Введение к работе
Актуальность темы. В ходе онтогенеза растительные организмы испытывают воздействие комплекса абиотических и биотических факторов среды, но их относительное значение неодинаково. Часто один какой-либо фактор является лимитирующим, оказывающим настолько мощное воздействие на растение, что влиянием других факторов можно пренебречь.
Изучение влияния внешних факторов имеет важное значение в вопросах интродукции и селекции растений. Особое место в этом вопросе занимает изучение влияния комплекса абиотических и биотических факторов среды на репродуктивный процесс растений, т.к. именно репродуктивный процесс предопределяет возможность дальнейшей селекции интродуцируемых растений.
Облепиха крушиновидная (Hippophae rhamnoides L.) является относительно недавно интродуцированной культурой. Известно, что ее природные популяции занимают большие площади на территории России и стран бывшего СССР. В границах ареала H. rhamnoides сформировались надёжно изолированные и хорошо оформленные экотипы и более мелкие внутривидовые таксоны – климатипы (Елисеев, 1974; A. Rousi, 1989; Бессчётнов, Кентбаев, 2003), среди которых наибольшее значение в селекции мужских и женских растений облепихи получили прибалтийский и катунский экотипы. В связи с этим широко изучена экология облепихи: климатические (Бородина, 1982; Корзинников и др.,1983; Игошина и др., 1985; Авдеев, 1991; Созонова, 1991; Ли Минь, Жанг Ли, 1993) и эдафические условия произрастания (Ермаков и др., 1979; Бессчётнов, 1975; Елисеев, 1975; Junnila, Hiirsalmi, 1989). Полученные данные указывают на то, что основным лимитирующим фактором интродукции облепихи, является температурный режим зимне-весеннего периода.
Изучению зимостойкости облепихи в условиях Нижегородской области посвящены работы М.А. Коровиной (2000), В.В. Селехова (2000), М.П. Смертина (2006). Установлено, что к неблагоприятным условиям зимне-весеннего периода наиболее чувствительна мужская генеративная сфера H. rhamnoides. Однако данные о влиянии температурного режима на начальные этапы репродуктивного процесса мужских растений облепихи крушиновидной отсутствуют, а они, несомненно, имеют значение для селекционного процесса и дополнят эколого-биологическую характеристику вида.
В настоящее время изучен микроспорогенез у облепихи и дана характеристика его этапов (Кондорская, 1967, 1973; Камелина, Проскурина, 1987), но нет данных о влиянии температурного режима на ход микроспорогенеза. В литературе практически отсутствуют данные о качественных показателях пыльцы и мало изучена прогамная фаза оплодотворения у облепихи крушиновидной. Отсутствует анализ мужских гибридов H. rhamnoides разного эколого-географического происхождения с точки зрения репродуктивного процесса, который необходим в генетико-селекционной работе и подборе опылителей при посадках.
Всё вышеизложенное определило актуальность поставленной цели.
Цель работы. Установить основные температурные закономерности микроспорогенеза, определить качество продуцируемой пыльцы и выявить особенности внутривидового взаимодействия (скрещивания) гибридов H. rhamnoides разного эколого-географического происхождения.
Согласно поставленной цели были определены следующие задачи:
выявить зависимость наступления этапов микроспорогенеза от температурного режима (суммы положительных температур);
проанализировать влияние погодных условий на морфометрические показатели пыльцы гибридов H. rhamnoides;
провести сравнительное изучение показателей качества (содержание пролина, крахмала и др.) зрелой пыльцы гибридов H. rhamnoides;
изучить динамику прорастания и роста пыльцевых трубок in vitro у ряда перспективных селекционных гибридов H. rhamnoides;
изучить начальные этапы прогамной фазы оплодотворения при внутривидовом взаимодействии (скрещивании) гибридов H. rhamnoides разного эколого-географического происхождения.
Научная новизна. Впервые проведено сравнительное изучение развития мужского гаметофита гибридов H. rhamnoides разного эколого-географического происхождения, – установлены суммы положительных температур, определяющие начало отдельных этапов микроспорогенеза, – проведен сравнительный анализ морфометрических показателей и показателей качества (содержание пролина, крахмала и др.) зрелой пыльцы гибридов H. rhamnoides разного эколого-географического происхождения. Впервые изучена динамика прорастания и роста пыльцевых трубок in vitro у ряда перспективных селекционных гибридов H. rhamnoides и внутривидовое взаимодействие (скрещивание) гибридов H. rhamnoides разного эколого-географического происхождения.
Теоретическая значимость работы. Полученные результаты дополняют уже существующие данные по экологии и биологии репродуктивного процесса H. rhamnoides, вносят значительный вклад в критерии селекционного отбора мужских гибридов облепихи. Установлено, что начало микроспорогенеза обусловлено эколого-географическим происхождением гибрида. У мужских растений с преобладанием морфофизиологических признаков катунского экотипа микроспорогенез начинается при более низкой сумме положительных температур, чем у гибридов – прибалтийского экотипа. Показано, что стабильный температурный режим в период формирования мужского гаметофита облепихи способствует формированию пыльцы с высокой жизнеспособностью. Установлено, что пыльца гибридов, имеющих сходное эколого-географическое происхождение, по-разному прорастает на рыльцах пестиков определённых женских гибридов.
