Содержание к диссертации
Введение
1 Взаимоотношения тлей и микроорганизмов (обзор литературы) 8
1.1 Тли как среда обитания микроорганизмов 8
1.1.1 Морфология и жизненные циклы тлей 8
1.1.2 Строение и функционирование пищеварительной системы тлей -основного места локализации микроорганизмов 15
1.2 Симбиотические микроорганизмы тлей 18
1.3 Роль тлей в распространении фитопатогенных микроорганизмов 23
1.4 Энтомопатогенные микроорганизмы и их использование для борьбы с тлей 26
2 Материал и методы исследований 34
2.1 Характеристика района исследования 34
2.2 Места сборов насекомых 35
2.3 Материал исследования 37
2.4 Методы исследования 41
2.4.1 Методы выделения микроорганизмов из внутренней среды тлей 41
2.4.2 Методы изучения биологических свойств выделенных штаммов 42
2.4.3 Методы изучения влияния микрофлоры кормового растения на видовой состав микробоценозов тлей 44
2.4.4 Методы изучения экологических показателей, используемых в работе 45
2.4.5 Методы статистической обработки результатов исследования 45
3 Эколого-физиологические аспекты формирования микробоценозов тлей 47
3.1 Основные источники микроорганизмов, входящих в состав микробоценозов тлей 47
3.2 Биологические свойства бактерий, позволяющие им адаптироваться к обитанию во внутренней среде насекомых 51
4 Структура микробоценозов тлей, паразитирующих на древесных и кустарниковых растениях 56
4.1 Структура микробоценоза яблонной тли (А. роті) 56
4.2 Структура микробоценоза сливоопыленной тли (Н. pruni) 59
4.3 Структура микробоценоза вишневой тли (М cerasi) 61
4.4 Структура микробоценоза смородиновой тли (A. Schneider і) 64
4.5 Сравнительная характеристика микробоценозов различных видов тлей 65
5 Организмы тлей как резервуары фитопатогенных бактерий в природе 72
6 Динамика микробоценозов тлей 79
6.1 Динамика микробоценозов тлей в различных районах Саратовской области 79
6.2 Динамика микробоценозов тлей в разные годы 88
6.3 Сезонная динамика микробоценозов тлей 110
Заключение 115
Выводы 120
Список сокращений и условных обозначений 122
Список литературы 123
Список иллюстративного материала 141
- Симбиотические микроорганизмы тлей
- Основные источники микроорганизмов, входящих в состав микробоценозов тлей
- Организмы тлей как резервуары фитопатогенных бактерий в природе
- Сезонная динамика микробоценозов тлей
Введение к работе
Актуальность темы. В современной экологии любой макроорганизм рассматривается как среда обитания, как своеобразная экосистема в узком значении этого понятия. Важнейшим компонентом такой экосистемы являются микроорганизмы, обитающие во внутренней среде хозяина и оказывающие на него огромное влияние (Сукачев, 1972; Балашов, 1982). Несмотря на это, микробоценозы большинства видов живых организмов остаются практически неизученными. Объектами наших исследований являются тли - широко распространённые вредители сельскохозяйственных культур. Многие фенотипические признаки этих насекомых определяются не собственными генами, а генами живущих в них бактерий, что позволяет рассматривать тлей как своеобразные симбиотические «сверхорганизмы» (Russel, Moran, 2006; Guay et al, 2009; Degnan et al., 2010). До настоящего времени внимание исследователей привлекали, в основном, облигатные симбионты тлей -бактерии рода Buchnera. Эти бактерии обеспечивают своих хозяев незаменимыми аминокислотами, которых нет в растительных соках, определяют способность насекомых приспосабливаться к колебаниям температуры (Douglas, 1998; Tsuchida et al., 2010). Из факультативных бактериальных симбионтов тлей в мировой литературе описано лишь небольшое количество видов, ассоциированных с гороховой тлёй (Mandrioli, Manicardi, 2013). Присутствие этих симбионтов защищает их хозяев от наездников и энтомопатогенных грибов, придает насекомым защитную пигментацию, способствует синтезу некоторых аминокислот. Вопрос о том, насколько разнообразны микробные ассоцианты других видов тлей, и какую роль они могут играть в жизнедеятельности своих хозяев остается открытым.
