Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Аналитический обзор литературы по изучаемой проблеме 10
1.1. Биология представителей вида Hirudo medicinalis L. 10
1.1.1. Морфология и физиология 10
1.1.2. Пищеварительная и выделительная системы 13
1.1.3. Нервная система и органы чувств 15
1.1.4. Репродуктивная система и особенности размножения 18
1.2. Экологические особенности вида 21
1.2.1. Характеристика среды обитания 22
1.2.2. Ареал медицинской пиявки в России и на сопредельных территориях 27
1.2.3. Этологические особенности и механизмы поведенческих реакций 28
1.3. Технологии промышленного разведения Hirudo medicinalis 35
1.3.1. Технологические аспекты содержания и кормления 35
1.3.2. Биотехнология размножения пиявок 37
1.4. Значение Hirudo medicinalis для медицины и ветеринарии 39
1.4.1. Характеристика биологически активных веществ, вырабатываемых пиявками 40
1.4.2. Биопрепараты на основе веществ, вырабатываемых организмом медицинской пиявки 43
1.4.3. Применение медицинских пиявок в медицине и ветеринарии 45
Глава 2. Материалы и методы исследования 50
2.1. Характеристика объекта исследования 50
2.2. Технологические приемы кормления и выращивания Hirudo medicinalis в лабораторных условиях 52
2.3. Исследование веществ, выделяемых пиявками в окружающую среду 54
2.3.1. Анализ спектра органических и неорганических метаболитов 54
2.3.2. Исследование аминокислотного состава 54
2.4. Разведение Hirudo medicinalis 55
2.5. Исследование микрофлоры Hirudo medicinalis 57
Глава 3. Результаты исследований и обсуждение 60
3.1. Подбор и оптимизация технологического режима кормления и
содержания Hirudo medicinalis в лабораторных условиях 60
3.1.1. Значимость биотических факторов в биотехнологии разведения пиявок 67
3.1.2. Роль абиотических факторов среды при разведении пиявок 70
3.1.3. Химический состав веществ, выделяемых пиявками в окружающую среду 77
3.2. Размножение медицинских пиявок 91
3.3. Характеристические параметры маток, коконов, нитчаток 97
3.4. Рост нитчаток в зависимости от особенностей кормления 105
3.5. Рост и развитие взрослых медицинских пиявок 112
3.6. Сравнительный анализ внутривидовых различий Н. medicinalis officinalis и Н. medicinalis orientalis при разведении in vitro 116
3.7. Особенность видового состава бактериальной микрофлоры Hirudo medicinalis 121
3.7.1.Микрофлора кишечника 121
3.7.2. Микрофлора кожных покровов 126
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 130
ВЫВОДЫ 137
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 139
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК 140
ПРИЛОЖЕНИЯ
- Биопрепараты на основе веществ, вырабатываемых организмом медицинской пиявки
- Исследование веществ, выделяемых пиявками в окружающую среду
- Значимость биотических факторов в биотехнологии разведения пиявок
Введение к работе
Общая характеристика работы. Диссертационная работа представляет собой законченное научное исследование, содержащее результаты, полученные автором в процессе выполнения плановых научных исследований кафедры биологии, генетики, паразитологии и экологии ФГОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия» (по теме № 01.200.203527) в период с 2002 по 2005 годы.
По характеру изучаемых явлений диссертация относится к области биотехнологии разведения животных и экологии. Работа сочетает теоретические и практические аспекты решения проблемы разработки оптимальной по срокам и экологическим параметрам биотехнологии разведения медицинских пиявок в лабораторных условиях.
Актуальность темы. В настоящее время медицинские пиявки широко используются для лечения человека и сельскохозяйственных животных, сформировалась самостоятельная область медицины — гирудотерапия, которая успешно развивается (Жаров Д.Г., 2003).
Организм медицинской пиявки - это, по сути, естественная биофабрика по производству целого комплекса уникальных биологически активных веществ, в которых остро нуждаются современная медицина и ветеринария — это гирудин, эглины, бделлины, гементин, брадикинины. Организм медицинской пиявки также вырабатывает широкий спектр ферментов: гиалуронидазу, дестабилазу, оргелазу, коллагеназу, апиразу, эластазу, триглицеридазу. Все эти вещества являются биологически активными субстанциями естественного происхождения. Их значимость для медицины и ветеринарии трудно переоценить (Никонов Г.И., Баскова И.П., 1986; Бас-кова И.П., Завалова Л.Л., 1998; Никонов Г.И., 1998; Савинов В.А., Чистов А.В.,2001).
