции аргинина (фактор роста), что представляется важным, прежде всего, для лечебных пиявок, в тканях которых аргинин содержится в следовых количествах. Важна роль аминокислоты и в обезвреживании аммиака, образующегося в процессе жизнедеятельности животных тканей (Ленинджер, 1985).
Аспарагиновая кислота, содержание которой в тканях лечебной пиявки достигает 23%, обладает антитератогенным свойством, снижая токсичность тяжёлых металлов в организме. Эта аминокислота и ее производные снижают уровень аммиака в крови, способствуя нормализации функционального состояния организма при токсических поражениях.
Было отмечено, что в тканях хищных пиявок содержание этой заменимой аминокислоты не превышает 10% от общего фонда (Черная, Ковальчук, 2008). Возможно, аспарагиновая кислота принимает активное участие в процессах консервации крови жертв в кишечнике пиявок-кровососов, что особенно актуально для медицинских пиявок, в тканях которых её содержание достигает 19-25%.
Сравнительный анализ фонда АК у исследуемых подвидов медицинских пиявок показал различие в содержании различных метаболических групп свободных АК. Прежде всего, следует отметить низкий уровень незаменимых аминокислот (НАК) в тканях особей всех групп пиявок (табл.9; рис.16,17). Исследованиями Л.В. Чёрной, Л.А. Ковальчук (2008) показано, что у хищных пиявок исходный уровень незаменимых аминокислот в 1,5-2 раза выше, чем у пиявок-гематофагов.
Вероятно, это связано как с качеством потребляемой пиявками крови, так и с потенциальной способностью кровососущих пиявок к длительному голоданию. Можно предположить, что изначально низкий уровень пула незаменимых аминокислот в тканях пиявок-гематофагов «настраивает» организм на дефицитное поступление этих аминокислот извне в дальнейшем. Падение соотношения незаменимых АК к заменимым АК (НАК/ЗАК) указывает на рост катаболических процессов в тканях пиявок, обитающих в промышленной Луганской области (табл.9).
Сравнительный анализ адаптационно-компенсаторных механизмов микроэлементного обмена и азотистого метаболизма в тканях медицинской пиявки из природных популяций и выращенной на биофабрике
В модельном эксперименте было обнаружено, что пиявки, выращенные на биофабрике, обладают высокой резистентностью к воздействию экстремально высоких концентраций ТМ. В первую очередь следует отметить гибель всех особей из природных популяций в растворах кадмия и смеси тяжелых металлов на третьей неделе эксперимента, в то время как пиявки, выращенные на биофабрике, оставались жизнеспособными.
Обнаружены различия и в характере накопления изучаемых тяжелых металлов тканями пиявок различных опытных групп (Нохрина, Ковальчук, Черная, 2009). Максимальные концентрации меди, кадмия и свинца в тканях пиявок, выращенных на биофабрике, наблюдались на 21-е сутки эксперимента в растворе смеси ТМ (табл.27). При этом, по сравнению с контрольными значениями (табл.28), содержание меди увеличилось в два раза, свинца - в четыре, а кадмия - в двадцать раз(р 0,05).
Больше всего цинка (52,11±3,03 мкг/г, что почти в два раза больше контрольных значений) пиявки с биофабрики накапливали на 14-е сутки в растворе одноименного металла (рис.22, табл.30); (F=24,69; р 0,001). В тканях пиявок из природных популяций максимальные значения биофильного цинка, превышающие контроль в полтора раза, а также ксенобиотика кадмия (в 12,5 раза больше нормы) отмечены на седьмые и четырнадцатые сутки эксперимента для раствора кадмия (F=7,65; р 0,001)(табл.ЗО).
Больше всего меди и свинца пиявки из природных популяций накапливают в растворе смеси ТМ на первом этапе эксперимента на 7-е сутки (р 0,05) (табл.27). При сравнительной оценке аккумуляционных возможностей, показано, что пиявки, выращенные на биофабрике способны депонировать медь и кадмий в больших количествах, нежели особи из природных популяций (табл.27, 28).