Интерес к изучению тлей связан и с их участием в сохранении и передаче возбудителей болезней растений (Nault, 1997; Leach, 2007; Hogenhout, 2008; Stawrinides, Nadarasah, 2011). В литературе большое внимание уделяется роли тлей как переносчиков фитопатогенных вирусов. Среди возбудителей бактериозов растений лишь для Pseudomonas syringae (Stavrinides et al., 2009), Dickeya dadantii, Erwinia aphidicola, Pantoea stewartii (Nadarasah, Stavrinides, 2011) доказана способность выживать и размножаться в организмах этих насекомых. Детальное изучение спонтанной микробной обсеменённости тлей поможет выявить более широкий спектр фитопатогенов, способных сохраняться в организмах этих вредителей.
Изучение микробоценозов тлей является важным этапом разработки новых микробиологических методов ограничения численности насекомых. Существующие биопрепараты на основе облигатных энтомопатогенов имеют ряд недостатков, главный из которых - необходимость в постоянных повторных обработках. Причина этого в высокой степени специализации таких микроорганизмов: гибель насекомых влечет за собой отмирание самих возбудителей бактериозов. Этот недостаток микробных инсектицидов может быть устранен с помощью методов генной инженерии. Предлагается вводить
гены, обеспечивающие синтез токсических веществ, в широко распространенные сапрофитные бактерии (Lacey, Кауа, 2007). Такие микроорганизмы после гибели вредителей будут сохраняться в природной среде как обычные сапрофиты и в течение длительного времени контролировать численность насекомых. Становится актуальным поиск штаммов бактерий, которые могли бы послужить материалом для создания таких трансгенных агентов.
В связи с этим, исследование микробоценозов тлей не только представляет теоретический интерес, но и имеет большое практическое значение.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы стало выявление видового состава и эколого-физиологических особенностей микробоценозов тлей, паразитирующих на древесных и кустарниковых растениях.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
-
Выявить эко лого-физиологические аспекты формирования микробоценозов тлей.
-
Установить структуру микробоценозов четырёх видов тлей: яблонной (Aphis роті Deg.), сливоопыленной (Hyalopterus pruni Geoffr.), вишневой (Myzus cerasi F.) и смородиновой {Aphis schneideri СВ.), и количественные показатели содержания отдельных видов бактерий-ассоциантов в организмах этих насекомых.
-
Оценить роль исследуемых видов тлей как резервуаров фитопатогенных бактерий в природе.
-
Выявить изменчивость качественных и количественных характеристик микробоценозов тлей.
Научная новизна. Впервые установлена структура микробоценозов яблонной (А. роті), сливоопыленной (Н. pruni), вишневой (М cerasi) и смородиновой (A. schneideri) тлей; показана высокая степень изменчивости микробоценозов тлей как в разные годы, так и в течение одного сезона; доказана способность тлей сохранять в своём организме фитопатогенные виды Brenneria nigrifluens, Curtobacterium flaccumfaciens, Erwinia mallotivora, Pantoea ananatis, Ralstonia solanacearum, Xanthomonas campestris; установлено высокое содержание в организмах тлей азотфиксирующих бактерий.
Теоретическая и практическая значимость. Полученные результаты существенно расширяют представления о роли тлей в циркуляции бактерий в природе. Выявленная способность некоторых фитопатогенных бактерий сохраняться в организме тли позволит фитопатологам более точно прогнозировать распространение вызываемых ими бактериозов растений. Выделены штаммы бактерий, которые являются обитателями окружающей среды, но способны успешно проникать во внутреннюю среду тлей и активно там размножаться. Эти штаммы могут быть использованы для создания трансгенных энтомопатогенов, которые позволят более эффективно контролировать численность этих вредителей.