Видовые особенности Н. medicinalis настолько уникальны, что для извлечения из организма пиявки всего комплекса биологически активных
6 веществ не требуется затрат на выделение, очистку, фасовку, доставку и сами средства введения. По биологической сущности пиявки являются кровососущими эктопаразитами, и все биологически активные вещества самопроизвольно впрыскиваются в организм больного при кровоизвлече-нии. Это позволяет рассматривать медицинскую пиявку как идеальный инструмент решения широкого спектра эндоэкологических проблем больного человека или животного (Савинов В.А., Кудинов В.Г. и др., 1994; Селезнев К.Г., 2003; Геращенко Л.Л., 2004).
С точки зрения экологии, пиявки являются редким исчезающим видом, занесенным в Красную книгу (RED DATA BOOK, 1983). Вылов медицинских пиявок из естественных водоемов запрещен.
В XXI веке потребности медицины и ветеринарии в биологически активных субстанциях естественного происхождения будут нарастать, соответственно будут возрастать потребности в медицинских пиявках (Бас-кова И.П., 2001; Никонов Г.И., Латрилль Ж., 2002).
В Российской Федерации природные ресурсы медицинской пиявки также практически исчерпаны и для медицины и ветеринарии используют пиявок, выращенных на биофабриках, которых на территории РФ всего три. Особенности технологий разведения медицинских пиявок представляют коммерческую тайну и в литературных источниках не публикуются. Биофабрики торгуют только сертифицированными взрослыми пиявками, поэтому получить для исследовательских целей пиявок на разных стадиях онтогенеза с биофабрик невозможно. При отсутствии медицинских пиявок в естественной природной среде остается единственная возможность разработать собственную биотехнологию разведения пиявок (для целей НИР) в лабораторных условиях.
Цель и задачи исследования.
Цель работы - разработать ускоренную биотехнологию лабораторного разведения Н. medicinalis, основанную на биологических и экологических особенностях вида.
В соответствии с этой целью решались следующие задачи:
подбор и оптимизация технологических режимов содержания и кормления пиявок в лабораторных условиях;
оценка роли биотических и абиотических факторов среды в биотехнологии разведения Н. medicinalis;
характеристика веществ, выделяемых Н. medicinalis в окружающую среду;
подбор и оптимизация технологических режимов для полной реализации репродуктивного потенциала пиявок;
сравнительный анализ внутривидовых различий подвидов Н. medicinalis officinalis и Н. medicinalis orientalis;
характеристика особенностей экзогенной и эндогенной микрофлоры медицинских пиявок, выращенных в лабораторных условиях.
На защиту выносится:
полный биотехнологический цикл ускоренного разведения медицинских пиявок в лабораторных условиях;
экологически обоснованные оптимумы технологических режимов разведения, выращивания и предреализационного хранения пиявок;
потребительская ценность вод, обработанных пиявками;
характеристика эндогенной и экзогенной бактериальной микрофлоры медицинских пиявок.
Научная новизна. Разработан ускоренный биотехнологический цикл разведения медицинских пиявок для целей НИР в лабораторных условиях. Подобраны оптимальные температурные режимы выращивания, размножения и хранения пиявок.
Установлено, что вода, обработанная пиявками, представляет потребительскую ценность, поскольку содержит широкий комплекс биологически активных веществ; не является токсичной, что подтверждено тестиро-
ванием на белых мышах, не содержит патогенной микрофлоры, что подтверждено бактериологическими посевами.
Установлено, что для технологии лабораторного разведения наиболее подходит по своим технологическим характеристикам пиявка подвида аптекарская (Н. т. officinalis).
Выделена и охарактеризована эндогенная и экзогенная бактериальная микрофлора медицинской пиявки, исследован химический состав веществ, выделяемых пиявками в окружающую среду.