Практическая значимость работы. В работе представлена селекционная характеристика мужских гибридов по показателям качества пыльцы. На основе показателей качества пыльцы отобран один адаптивный к условиям Нечерноземной зоны мужской гибрид облепихи. Среди изученных мужских растений выделены гибриды, отличающиеся более интенсивным прорастанием и ростом пыльцевых трубок. Проведена селекционная оценка комбинаций скрещивания гибридов по прогамной фазе оплодотворения и выделены наиболее удачные пары гибридов.
Апробация работы. Результаты исследований были представлены на международной научно-практической конференции «Вклад молодых ученых в развитие аграрной науки ХХI века» (Рязань, 2004), научно-практической конференции «Актуальные проблемы лесного хозяйства Поволжья» (Н. Новгород, 2004), на научно-практической конференции сотрудников и аспирантов Нижегородской сельскохозяйственной академии (Н. Новгород, 2005), на I (IX) международной конференции молодых ботаников в Санкт–Петербурге (Санкт–Петербург, 2006), на всероссийской научно-практической конференции, посвящённой 75-летию со дня открытия Чувашской сельскохозяйственной академии (Чебоксары, 2006), на международной научной конференции «Научные основы системы земледелия и их совершенствование» (Н. Новгород, 2007), на заседании Нижегородского отделения Русского ботанического общества РАН (Н. Новгород, 2007).
Публикация результатов исследования. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе одна в издании, рекомендованном ВАК.
Декларация личного участия автора. При выполнении диссертационной работы были использованы материалы, полученные в условиях полевых и лабораторных опытов, выполненных в 2004–2007 гг. За годы исследования было проанализировано 40 мужских растений, по 5 экземпляров каждого гибрида. При определении морфологических показателей пыльцы измерено 1440 пыльцевых зерен. При определении показателей качества пыльцы смонтировано 720 временных препаратов и проведена оценка 72000 пыльцевых зерен. Для оценки динамики жизнеспособности пыльцы было проанализировано 504 тысячи пыльцевых зерен, а для определения динамики роста пыльцевых трубок проведено 16800 измерений. При изучении прогамной фазы оплодотворения проанализировано 56 комбинаций скрещивания, смонтировано и просмотрено 2520 давленых препаратов. Доля личного участия автора в подготовке и написании публикаций составляет 75%.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Начальные этапы микроспорогенеза у гибридов с преобладанием морфофизиологических признаков катунского экотипа протекают при более низкой сумме положительных температур, чем у гибридов с преобладанием морфофизиологических признаков прибалтийского экотипа.
-
Морфометрические показатели пыльцы H. rhamnoides зависят от эколого-географического происхождения гибридов и в большей степени – от экологических (погодных) условий в период формирования мужского гаметофита.
-
Все изученные гибриды H. rhamnoides можно разделить по динамике прорастания и роста пыльцевых трубок in vitro на две группы, включающие в себя мужские растения разного эколого-географического происхождения.
-
Селекция мужских растений H. rhamnoides должна основываться, наряду с хозяйственно ценными признаками, и на показателях качества пыльцы, а оценка комбинаций скрещивания – на прогамной фазе оплодотворения.
Объём и структура работы. Диссертация изложена на 181 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания условий, объектов и методов исследований, собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и приложения. Работа проиллюстрирована 35 рисунками, 10 таблицами и 16 приложениями. Список литературы включает 242 источника.
Сокращения, используемые в работе.
ПЗ – пыльцевое зерно; ПТ – пыльцевая трубка, СДГ – сукцинатдегидрогеназа.
ГЛАВА 1. ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РЕПРОДУКТИВНОГО ПРОЦЕССА ПОКРЫТОСЕМЕННЫХ РАСТЕНИЙ
Глава представляет собой обзор литературы по микроспорогенезу и прогамной фазе оплодотворения покрытосеменных растений. В данной главе отражены имеющиеся в литературе данные о влиянии абиотических факторов на протекание микроспорогенеза и прогамную фазу оплодотворения.
2.1. Условия исследований. Погодные условия в период проведения исследований (2004–2007 гг.) были весьма разнообразными, что позволило провести наиболее широкую оценку фенотипического проявления признаков гибридов с различным эколого-географическим происхождением. Наиболее значимым в наших исследованиях является набор положительных температур весной, когда проходят все «критические периоды» (Броунов, 1897) микроспорогенеза.