Апробация работы. Основные результаты работы представлены на II Международной научно-практической конференции «Биодиверситиология. Современные проблемы сохранения и изучения биологического разнообразия» (Чебоксары, 2010); Региональной конференции биологического факультета СГУ «Исследования молодых ученых в биологии и экологии» (Саратов, 2011); Международной научной конференции «Фундаментальные проблемы энтомологии в XXI веке» (Санкт-Петербург, 2011); Международной заочной научно-практической конференции: «Современные тенденции в науке: новый взгляд» (Тамбов, 2011); I Международной интернет-конференции «Растения и микроорганизмы» (Казань, 2011); Региональной конференции биологического факультета СГУ «Исследования молодых ученых в биологии и экологии» (Саратов, 2012); XIV съезде Русского энтомологического общества (Санкт-Петербург, 2012); Всероссийской (с международным участием) научной конференции «Актуальные проблемы экологии и физиологии живых организмов» (Саранск, 2013).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 научных работ, из которых 4 в печатных изданиях, рекомендованных Перечнем ВАК РФ.
Личный вклад автора. Автор лично провёл полевые и лабораторные исследования. Обработка полученных данных, их интерпретация и оформление проведены автором самостоятельно. Доля участия автора в совместных публикациях составляет 60-80%.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 144 страницах, содержит 23 таблицы, 31 рисунок. Состоит из введения, 6 глав, 6 выводов, заключения, списка литературы, включающего 184 источника, в том числе 121 иностранных.
Симбиотические микроорганизмы тлей
Симбионтов тлей принято делить на облигатных (первичных) и факультативных (вторичных). Облигатные симбионты являются, как правило, внутриклеточными и не способны выживать вне организма своего хозяина. Факультативные симбионты могут быть как внутри- так и внеклеточными и помимо организма хозяина способны выживать и в других средах обитания (Oliver, Degnan, Burke, Moran, 2010).
Среди облигатных симбионтов тлей наиболее изученными являются бактерии рода Buchnera (y-Proteobacteria) (Moran, 2006; Phillips, 2006; Bermingham, Wilkinson, 2010; Gosalbes, 2010; Gross, Zientz, Feldhaar, 2012). Эти бактерии обитают в специальных клетках - бактериоцитах. Buchnera выделяются исключительно из тлей, не встречаются в других насекомых и являются некультивируемыми (Douglas, 1998; Koga, Tsuchida, Fukatsu, 2003; Sauer, Holldobler, Gross, 2006). Бактерии передаются вертикально через яичник тли. Отсутствие симбионтов негативно отражается на росте и репродуктивной способности насекомых-хозяев (Douglas, 1998; Zientz, Dandekar, Gross, 2004). Но и Buchnera не может существовать без организма тли, т.к. в процессе длительной эволюции этот вид настолько приспособился к существованию внутри клеток этих насекомых, что произошло сокращение его генома (Koga, Tsuchida, 2003; Moran, 2006).
Симбиоз гороховой тли A. pisum с бактерией Buchnera aphidicola APS представляет наиболее изученный облигатный симбиоз насекомых (Bermingham, Wilkinson, 2010; Shigenobu, Wilson, 2011).
Бактерии Buchnera играют ключевую роль в питании тли (Douglas, 1998; Sandstrom, Moran, 1999; Douglas, Minto, Wilkinson, 2001; Zientz, Dandekar, Gross, 2004). Во флоэмном соке, которым питаются эти насекомые, содержится много углеводов, но мало аминокислот. Между тем тли должны получать с пищей около 10 различных аминокислот, которые они сами синтезировать не могут. Бактерии-симбионты способны синтезировать все аминокислоты, и они снабжают ими хозяина (Febvay, 1999; Gosalbes, 2010). Установлено, что в число таких аминокислот входят аргинин, триптофан, треонин, гистидин, лейцин, изолейцин, лизин, валин и фенилаланин (Ракитин, Гельфанд, 2009). Активность генов бактерии, определяющих синтез этих аминокислот, регулируется таким образом, что бактерия синтезирует их гораздо больше, чем это ей необходимо, и их избыток достается насекомому (Громов, 1998). Установлено, что численность симбионтов в организме тли напрямую связана с концентрацией незаменимых аминокислот во флоэмном соке кормового растения (Sandstrom, Moran, 1999).
Интересно, что симбионты обеспечивают своего хозяина необходимыми аминокислотами ещё на стадии эмбрионального развития. Эксперименты J. Bermingham, T.L. Wilkinson (2010) показали, что эмбрионы тлей получают необходимые для роста аминокислоты фенилаланин и валин из материнских тканей, а триптофан - из бактерий Buchnera.