Практическая значимость. Разработана биотехнология ускоренного разведения медицинских пиявок в лабораторных условиях, она внедрена в Ульяновской сельскохозяйственной академии. По этой технологии получены первые 800 особей, давших полноценное потомство, не уступающее по своим свойствам пиявкам, выращенным на биофабриках и в природной среде (См. табл. 16). Выявлен наиболее эффективный для разведения и практического использования подвид медицинской пиявки - Н. т. officinalis, поскольку его потребительские характеристики: скорость присасывания, количество поглощенной крови, уровень смертности превосходят таковые у Н. т. orientalis.
Разработанная биотехнология разведения пиявок в лабораторных условиях делает доступными для изучения все стадии онтогенеза этого вида и позволяет получать необходимый экспериментальный материал для научно-исследовательских и учебных целей.
Апробация результатов научных исследований. Материалы исследований были представлены и обсуждались на конференциях различных уровней, в том числе на Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Региональные проблемы народного хозяйства» (Ульяновск, ФГОУ ВПО «УГСХА», 2004), на Всероссийской научно-практической конференции «Современное развитие АПК: региональный опыт, проблемы, перспективы» (Ульяновск, ФГОУ ВПО «УГСХА», 2005). Результаты научно-исследовательской работы обсуждались на межвузов-
ских научных семинарах кафедры биологии, ветеринарной генетики, паразитологии и экологии ФГОУ ВПО «УГСХА» и кафедры биоэкологии ГОУ ВПО «УлГУ» (2004, 2005).
Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано семь работ.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 170 страницах, включает 23 таблицы, 22 рисунка, шесть фотографий. Состоит из введения, обзора литературы по изучаемой проблеме, описания объектов, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических предложений, библиографического списка и приложений. Библиография включает 346 наименований, в том числе 83 на иностранных языках.
Биопрепараты на основе веществ, вырабатываемых организмом медицинской пиявки
Высокоэффективные соединения, обладающие фибринолитическими свойствами, входят в состав секретов кровососущих животных (насекомых, клещей, червей, млекопитающих) (Баскова И.П., 1995). Их способ питания кровью требует активного вмешательства в регуляторную систему гемостаза и фибринолиза хозяина. Эволюционно отработанный механизм действия этих агентов представляет оптимальный путь ингибирования тромбообразования. Вещества, вырабатываемые пиявками, в первую очередь являются высокоэффективными коагулянтами, блокирующими различные стадии гемостаза (гирудин), другие стимулируют процесс фибри-нолиза (гементин, дестабилаза) (Баскова И.П., 1988).
В настоящее время ведется активная научная работа по созданию новых форм лекарственных средств на основе медицинских пиявок и секрета слюнных желез медицинской пиявки (Гурин И.С., Ажгихин И.С., 1981;Никонов Г.И., Голиков А.А., 1993; Федоров Т.В., 2000; Deitcher S.R., 2003).
Из пиявок получают препарат - гирудин. Препараты гирудина не токсичны. При внутривенном или подкожном введении растворов гирудина в дозах, значительно превышающих терапевтические, никаких местных или общих явлений отравления не наблюдается (Хомяков Ю.Н., 2000).
Одним из первых препаратов, полученных из медицинских пиявок, был «Пиявит». Способ получения этого тромболитического препарата был разработан Г.И. Никоновым в 1992 г., им же была исследована биологическая активность и фармакологические свойства этого препарата. Применяется «Пиявит» в основном для лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы, тромбофлебитов, варикозного расширения вен, а также для укрепления иммунитета (Березовская И.В., Рымарцев В.И. и др., 2003; Кудрина Г.П., Гиевковская Т.В., 2003).
Позднее был создан гель «Гирудо», содержащий биоактивный комплекс медицинской пиявки. Благодаря данному комплексу гель обеспечивает эффективное противовоспалительное, ранозаживляющее, противоожоговое, биоэнергетическое действие, устраняет раздражения кожи, гематомы и отеки, улучшает микроциркуляцию крови, лимфоотток, стимулирует обменные процессы в коже. Применяется в профилактике геморроя, снижает интенсивность болевого синдрома при ушибах, растяжениях связок, переломах и головных болях (Никонов Г.И., 2002). В 1994 г. Г.И. Никоновым и К.Г. Селезневым был создан первый косметический крем на основе пиявок «Антония». В 1997 г. Г.И. Никоновым и J. Latrille были созданы первые препараты антистресссорного биоэнергетического действия - таблетки для ванн «Relax» и «Tonus». А в 2000 г. коллективом Международного центра медицинской пиявки была разработана серия косметических средств на основе экстракта пиявки и других природных компонентов - «Dr. Nikonov» (Геращенко Л.Л., Никонов Г.И., 2004).