2.2. Объекты исследований. Объектами исследований являлись пыльники и мужские гаметофиты (пыльца) гибридов H. rhamnoides разного эколого-географического происхождения селекции В.А. Фефелова (НГСХА): Геракл, 31/89 и 5/93 – гибриды, полученные от опыления сортов ботанического сада МГУ им. М.В. Ломоносова (далее сорта МГУ, прибалтийский экотип) пыльцой мутантной мужской формы катунской облепихи; Дебют – гибрид катунского экотипа; 5/87, 1/89 и 1/91 – гибриды, полученные от опыления сортов МГУ опылителями катунского экотипа; 1/90 – гибрид, полученный от опыления сортов МГУ опылителями саянского экотипа. По комплексу морфофизиологических признаков, все изученные мужские гибриды можно условно разделить на две группы: с преобладанием морфофизиологических признаков прибалтийского экотипа (Геракл, 31/89, 1/90 и 5/93); с преобладанием морфофизиологических признаков катунского экотипа (Дебют, 5/87, 1/89 и 1/91). Всего в опыте анализировали 40 растений 8 перспективных гибридов, являющихся высокоустойчивыми и устойчивыми к условиям зимнего периода (Смертин, 2006). В качестве моделей для изучения прогамной фазы оплодотворения при внутривидовом скрещивании гибридов H. rhamnoides использовали цветки 7 женских гибридов разного эколого-географического происхождения (Дюймовочка, 21/90 – гибриды, полученные при скрещивании гибридов прибалтийского и саянского экотипов; Надежда – гибрид южноказахстанскго экотипа; 10/86 – гибрид катунского экотипа; 35/90, 8/93 – гибриды, от опыления сортов прибалтийской облепихи пыльцой мутантной мужской формы катунской облепихи; 46/90 – гибрид, от опыления сортов МГУ опылителями катунского экотипа). Всего в опыте было проанализировано 56 комбинаций скрещивания.
2.3. Методы исследований. Пыльники и пыльцу отбирали на селекционном участке облепихи опытного поля НГСХА и анализировали в лабораторных условиях. Пробы для проведения цитологического анализа микроспорогененза начинали отбирать после перехода среднедекадных температур через 0С. Отбор проб (соцветий) проводили с побегов из середины кроны каждого гибрида, отбирая не менее 15 соцветий. Стадии развития мужского гаметофита определяли по методике с окрашиванием ацетокармином (Паушева, 1988; Барыкина и др., 2004). Зрелую пыльцу облепихи крушиновидной собирали по стандартной методике (Соколова, Кондрашова, 1988). Жизнеспособность пыльцы определяли, используя ряд методов: по содержанию пролина (Барыкина и др., 2004), по методу Диакона (Барыкина и др., 2004), по содержанию крахмала (Прозина, 1960), ацетокарминовым методом (Паушева, 1988), методом Александера (Барыкина и др., 2004), а также методом проращивания пыльцы (Паушева, 1988) на модифицированной среде Транковского (агар-агар 1%, сахароза 15%, с добавлением CaCl2 и H3BО3 в концентрации 310-5%) в темной камере при температуре 20–22С. Прорастание пыльцы и длину пыльцевых трубок определяли через 2, 4, 8, 12, 16, 22 и 24 часа после посева пыльцы на среду Транковского. Все препараты просматривали на световом микроскопе Laboval – 4 и фотографировали, используя фотоаппарат Nikon coolpix 4500.
Диаметр пыльцевых зерен и длины пыльцевых трубок измеряли микрометром МОВ – 115, при 375-кратном увеличении.
Для изучения начальных этапов прогамной фазы оплодотворения побеги с женскими цветками после искусственного опыления пыльцой изучаемых гибридов помещали во влажные камеры на 16 часов. Пестики с проросшей пыльцой фиксировали в фиксаторе Кларка, промывали и хранили в 70% этаноле (Паушева, 1988; Барыкина и др., 2004). Рост пыльцевых трубок в тканях рыльца пестика изучали на давленых препаратах, окрашенных анилиновым синим (Паушева, 1988; Барыкина и др., 2004). Препараты монтировали в сахарозе по Шалумовичу (Паушева, 1988), просматривали на люминесцентном микроскопе MICROS MS 200 ATF и фотографировали фотоаппаратом Nikon coolpix 4500.
При определении жизнеспособности пыльцы просматривали по 1000 пыльцевых зерен у каждого образца, диаметр определяли у 60 пыльцевых зерен каждого образца, длину пыльцевых трубок определяли у 100 проросших пыльцевых зерен каждого образца.
Все полученные данные обрабатывали с помощью методов прикладной статистики (Доспехов, 1968; Гланц, 1998) с использованием пакета программ Microsoft Excel и Statistica 6.0. Для анализа метрических показателей пыльцы применяли двухфакторный дисперсионный анализ и множественное попарное сравнение с использованием стандартного критерия Стьюдента с поправкой Бонферрони. Данные по качественным показателям пыльцы оценивали при помощи критерия 2 Пирсона. Анализ длины пыльцевых трубок проводили с использованием критерия Крускала-Уоллиса, являющегося непараметрическим аналогом однофакторного дисперсионного анализа, и множественного попарного сравнения с использованием критерия Крускала-Уоллиса с поправкой Бонферрони (Гланц, 1998). Корреляционный анализ между качественными показателями пыльцы и её жизнеспособностью проводили с использованием непараметрического коэффициента Спирмена. Для выявления сходства между гибридами использовали кластерный анализ. Для проведения кластерного анализа выбрано Евклидово расстояние и иерархическое объединение изученных гибридов в кластеры по методу Уорда (Гланц, 1998).