Бактерии рода Buchnera выполняют и другие, не связанные с питанием функции: содействуют передаче циркулирующих вирусов (Douglas, 1998), определяют способность насекомого приспосабливаться к колебаниям температуры (Tsuchida et al., 2010).
Установлено, что для нормального существования Buchnera в организме хозяина необходимо, чтобы насекомое получало достаточное количество калия, магния, железа, цинка, марганца, меди и кальция. При выращивании тли Neomyzus circiimjlexus Suckt на синтетической среде отсутствие этих элементов в рационе задерживало развитие симбионтов в первом или втором поколении хозяев и приводило к полной их гибели в последующих поколениях (Erhardt, 1968).
Помимо Buchnera, тли могут нести и факультативных симбионтов. Факультативные симбионты находятся во многих тканях хозяина: в кишечнике, железах, различных жидкостях организма. При этом они могут вести как внутриклеточный, так и внеклеточный образ жизни (Gosalbes, Lamelas, Моуа, Latorre, 2008; 2010). К вторичным симбионтам относятся такие виды микроорганизмов, как Hamiltonella defensa, Regiella insecticola, Erwinia aphidicola, Serratia symbiotica, Pseudomonas aeruginosa, Wolbachia pipientis, Rickettsiella sp., Rickettsia sp., Spiroplasma sp., Arsenophonus sp., Photorhabdus sp., Xenorhabdus sp. (Mandrioli, Manicardi, 2013). Факультативные симбионты могут передаваться как по вертикали, так и по горизонтали. Горизонтальная передача симбионтов возможна как внутри вида, так и между особями разных видов, что приводит к мгновенному приобретению насекомыми экологически важных качеств (Russel, Moran, 2003; Degnan et al., 2009; Oliver et al., 2010; Jiggins, Hurst, 2011). Для факультативных симбионтов возможен и растение-опосредованный путь передачи. Опыты A. Caspi-Fluger, М. Inbar, N. Mozes-Daube и др. (2012) показали, что растения могут служить резервуаром для горизонтальной передачи симбионтов рода Rickettsia. Этот механизм может объяснить наличие филогенетически близких симбионтов у несвязанных между собой растительноядных насекомых.
Функции вторичных симбионтов чрезвычайно разнообразны. Н. defensa в содружестве с симбиотическим вирусом APSE защищает тлей от наездников (Guay et al., 2009; Oliver et al., 2010). R. insecticola защищает своего хозяина от наездников и от энтомопатогенных грибов (Castaneda et al., 2010; Vorburger, Geher, Rodriguez, 2010). S. symbiotica определяет способность насекомого приспосабливаться к колебаниям температуры и защищает от наездников (Russel, Moran, 2006; Poirie, Coustau, 2011). Кроме того, по данным М. Gosalbes с соавторами (2008), S. symbiotica вместе с Buchnera участвует в биосинтезе триптофана. При сравнении Н. defensa и R. insecticola выяснилось, что они являются родственными видами и защищают тлей от нападения наездников (Degnan et al., 2010). Бактерия из рода Rickettsiella придает зеленую пигментацию насекомым, которые без этой бактерии имеют красную окраску. Не исключено, что Rickettsiella помогает тлям защищаться от божьих коровок, которые чаще нападают на красных тлей, чем на зеленых. Однако зеленые тли чаще становятся жертвами наездников. Среди тлей, зараженных Ricketsiella, с повышенной частотой встречаются особи, зараженные также Hamiltonella или Serratia. (Tsuchida et al., 2010). При определённых условиях факультативные симбионты могут влиять на плодовитость тлей, но механизм этого явления пока не выяснен (Sasaki, Hayashi, 1991; Russell, Moran, 2006; Barribeau et al., 2010). Контроль за симбиотическими бактериями в организме насекомого осуществляется с помощью комплекса иммунных реакций. Известно, что у тлей, как и у большинства других насекомых, есть механизмы клеточного и гуморального иммунитета. Модельным объектом для изучения элементов иммунной защиты в большинстве исследований являлась гороховая тля (A. pisum) (Vilmos, Kurucz, 1998; Poirie, Coustau, 2011).