Пиявки свыше 30 веков используются в практической медицине и ветеринарии при лечении широкого спектра заболеваний.
Первые сведения об использовании пиявок относятся к древнему Египту. Применялись они в древней Индии, Греции, Риме и других странах. Об этом свидетельствуют труды Клавдия, Галена, Плиния, таджикского ученого и врача Авиценны (Кулик P.M., 2001; Сулим Н.И., 2003).
Особенно широкое распространение гирудотерапия получила в конце XVIII и в первой половине XIX века. Причем, пиявок применяли не только для лечения, но и для профилактики ряда заболеваний. Интересен тот факт, что приставление пиявок преследовало и косметические цели (Сулим Н.И., 2003).
Медицинских пиявок в своей врачебной практике с успехом применяли известные русские врачи Н.И. Пирогов и А.С. Залманов (1966). С появлением средств медикаментозного лечения медицинская пиявка отступила на второй план. В конце XX века, наряду с новейшими технологиями, медицинская пиявка вновь становится популярной. Т.к. широкомасштабное применение синтетических лекарственных препаратов вызывало всевозможные отрицательные побочные эффекты. При постановке пиявок лечебное воздействие осуществляется на нескольких уровнях. Кроме того, что пиявки излечивают конкретное заболевание, они еще оказывают общеукрепляющее воздействие на организм в целом. Улучшается сон, аппетит, повышается настроение, а на глубинном уровне - пиявки нормализуют обмен веществ, активизируют иммунную систему (Гробов О.Ф., 1978; Корпачев В.В., 1989; Любецкий А.Е., 1997; Гладкий Т.В., Тихоход Л.В. и др., 2001; Никонов Г.И., 2002).
Натуротерапия, одним из видов которой является гирудотерапия, предупреждает многие болезни, воздействуя на организм природно-естественными средствами. А они, как правило, экономичны, применимы в домашних условиях и безвредны для организма (Куликов И.П., Никонов Г.И.,2001).
Биологически активные вещества, продуцируемые медицинскими пиявками, обеспечивают противотромботическое действие и препятствие тромбообразованию (Баскова И.П., Никонов Г.И., Юсупова Г.И., 1984; Баскова И.П., Халиль С, Никонов Г.И., 1984; Халиль СИ., 1987; Хомяков Ю.Н., Хомякова Т.И. и др., 2001; Connor N.P., Conforti M.L., Heisey D.M. et al., 2002), тромболитическое действие (Скопиченко Н.Ф., 1966; Баскова И.П., Никонов Г.И., 1985; 1991), гипотензивное действие (Баскова И.П., Никонов Г.И., 1987), репаративное воздействие на поврежденную стенку кровеносного сосуда (Никонов Г.И., 1992), антиатерогенное действие (биологически активные вещества снижают уровень холестерина и триг-лицеридов в крови, обеспечивают регресс атероматозных бляшек) (Баскова И.П., Никонов Г.И., Долгов В.В. и др., 1989; Никонов Г.И., Романенко Е.Б., Ванюшин Б.Ф. и др., 1990; Никонов Г.И., 1992; Григорян С.С., Соколова И.А., Шахназаров А.А. и др., 1995), антигипоксическое действие (повышение процента выживаемости в условиях пониженного содержания кислорода) (Никонов Г.И., Баскова И.П., 1986), иммуностимулирующее действие (Баскова И.П., Никонов Г.И., Миркамалова Э.Г. и др., 1988; Савинов В.А., 1993; Тихоненко О.А., 2000; Савинов В.А., 2002а), аналгезирующее действие (обезболивание происходит, как в месте постановки пиявок, так и общеорганного действия (Мигаль В.М., 1999; Никонов Г.И., Латрилль Ж., 2002), противоишемическое действие (Савинов В.А., Кудинов В.Г., Сидоренко А.П., 1994).
