Содержание к диссертации
Введение
1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 9
1.1. Систематика видов родаРіпш 9
1.2. Специфика таксономического положения сосны меловой
1.3. Происхождение сосны меловой 15
1.4. Ареал сосны меловой 21
1.5. Биология сосны меловой 29
1.6. Генетикам цитология сосны меловой 33
1.7. Хозяйственное значение сосны меловой 38
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 43
2.1. Характеристика пробных площадей по сосне меловой и обыкновенной
2.1.1. Сосна обыкновенная на песке 43
2.1.2. Сосна обыкновенная на мелах 47
2.1.3. Сосна меловая намелах 48
2.2. Объекты исследования 49
2.3. Материал и методика 51
2.3.1. Методика изготовления микропрепаратов 58
2.3.2. Анализ микропрепаратов 59
2.3.3. Методы статистической обработки полученных экспериментальных данных
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 62
3.1. Цитогенетическая характеристика сосны обыкновенной, произрастающей на песчаных почвах и на мелах
3.2. Цитогенетическое изучение сосны меловой 72
3.3. Сравнительный цитогенетическии анализ сосны меловой и обыкновенной
ВЫВОДЫ 93
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 97
Введение к работе
А ктуальность тем ы
Изучение и сохранение генофонда и биоразнообразия основных лесообразующих пород России относится к числу приоритетных научных и хозяйственных задач государственного масштаба. Особого внимания при создании программ по повышению продуктивности, качества и устойчивости лесов заслуживают ценные, но редкие и исчезающие виды и экотипы. К таковым относится, в частности, сосна меловая. Успех разрабатываемых программ зависит от удачного сочетания комплекса фундаментальных и прикладных наук, и в том числе лесоведения, генетики и цитологии. Так, цитогенетические показатели древесных растений позволяют судить о состоянии их генетического аппарата и, опосредованно, о состоянии среды их обитания. Сосна меловая, являющаяся реликтом мелового периода и ценной древесной породой, имеет огромное значение для промышленности как источник древесины, а также может быть использована для облесения меловых обнажений. В Центрально-Черноземной зоне очень актуальна проблема облесения меловых обнажений, занимающих более 1.5 млн. га. Однако до настоящего времени для этого применялся, в основном, опыт создания лесных культур из сеянцев сосны обыкновенной, так как за сосной меловой не закреплен статус самостоятельного вида. По мнению одних
ученых (Лыпа, 1955; Кондратюк, I960; Машкин, 1971; Доронин, 1973; Артамонов, 1989; Орлова, 2001), сосна на мелах — это самостоятельный вид, по мнению других (Козо-Полянский, 1931; Сукачев, 1938; Котов, 1947; Правдин, 1964; Бобров, 1978; Чернодубов, 1998) - почвенный экотип сосны обыкновенной. Но для составления практических рекомендаций по облесению меловых обнажений, с учетом их эдафических особенностей, необходимо комплексное изучение лесоводственных, эколого-физиологических, цитогенетических и других показателей у сосны меловой и обыкновенной, произрастающих на меловом субстрате, для оценки характера их взаимодействия с условиями среды. Актуальность проведения при этом цитогенетических исследований определяется возможностью проследить на клеточном и хромосомном уровне реакцию генотипов сосны меловой и обыкновенной на сходные почвенно-климатические условия и уточнить таксономический статус сосны меловой. Именно изучение цитогенетических особенностей сосны меловой способно, на наш взгляд, дать ответ на вопрос о механизмах, обеспечивающих ее успешное произрастание в нетипичных для видов p.Pinus эдафических условиях - на меловых обнажениях.
Целью данной работы является цитогенетическая характеристика разных популяций сосны меловой в сравнительном плане с сосной обыкновенной, произрастающей в типичных для нее условиях обитания и на мелу, для выявления специфики реакции их генотипа на сходные условия обитания, для уточнения таксономического положения сосны меловой и для
научного обоснования мер по охране генофонда этого исчезающего доледникового реликта.
В соответствии с целью были намечены следующие задачи:
Сравнительная оценка общего состояния насаждений сосны меловой и сосны обыкновенной.
Сбор материала для цитогенетических исследований.
Цитогенетическое изучение сосны меловой и сосны обыкновенной, произрастающей на песчаном и меловом субстрате по критериям:
а) митотической активности;
б) патологии митоза;
в) ядрышковой активности.
4. Сравнительный анализ данных по цитогенетическому изучению
сосны меловой и сосны обыкновенной как основы для решения вопроса о
таксономическом статусе сосны меловой и рекомендаций по ее
использованию.
5. Оценка характера взаимодействия сосны с основными
экологическими факторами среды — почвенными и климатическими по
цитогенетическим показателям.
Работа выполнялась в соответствии с Федеральной целевой программой «Интеграция» (гос.номер регистрации 228.5.1) в содружестве с кафедрой лесных культур и селекции Воронежской государственной лесотехнической академии, и в рамках темы научно-исследовательской
работы кафедры генетики, селекции и теории эволюции биолого-почвенного факультета Воронежского государственного университета.