Элементы клеточного иммунитета тлей недостаточно развиты и представлены несколькими видами гемоцитов: у гороховой тли были обнаружены прогемоциты, гранулоциты, отвечающие за инактивацию грамотрицательных палочек и грамположительных кокков и оэноциты, обладающие меланотической активностью и участвующие в инкапсуляции чужеродного тела. У молочайной/картофельной тли {Macrosiphon euphorbiae) было найдено шесть видов гемоцитов: прогемоциты, оэноциты, плазматоциты, гранулоциты, сферулоциты и клетки воска (Boiteau, Perron, 1976; Poirie, Coustau, 2011).
У тлей отсутствуют многие гены, отвечающие за гуморальные иммунные реакции у насекомых (Gerardo et al., 2010; Barribeau et al., 2010). В связи с этим, тли имеют слабо функционирующие лизоцимы и только один известный противогрибковый пептид тауматин. Кроме того, гуморальный иммунитет тлей отличается от других насекомых отсутствием Imd-пути, который реагирует на пептидогликан клеточной стенки грамотрицательных бактерий (Barribeau et al., 2010). У тлей функционирует Toll-путь (Gerardo et al., 2010). Элементы Toll-пути препятствуют проникновению грамположительных бактерий, грибов, дрожжей, благодаря синтезу лизоцимов типа мурамидаз (Gilbert, 2011).
Отсутствие сигнального Imd-пути и низкий уровень экспрессии генов, отвечающих за иммунный ответ, приводит к низкой общей антибактериальной реакции иммунного ответа у тлей и является следствием адаптации к симбиозу с бактериями Buchnera (Poirie, Coustau, 2011).
Основные источники микроорганизмов, входящих в состав микробоценозов тлей
Формирование микробоценоза внутренней среды любого макроорганизма является важным этапом его развития. Известно, что передача по вертикали, т.е. от материнских особей дочерним, характерна только для облигатных симбионтов тлей - бактерий рода Buchnera, которые обнаруживаются уже у эмбрионов насекомых (Bermingham, Wilkinson, 2010). Можно предположить, что попадание в организм тли других микроорганизмов происходит с момента появления личинки, когда насекомое начинает питаться, активно контактируя с кормовым растением. До начала питания эти насекомые делают несколько пробных проколов растительных тканей (Hewer, Becker, van Bel, 2011). Именно в этот период наиболее вероятно попадание бактерий с поверхности и из внутренней среды кормового растения в пищеварительный канал тли. Чтобы выяснить, насколько схожи микрофлора кормового растения и внутренней среды питающихся на нём тлей были параллельно проведены их микробиологические исследования.
В результате было установлено, что видовое разнообразие микроорганизмов на поверхности растения всегда намного выше, чем во внутренней среде тлей (рисунок 4).
Индексы общности видового состава микрофлоры поверхности листа кормового растения и внутренней среды насекомых составили у яблонной тли 31,5 %, у сливоопыленной тли - 28,5%, у вишнёвой тли - 23,1%, у смородиновой тли - 15,0%. Причём во всех случаях выделялись виды, которые встречались на кормовых растениях и отсутствовали во внутренней среде насекомых, и виды, которые изолировались из организмов тли, но отсутствовали в смывах с поверхности растения. Возможно, на выживание того или иного вида бактерий в организме тли влияют их пищевые, энергетические потребности и то, насколько полно внутренняя среда насекомого может их удовлетворить.
Для подтверждения возможности проникновения бактерий с поверхности кормовых растений во внутреннюю среду насекомых была проведена обработка поверхности кормовых растений яблонной и вишнёвой тлей взвесями бактерий Serratia marcescens 205 в различных концентрациях. В наших исследованиях этот вид никогда не выделялся с поверхности листьев и побегов яблони или вишни.
При использовании взвесей концентрацией от 10 до 10 м.к./мл единичные клетки S. marcescens обнаруживались на поверхности листьев вишни лишь в течение первых суток (таблица 2).