И.А. Панкова (2002) выделяет еще несколько аспектов действия медицинской пиявки на организм человека: противоишемическое, противо-отечное, дренирующее, восстановление микроциркуляции, восстановление нервно - мышечной передачи импульсов, общее рефлекторное и бактерио-статическое действие.
Исследование веществ, выделяемых пиявками в окружающую среду
Для спаривания медицинских пиявок их рассаживали попарно непосредственно после принятия пищи. В опыте участвовало 38 особей. В голодном состоянии пиявки весили 2-3 г, а после кормления - 10-15 г. Использовали стеклянные банки емкостью 800-1000 см3 на три четверти заполненные водой. В них пиявок оставляли на один-два месяца для оплодотворения.
При подборе субстрата для откладки коконов были приготовлены аквариумы с различными наполнителями, в которые рассаживались пиявки после периода совокупления. Из литературных источников известно, что в естественных условиях пиявки откладывают коконы в берега с мягкой торфяной или глинистой почвой без камней, причем коконы пиявки откладывают под дерном в проделываемых ими ходах (Синева М.В., 1949; Ще-голев Г.Г., Федорова М.С., 1955; Лукин Е.И., 1977; Никонов Г.И., 1998; Стояновский Д.Н., 2002). Основываясь на биологии вида, в качестве субстратов для откладки коконов использовались красная глина, речной песок и торф. Субстраты подвергали термической обработке при температуре 250С и только после этого ими заполняли стеклянные аквариумы из расчета 200-300 г почвы на одну пиявку. Поверх субстратов накладывали слой листового мха. Использовались аквариумы объемом 10000 см . В каждый аквариум помещалось по четыре пиявки. Затем в аквариум заливалась вода так, чтобы субстрат был полностью пропитан водой, но над его поверхностью воды не было. При меньшем количестве воды верхние слои почвы бывают очень сухими, и пиявки откладывают коконы только на самом дне; наоборот, при большем количестве воды, когда она стоит над поверхностью субстрата, пиявки откладывают коконы на поверхности дерна или листового мха. В этом случае коконы могут пересыхать. При неправильной закладке аквариума коконов откладывается значительно меньше.
Аквариумы сверху покрывали марлей в два слоя, обвязывали шпагатом или шнуром и закрывали стеклом для сохранения влаги. Вся зарядка аквариумов производилась за три-пять дней до посадки пиявок, чтобы ризоиды мха успели частично проникнуть и закрепиться в субстрате.
Всего было поставлено девять аквариумов, по три с каждым из субстратов. Для откладки коконов пиявки содержались в аквариумах полтора-два месяца при постоянной температуре 23-25С.
Зародышевое развитие медицинской пиявки продолжается в течение месяца и протекает в коконе. Во время этого периода коконы оставались в аквариумах. Затем коконы вынимались из маточников.
Для оптимизации условий, необходимых и достаточных для выхода пиявок из коконов, использовали емкости с разными субстратами. В качестве субстратов для выведения нитчаток использовались вода, торф, песок, глина. В каждую емкость помещалось по четыре кокона с пиявками, готовыми к вылуплению. Готовность к выходу из кокона и окончание зародышевого развития определялись по положению пиявок-нитчаток в коконе. Когда пиявки готовы к выходу из кокона, они располагаются в одной его стороне в виде темного, почти черного клубка, видимого при просмотре кокона через проходящий свет.
Каждый субстрат проходил апробацию в трех повторностях. Изучали выход нитчаток при температуре 20-22С; 23-25С и 26-28С.
Для исследования микрофлоры использовали десять медицинских пиявок в возрасте 1 года и 3 месяцев, со средним весом - 7,65 г.
Пиявку, максимально растянув в длину, закрепляли препаровальными иглами. Накладывали лигатуры на тот участок, откуда предполагалось взятие образца.
Для взятия проб из кишечника медицинской пиявки наружную поверхность ее перед взятием образца стерилизовали: сначала протирали 70% спиртом, затем прижигали раскаленным над спиртовкой скальпелем. Стерильным скальпелем делали надрез покрова пиявки и микробиологической петлей производили посев содержимого кишечника пиявки на чашки Петри с питательной средой. Через 18-24 ч инкубации при температуре 37-37,5С наблюдали рост изолированных колоний выделенной культуры. Контрольные пробы с простерилизованных наружных покровов пиявок, рост микроорганизмов не обнаружили.