Научная новизна
Впервые выполнено сравнительное исследование семенного потомства четырех популяций сосны меловой и двух популяций сосны обыкновенной, произрастающих в естественных для нее (на песке) экологических условиях и на мелах, по характеру прохождения митоза, ядрышковой и митотической активности, а также с использованием микроядерного теста. Показана изменчивость цитологических характеристик у сосны в зависимости от эдафических условий в местах ее произрастания. Установлены достоверные различия между сосной меловой и сосной обыкновенной по норме реакции признака ядрышковой активности, отражающей уровень метаболических процессов и адаптационные возможности видов. Полученные данные могут служить аргументом в пользу видовой самостоятельности P.cretacea Kaleniczenko.
Практическая значимость работы заключается в научном обосновании перспективности использования сосны меловой для решения проблемы повышения продуктивности и устойчивости насаждений сосны на меловых обнажениях, важности сохранения генофонда лесообразующих пород России, особенно редких, исчезающих видов, форм и экотипов, к которым относится и сосна меловая. Результаты исследования внедрены в учебные курсы по генетике и селекции древесных растений ВГЛТА.
Обоснованность и достоверность результатов исследований обусловлены использованием адекватных методик, большим объемом экспериментального материала, обеспечивающим репрезентативность выборок, применением современных методик математического анализа и ПЭВМ для решения поставленных задач.
Положения, выносимые на защиту:
1. Экологические факторы оказывают существенное влияние на проявление
цитогенетических характеристик, таких как патология митоза и
ядрышковая активность у сосны меловой и обыкновенной.
Цитогенетические показатели могут быть использованы при уточнении таксономического положения сосны.
Сходство между сосной меловой и сосной обыкновенной по числу хромосом и показателям митотического индекса свидетельствует о их несомненном генетическом родстве.
Предлагается новый подход для выявления генетических различий между сосной меловой и обыкновенной по норме реакции признака ядрышковои активности с учетом полной пенетрантности, но варьирующей экспрессивности рибосомных генов.
Установленные различия по норме реакции признака ядрышковои активности (более узкая у сосны меловой и более широкая у сосны обыкновенной) могут рассматриваться как аргумент в пользу видовой самостоятельности сосны меловой.
6. Более узкая норма реакции по признаку ядрышковой активности свидетельствует о более экономном расходовании энергетических ресурсов у сосны меловой на мелу по сравнению с сосной обыкновенной, произрастающей на этом же субстрате. Апробация работы
Основные положения и результаты работы были представлены на Международном симпозиуме «Радикальное повышение экологических функций леса в XXI веке» (Воронеж, 1999), на Международной конференции «Биологические эффекты малых доз радиации и радиоактивное загрязнение среды» (Сыктывкар, 2001), на VII Международной научно-практической экологической конференции «Приспособления организмов к действию экстремальных экологических факторов» (Белгород, 2002), на Международном конгрессе «Emerging Trends in Plant Chromosome Research» (Patiala , 2003, India), на конференции, посвященной 80-летию профессора, д.с.-х.н. Р.И.Дерюжкина (Воронеж, 2003), на научных конференциях Воронежского госуниверситета (Воронеж, 1999, 2001), на заседаниях кафедры генетики, селекции и теории эволюции Воронежского госуниверситета (1998-2003 гг.).
Биология сосны меловой
Сосна меловая обладает специфическими особенностями морфологических и анатомических признаков, отличающих ее от сосны обыкновенной.
Дерево сосны меловой достигает 25-30 м высоты. Крона отличается от сосны обыкновенной («песчаной») приплюснутой, кудрявой формой как у итальянской сосны пинии, более короткой хвоей. Размеры хвои являются важным диагностическим признаком различных видов и форм сосен. Вместе с тем, этот признак сильно зависит от внешних факторов. Многие авторы уделяют этому показателю большое внимание (Тольский, 1927; Кондратьев, 1961; Правдин, 1964; Мамаев, 1973; Пугачев, 1991; Botwick, 1906; Renvall, 1914; Liese, 1929; Sokolowski, 1931; Wareing, 1949; Steven, Carlisle, 1959). У 20-летней сосны меловой хвоя на 18 мм короче, чем у сосны обыкновенной, у 50-летней - на 29 мм, у 100-летней - на 15 мм (Доронин, 1973). В различных популяциях сосны меловой длина хвои колеблется от 3.52 см до 9.10 см. Длина хвои также зависит от условий произрастания. В меловых борах, где сильно меняется микроклимат и другие факторы условий произрастания, коэффициент изменчивости - средний, а для шебекинской популяции — высокий.
Меньшей индивидуальной изменчивости подвержены ширина и толщина хвои, они имеют очень низкий уровень изменчивости (с=7.0 %) по данным шкалы изменчивости (Мамаев, 1973). Только в шебекинской и усманской популяциях - средний уровень изменчивости.
Число смоляных каналов как у сосны на мелах, так и на песках, колеблется от 8 до 17 штук при среднем коэффициенте изменчивости.