В последующие сутки интродуцированный штамм с поверхности листьев не выделялся. При использовании взвеси концентрацией 109 м.к./мл, S. marcescens 205 выделялся с поверхности листьев в течение 3-х суток после нанесения. И именно концентрация взвеси 109 м.к./мл обеспечивала попадание штамма во внутреннюю среду вишнёвой тли. При более низкой концентрации обработки из организма тли S. marcescens не выделялся. При обработке листьев яблони взвесями в концентрациях от 104 до 109 м.к./мл, бактерии сохраняли свою жизнеспособность на поверхности кормовых растений в течение суток. Начиная со 2-х суток изолировать с поверхности листа жизнеспособные клетки интродуцированного штамма уже не удавалось (таблица 3).
Мы предположили, что отсутствие S. marcescens 205 в яблонной тле связано с тем, что в микробной ассоциации этих насекомых присутствовал вид, подавивший интродуцированный штамм. Однако проведенные исследования антагонистической активности не выявили. Вероятно, химический состав флоэмного сока кормовых растений может определять возможность выживания интродуцированного штамма в организме тли.
Было выявлено, что в микробоценозах тлей могут присутствовать виды, которых нет на поверхности кормового растения. Их источником может быть сок ксилемы, в который могут попадать почвенные микроорганизмы, и потребление которого тлями доказано в исследованиях М. Malone et al., (1999), G. Powell, J. Hardie (2002), J. Pompon et al. (2010). Действительно, проведенные нами исследования внутренней среды кормовых растений тлей, показали наличие там большого количества микроорганизмов, принадлежащих, преимущественно к роду Bacillus. Причем микрофлора внутренней среды насекомых была более схожа с микрофлорой внутренней среды кормового растения, чем с микрофлорой его поверхности (рисунок 5).
Индексы общности видового состава микрофлоры внутренней среды кормовых растений и внутренней среды насекомых составили у яблонной тли 57,6%, у сливоопыленной - 48,2%, у вишневой - 51,2%, у смородиновой - 53,4%.
Таким образом, основными источниками микроорганизмов, обитающих в пищеварительных каналах тлей, являются поверхность и внутренняя среда кормовых растений этих насекомых.
Организмы тлей как резервуары фитопатогенных бактерий в природе
В литературе тли рассматриваются преимущественно как переносчики фитопатогенных вирусов (Дьяконов, 2000; Reinbold, Herrbach, Brault, 2003; Ng, Perry, 2004; Hodge, Powell, 2010; Tamborindeguy et al., 2010). Из бактериальных возбудителей болезней растений в организмах этих насекомых обнаруживали лишь Pseudomonas syringae (Stavrinides et al., 2009), Dickeya dadantii, E. aphidicola, P. stewartii (Nadarasah, Stavrinides, 2011). Наши исследования показали, что внутренняя среда тли благоприятна для сохранения более широкого круга фитопатогенных бактерий.
Мы проанализировали спектр фитопатогенных бактерий, которые были выделены из микробоценозов четырех видов тлей за весь исследуемый период (таблица 10).
Наиболее широкий спектр фитопатогенных бактерий (пять видов) был выделен из организмов яблонной тли, из организмов сливоопыленной и смородиновой тлей было изолировано по четыре фитопатогенных вида, из вишневой тли было выделено всего два фитопатогенных вида.
Brenneria nigrifluens — возбудитель некроза коры плодовых деревьев (Bergey, 2007) - выделялся только из организмов яблонной и сливоопыленной тлей. Причем в микробоценозе яблонной тли в 2012 г. его встречаемость доходила до 70% при высоких количественных показателях (10—10 КОЕ в пробе). А в организмах сливоопыленной тли в 2011 г. Вид В. nigrifluens изолировался в 80% случаев в количестве 105-106КОЕ в пробе.
Curtobacterium jlaccumfaciens известен как возбудитель бактериального увядания бобовых (фасоли) (Valentini et al., 2010). В разные годы этот вид выделялся из организмов яблонной, сливоопыленной и смородиновой тлей. Из яблонной и сливоопыленной тлей С. Jlaccumfaciens изолировался из 10% проб, в микробоценозе смородиновой тли его встречаемость в пробах в 2009 г. составила 50%. Количественные показатели этого фитопатогенного вида в организмах яблонной тли составляли 103-107, в сливоопыленной - 105, в смородиновой -103КОЕвпробе.