Для исследования экзогенной микрофлоры пиявок стерильной микробиологической петлей брались образцы поверхностной слизи медицинской пиявки. Производился посев на чашки Петри с питательной средой. Затем проводилась 18-24 часовая инкубация в термостате при температуре 37-37,5С, после чего наблюдали рост изолированных колоний выделенной культуры.
В качестве плотных питательных сред были использованы среда МПА для определения общего числа аэробных бактерий, среда Эндо для определения энтеробактерий, в качестве жидкой питательной среды был использован МПБ (См. рис. 2).
Для получения чистой культуры изолированные колонии, выросшие при первичном посеве, пересевали повторно на плотные питательные среды по Дригальскому, или в жидкие - методом серийных разведений по стандартным методикам (Егоров Н.С., 1976; Ежов Г.И., 1981; Теппер Е.З., 1993). Определение количества микробов проводили путем подсчета колоний на средах в наименьших разведениях и соответственного пересчета. Окончательное заключение о чистоте культуры принималось после просмотра мазка, окрашенного по Грамму.
Родовую и видовую идентификацию проводили в соответствии с общепринятыми методами и дифференциальными схемами. Изучалась морфология клеток, расположение их относительно друг друга, размер, наличие капсулы, подвижность и характер движения. Исследовались тинкто-риальные (окраска по Грамму), биохимические (способность окислять или сбраживать углеводы и многоатомные спирты, образовывать ферменты и конечные продукты) свойства, используя определитель М.А. Сидорова с соавторами (1995) и Берджи (1997), а также монографию В.И. Покровского (1999).
Материалы собственных исследований обрабатывались на персональном компьютере с использованием компьютерной программы Microsoft Excel ХР for Windows ХР.
Значимость биотических факторов в биотехнологии разведения пиявок
На данном этапе исследования изучался комплекс характеристических параметров - биотических факторов при разной плотности популяции Н. medicinalis (табл. 3). Биотические факторы выражаются во взаимодействия организмов между собой в популяциях, сообществах и т.п. Нами изучалось групповое поведение пиявок в искусственно созданном сообществе при содержании в лабораторных условиях.
По данным отдельных литературных источников, в стеклянных со-судах объемом 3000 см можно содержать до 50 пиявок (Каменев Ю.Я., 2003; Стояновский Д.К., 2002; Никонов Г.И., 1998). В ходе наших исследований было показано, что такая плотность посадки допустима только в случае молодых и голодных пиявок, чьи размеры и масса еще достаточно малы. Нами было установлено, что при помещении в сосуд объемом 3000 см тридцати и более особей, отчетливо проявляется угнетение их жизнедеятельности: пиявки без явных на то причин выпускали кровь, слизь и другие продукты жизнедеятельности в большом количестве. Вода в сосуде приобретала желто-зеленый, палевый цвет, а поведение пиявок становилось агрессивным, активизировался каннибализм. Так проявлялся эффект перенаселенности, когда происходило отравление пиявок собственными метаболитами из-за большой скученности.
По результатам наших исследований, пиявки, содержавшиеся в количестве 20 и 25 особей, не проявляли агрессивного поведения, а их масса после кормления была в 1,5-1,6 раза выше, чем у пиявок, содержавшихся по 30 и 35 особей (р 0,05). У пиявок, содержавшихся по 20 и 25 особей, количество поглощенной крови после кормлений было в 2,3-3,9 раза выше, чем у пиявок, содержавшихся по 30 и 35 особей (р 0,05).
Каннибализм (как проявление агрессивного поведения) активировался при высокой плотности посадки. Он постоянно отмечался у мелких пиявок и отчетливо проявлялся не только при групповом кормлении, но и в период между кормлениями. При высокой плотности посадки мелкие пиявки без видимых причин нападали на крупную, заедая ее иногда до гибели. Эти результаты согласуются с данными М.В. Синевой (1944), Г.Г. Ще-голева, М.С. Федоровой (1955), Г.И. Никонова (1998).