По отношению к свинцу пиявки природных популяций и выращенные на биофабрике не показали существенных различий по коэффициентам накопления этого ксенобиотика (табл.29).
В растворах токсичного свинца (0,03 мг/л - 5 ПДК) у пиявок обеих групп наблюдалось значительное накопление этого ксенобиотика в тканях на всем протяжении опыта (табл.29).
По сравнению с контрольными значениями содержание свинца в тканях пиявок повышалось: на седьмые сутки — в 2,9 раза у пиявок с биофабрики и в 1,6 раза у пиявок природных популяций; на 14-е сутки - в 2 раза по отношению к контролю у пиявок с биофабрики и в 2,2 раза у пиявок из природных популяций (рис.23; табл.30).
Зарегистрировано возрастание содержания свинца на 21-е сутки - в 3,2 раза и в 2,5 раза у пиявок с биофабрики и из природных популяций соответственно (р 0,05) (табл.27, 28). Наибольший вклад в дисперсию вносят растворы смеси ТМ при трёхнедельной экспозиции пиявок с биофабрики (F=34,69; р 0,001) и на седьмой день воздействия смеси ТМ на пиявок из природных популяций (F=44,80; р 0,001) (рис.23, табл.30).
У пиявок, выращенных на биофабрике, избыточное присутствие ионов свинца в водной среде усиливало процессы аккумуляции не только одноименного металла, но меди и кадмия на заключительном этапе опыта (р 0,05).
Вероятно, повышенный исходный уровень содержания в тканях меди и кадмия, обусловливающий преадаптацию пиявок выращенных на биофабрике, позволяет им как накапливать эти металлы в больших концентрациях, так и выживать при их перманентном воздействии, активно используя механизмы аккумуляции и элиминации.
Дисперсионный анализ показал, что в опыте наибольшему колебанию подвержены концентрации кадмия в тканях пиявок обеих групп (F=882,94 и F=251,5; р 0,001) (рис.24, табл.30).
Наибольший вклад в дисперсию вносят растворы одноименного металла при двухнедельной экспозиции опытных пиявок обеих групп, а у пиявок с биофабрики - еще и смесь ТМ на заключительном этапе эксперимента (р 0,001) (рис.24, табл.30).
ВЫСОКИЙ уровень дисперсии характерен и для концентраций меди в тканях пиявок из природных популяций (F=l 39,54; р 0,001) (табл.30, рис.25). При этом наибольший вклад в дисперсию вносят ионы меди после 7-го дня экспозиции пиявок природных популяций в смеси ТМ и — на 21-й день экспозиции пиявок с биофабрики (F= 10,99 р 0,001) (рис.25, табл.30).
При изучении влияния экстремально высоких концентраций ТМ на состояние аминокислотного пула пиявок была выявлена четкая тенденция роста суммарных концентраций свободных АК в тканях пиявок обеих групп (Черная, Ковальчук, Нохрина, 2009). При этом в обоих случаях максимальные значения обнаружены на 14-е сутки нахождения пиявок в растворе смеси ТМ. Здесь суммарные концентрации АК превысили контрольные значения в 2,5 раза в тканях пиявок с биофабрики и в 3,6 раза -у пиявок природных популяций (рис.26).
Повышение концентраций пула АК в тканях медицинских пиявок происходит главным образом за счет существенного роста аланина и аспарагиновой кислоты (р 0,05). Кроме того, практически на всех этапах эксперимента отмечено повышение концентраций цистеиновой кислоты, серина, глицина, валина, цистеина, метионина и лизина (р 0,05).
Известно, что у животных в стрессовых условиях, в число которых входит интоксикация тяжелыми металлами, в процессе эволюционного развития выработана способность повышать энергетический обмен, что является их важнейшей предадаптациеи к экстремальным условиям среды (Шварц, 1980).
Поскольку аланин играет ключевую роль в глюконеогенезе и энергетическом гомеостазе, то многократное увеличение его- содержания, наблюдаемое в эксперименте, ожидаемо и подтверждено. Тот же эффект для детоксицирующими и аспарагиновой кислоты обусловлен ее антитератогенными свойствами.