Envinia mallotivora первоначально указывался как возбудитель бактериальной пятнистости Mallotus Japonicus Muell. из семейства Молочайные (Goto, 1976). Исследования N.M. Amin с коллегами (2011) показали, что Е. mallotivora пат огенен и для ряда других растений. Этот вид изолировался только из смородиновой тли, причём лишь в отдельные годы и в концентрации не более 10 КОЕ в пробе.
Pantoea ananatis — вид, вызывающий заболевания сельскохозяйственных и лесных древесных пород в различных частях света (Coutinho, Venter, 2009). P. ananatis был выделен из трех видов тлей: яблонной, вишневой и смородиновой. Однако если из микробоценозов яблонной и вишневой тли этот вид выделялся в большом количестве (104-107), то в микробоценозе смородиновой тли его количественные показатели были минимальны.
Pantoea stewartii известен как возбудитель бактериального увядания кукурузы (Bergey, 2007). Этот фитопатоген выделялся из всех исследованных видов тлей, причём с высокой частотой встречаемости и в высоких концентрациях (до 10 КОЕ в пробе).
Ralstonia solanacearum вызывает увядание листьев овощных культур, поражает около 200 видов растений (Желдакова, Мямин, 2006). Был выделен только из организмов сливоопыленной тли. Встречаемость R. solanacearum в организмах тлей не превышала 10%, а количественное содержание - 103 КОЕ в пробе.
Xanthomonas campestris является возбудителем сосудистого бактериоза у различных растений (Желдакова, Мямин, 2006). Был выделен только из организмов яблонной тли, в других видах тлей он не обнаруживался. Его встречаемость в пробах в 2010 г. доходила до 30% при количественных показателях содержания в организме насекомых 105 КОЕ в пробе.
Из всех исследованных нами видов наибольшее значение как резервуар фитопатогенов имеет яблонная тля, способная сохранять в своём организме наибольшее число фитопатогенных видов в высоких концентрациях. Наиболее активно тли участвуют в сохранении в природе популяции P. stewartii, который входил в число доминирующих видов у всех исследованных таксонов насекомых.
Помимо хорошо известных фитопатогенных видов в последнее время многие сапрофитические виды постепенно переходят в разряд условно-патогенных и патогенных. Мы предположили, что микроорганизмы, ассоциированные с растительноядными насекомыми, могут иметь какие-либо факторы фитопатогенности и при определенных условиях вызывать патологические изменения у растений. Для выяснения этого все выделенные нами штаммы сапрофитических видов бактерий-ассоциантов были проверены на способность к мацерации растительных тканей и на наличие целлюлолитической активности. Было установлено, что 44,0% всех изолятов обладали различными факторами фитопатогенности.
Мацерирующей активностью обладали 38,3% грамположительных споровых палочек, 56,2% грамположительных неспоровых палочек и 27,3%) грамотрицательных палочек (рисунок 15).
Наиболее эффективно бактерии, выделенные из тлей, мацерировали ткани картофеля и свёклы, меньшее количество штаммов было способно к мацерации тканей моркови.
Наиболее высокая целлюлолитическая активность была выявлена у грамотрицательных палочек, среди которых 24,0% штаммов были способны использовать целлюлозу. Группы грамположительных споровых и неспоровых палочек обладали приблизительно одинаковой целлюлолитической активностью (11,6% и 12,5% соответственно) (рисунок 16).
Сезонная динамика микробоценозов тлей
Моделями для изучения динамики микробоценоза насекомых в течение сезона послужили яблонная (А. роті) и смородиновая (A. schneideri) тли. Выбор объектов исследования был обусловлен приуроченностью к разным жизненным формам кормовых растений: яблонная тля является вредителем древесных растений, а смородиновая - кустарниковых.
Исследования яблонной тли проводились с июня по ноябрь 2010 г. Было исследовано 600 особей, собранных в окрестностях г. Энгельса. Сбор и микробиологические исследования насекомых проводили ежемесячно.
Видовое разнообразие микробоценоза яблонной тли увеличивалось в течение сезона с 7 видов в июне до 30 видов в ноябре, что связано преимущественно с увеличением представителей рода Bacillus (рисунок 30).