Было установлено, что явление каннибализма отмечалось в группах с плотностью посадки 30-35 особей и более. При этой плотности посадки в ходе первого кормления было искусано 10% особей. Доля гибели составила 1%. Пиявок-агрессоров было 18%. На жертву нападали, как правило, сразу несколько пиявок (две-три). Агрессоры были гораздо меньшего размера, чем их жертвы. При повторном кормлении от укусов пострадало 2% особей, а доля агрессоров составила 5%. Чтобы укусы не нанесли существенного вреда пострадавшим пиявкам, агрессоры были своевременно удалены.
Таким образом, нами было установлено, что при содержании пиявок в лабораторных условиях при высокой плотности посадки (30-35 особей в объеме 3000 см3) проявлялось угнетение жизнедеятельности пиявок, отравление метаболитами, провоцировавшее развитие агрессии. По результатам проведенных исследований, нецелесообразно содержать пиявок после кормления более чем по 20 особей на один сосуд объемом 3000 см3 или суммарная масса пиявок не должна превышать 91,4-100 г в объеме 3000 см3.
В итоге следует отметить, что голодным или полуголодным маленьким неполовозрелым пиявкам свойственен каннибализм. Наиболее вероятно проявление каннибализма после длительного периода голодания, когда пиявка истощена и ее энергетических ресурсов явно недостаточно, чтобы прокусить толстую кожу млекопитающих и, работая как мощный насос, накачать кровь в желудок. Чем большее количество раз и с наименьшим временным интервалом накормлена пиявка, тем меньше вероятность проявления каннибализма.
Нами было установлено, что для предотвращения каннибализма необходимо неполовозрелых пиявок кормить не реже раза в месяц, а после кормления распределять их по разным емкостям с водой, учитывая плотность посадки, степень насыщения, количество и общую биомассу пиявок в сосуде.
Важнейшими абиотическими факторами, влияющими на жизнедеятельность пиявок, являются влажность, температура среды обитания, свет.
Влажность. Пиявки обитают только в водной среде. При транспортировке несколько суток пиявки способны сохранять жизнеспособность во влажном торфе. Для нормальной же жизнедеятельности пиявкам необходима полноценная водная среда. В лабораторных условиях мы использовали отстоянную в течение суток водопроводную воду, т.к. по данным Г.Г. Щеголева, М.С. Федоровой (1955), Г.И. Никонова (1998), Д.К. Стояновско-го, (2002) кипяченая, талая, колодезная вода и вода из природных водоемов являются неприемлемыми для пиявок. Свет. На переднем конце тела пиявок расположены пять пар глаз. Под кожей в паренхиме помещается глазной бокал, окруженной снаружи скоплением черного пигмента. Бокал состоит из крупных клеток с округлой светлой вакуолью в цитоплазме. Основание бокала содержит пучок нервных волокон, которые перед вступлением в бокал окружены большой группой нервных клеток - зрительным ганглием. В бокале нервный пучок образует осевой стержень. От него отходят волокна, вступающие в связь со светочувствительными клетками. Зрительная функция таких глаз ограничена и сводится только к различению света и тьмы.
Пиявки реагируют на свет, при замене полной темноты солнечным светом усиливается их двигательная активность. Однако, влияния на половое поведение или процесс откладки коконов, который происходит в прибрежной почве водоемов в полной темноте, свет не оказывает (Лукин Е.И., 1976; Никонов Г.И., 1998).
Нами исследовались медицинские пиявки разновозрастных групп (взрослые особи и нитчатки) по их отношению к свету. И взрослые пиявки, и нитчатки подразделялись на три группы: первая группа содержалась при круглосуточном освещении, вторая в полной темноте, третья в условиях естественного светового дня. В каждой группе взрослых пиявок было по 30 особей, а нитчаток - по 70 особей. Результаты исследований приведены в таблицах 4 и 5.
Было установлено, что взрослые пиявки в условиях естественного освещения практически не выделяли метаболитов, за исключением небольшого количества слизи. В среднем, количество особей, находившихся на стенках сосуда, составляло 50,76+3,09%, на дне емкости - 49,24±2,71%. Дыхательные, плавательные движения пиявки не совершали.