В таблице 21 представлена динамика выделения видов, которые в определённые периоды сезона имели наибольшие показатели встречаемости. Из таблицы видно, что в июне максимальные показатели встречаемости имели Kytococcus sedentarius (70%), Micrococcus agilis (60%), Staphylococcus kloosii (50%). Их количественные показатели составляли 103-104 КОЕ в пробе.
В июле из всех исследованных проб тли изолировался Microbacterium lacticum и из половины - Bacillus pumilus. Количественные показатели этих видов составляли 103-10б КОЕ в пробе.
В августе вновь произошла смена доминантов, в этот период из большинства проб выделялись Е. faecium (индекс встречаемости 80%), М. agilis (50%), В. pumilus (50%), В. badius (40%). Количественные показатели этих видов в данный период составляли 104 КОЕ в пробе.
В осенние месяцы в микробной ассоциации яблонной тли доминантами были представители рода Bacillus: В. lentus (индекс встречаемости 90%), В. horikoshii (80%), В. badius (50%), В. pumilus (50%), В. subtilis (50%) в сентябре, В. subtilis (40%) в октябре и В. clausii (50%) в ноябре. Количественные показатели их варьировали от 103 до 107 КОЕ в пробе.
Аналогичные исследования смородиновой тли проводили с мая по июль 2012 г. Всего было исследовано 300 особей, собранных в окрестностях г. Энгельса. В микробоценозе смородиновой тли в каждом исследуемом месяце выделялось приблизительно одинаковое количество видов микроорганизмов.
Однако намечалась тенденция к увеличению видов группы споровых палочек, при снижении количества видов других морфологических групп бактерий-ассоциантов (рисунок 31).
В микробоценозе смородиновой тли в течение всего сезона преобладали бактерии рода Bacillus, и также в течение всего сезона изолировались единичные виды грамотрицательных палочек. Однако видовой состав микробоценоза смородиновой тли существенно изменялся в течение сезона. Индекс его общности в мае и в июне составил 27%, в июне и июле - 18%. Насекомые, исследованные в мае и июле, общих видов бактерий не содержали.
Особый интерес представляет смена видов, имевших наиболее высокие показателвстречаемости. В мае наиболее часто встречающимися ассоциантами тли были Bacillus soli, В. subtilis и S. plymuthica. В июне доминировали В. thuringiensis и В. pumilus. В июле наиболее высокие индексы встречаемости имели В. horikoshii, В. coagulans и P. stewartii (таблица 22).
Таким образом, было показано, что микробоценоз тлей подвержен существенным изменениям в течение сезона. Изменялся не только общий видовой состав микробоценоза, но и происходила замена одних доминирующих видов другими. Вид, доминировавший в предыдущие месяцы, в последующие либо не выделялся совсем, либо выделялся в значительно меньшем количестве.
Ежемесячные микробиологические исследования тлей не позволяли уловить период смены доминанта. С этой целью была проведена серия ежедневных исследований микробоценозов тлей, снимаемой с одного и того же кормового растения. В качестве модельного объекта была выбрана смородиновая тля, поскольку у неё наиболее чётко прослеживалась смена доминирующих видов в течение сезона. Исследования первых проб выявили доминирование в микробоценозе смородиновой тли вида В. pwnilus (таблица 23).
Стабильность доминанта сохранялась в течение первых шести дней, но, уже начиная с пятого дня, в большинстве проб преобладающими видами становились В. simplex и P. stewartii, которые постепенно становились доминирующими видами. В результате тот или иной вид бактерий доминировал в микробоценозах тлей из одной колонии не менее шести дней, после чего происходила смена доминирующего вида. Смена доминанта может быть связана с появлением нового партеногенетического поколения тли. Отродившиеся личинки начинали питаться, и их пищеварительный канал заселяли микроорганизмы, находившиеся в этот период на поверхности и во внутренней среде кормового растения.
Таким образом, в микробоценозах исследованных видов тлей происходила ежемесячная смена доминирующих микроорганизмов. Периодичность смены доминанта совпадала с продолжительностью жизни одного партеногенетического поколения этих насекомых (в среднем 20—40 дней). Изменения, произошедшие за этот период в микробном сообществе почвы, кормового растения, находили отражение и в структуре микробоценозов обитающих на нем тлей.