Важным признаком сосны является и строение шишек. Многие исследователи занимались изучением этого признака в различных регионах (Богословский, 1906; Сукачев, 1938; Петров, 1961; 1963; Правдин, 1964; Поджарова, 1968; Мамаев, 1973; Молотков и др., 1979; Особенности..., 1984; Видякин, 1991 а, б; Пугачев, 1991; Корепанов, 1994; Schott, 1907; Elwes, Henry, 1908; Sylven, 1916; Sokolowski, 1931).
Низкий коэффициент изменчивости параметров шишек отмечен в Усманском бору, затем - Жигулевская популяция, для других популяций он не превышает среднего значения.
В борах на мелах полностью отсутствуют узкоконусовидные шишки, преобладают - ширококонусовидные.
Длина и диаметр шишек у меловой сосны имеют меньшие показатели и коэффициенты вариации, чем у сосны обыкновенной. В.Н.Сукачев (1903), Е.Н.Кондратюк (1960) и Л.Ф.Правдин (1964) связывали это явление с бедностью субстрата, каким является мел, на котором произрастает сосна меловая.
Изучению изменчивости семян и их посевных качеств посвящено множество работ (Курдиани, 1908, 1910, 1932; Соболев, 1908; Самофал, 1924; Тольский, 1927; Правдин, 1931, 1958, 1964; Обновленский, 1951; Каппер, 1954; Князев, 1954; Лигачев, 1959, 1962; Проказин, 1974; Грибанов, 1959; Некрасова, 1960; Петров, 1961, 1963; Козубов, 1962; Патлай, 1965; Поджарова, 1968; Азниев, 1970; Савченко, Поджарова, 1970; Сурин, 1976; Пихельгас, 1971, 1974; Мамаев, 1973; Кречетова, 1974; Пугач, 1976; Орленко, Воловин, 1973; Черепний, 1980; Mork, 1957; Simak, Gustafsson, 1957; Lcnofski, 1960; Simak, 1961). Семена сосны меловой обладают серой окраской. В связи с тем, что окраска семян в пределах одного дерева постоянна, повторяется из года в год, независимо от возраста дерева, ее стали считать одним из важных систематических признаков (Курдиани, 1908; Zederbauer, 1908; Schmidt, 1930; Karschon, 1950; Forsheli, 1953).
Наиболее стабильным признаком, по данным А.И.Чернодубова (1995), является масса 1000 штук семян. Коэффициент изменчивости на мелах составляет 6.0-8.9 %, масса изменяется от 3.4 до 10.6 г. На песках коэффициент изменчивости-9.0-15.8 % и масса-от 4.8 до 11.0 г. Семенных чешуи у сосны меловой на 25 % меньше, чем у обыкновенной.
Корневая система у сосны меловой залегает поверхностно, главный корень рано отмирает, а боковые срастаются между собой и местами выходят на дневную поверхность далеко за пределы проекции кроны, достигая длины 8-12 м, а в диаметре - от 2 до 20 см. Характерной особенностью корневой системы сосны меловой является образование мочковатых корней на концах боковых (якорных) корней, глубоко проникающих в толщу мела.
Существуют отличия и в анатомическом строении хвои и стебля.
Сосна меловая имеет более развитый слой кутикулы — 6.3 6± 0.22 микрон, чем обыкновенная - 4.45 ± 0.30 микрон (Доронин, 1973). Устьиц у сосны меловой на 1 мм хвои приходится меньше, чем у сосны обыкновенной, но они являются более крупными по размеру. В хвое сосны меловой обнаружен слой инфрадермальной склеренхимы, тогда как у сосны обыкновенной такового не наблюдается. Продолжительность жизни хвои сосны меловой составляет 4-5 лет, у сосны обыкновенной - 2-3 года.
В анатомическом строении стебля сосны меловой отмечается, что феллоген активно продуцирует тонкостенную пробку, а у сосны обыкновенной -толстостенные элементы,
Феллодерма у сосны меловой занимает меньший объем, чем у обыкновенной. По мнению Е.Н.Кондратюка (1957), сосна меловая имеет наиболее высокое качество древесины: в годичных кольцах поздняя (осенняя) древесина составляет 26-41 % от ранней, у сосны обыкновенной — 20-25 %.
Немаловажными являются и экологические особенности. Меловые боры, по оценке Ю.А.Доронина (1973), обладают большей жизнестойкостью древостоя, чем песчаные. Спороношение у меловой сосны начинается и заканчивается на 2 дня раньше обыкновенной сосны.
Сосну меловую отличает также и размер пыльцы, который у нее гораздо больший, чем у сосны обыкновенной (Кондратюк, 1960).
Общим для всех морфолого-анатомических признаков является более высокая амплитуда изменчивости в меловых борах, чем в песчаных, что связано с большим разнообразием почвенных, климатических условий, вертикальной зональностью и другими экологическими факторами (Чернодубов, 1995)
Материал и методика
Исследования проводились с 1997 по 2002 год на кафедре генетики, селекции и теории эволюции биолого-почвенного факультета Воронежского государственного университета.Материалом для исследования служили корешки проростков семян с пяти-семи типичных деревьев из каждой популяции. Свежесобранные семена сосны меловой и сосны обыкновенной проращивали на влажной фильтровальной бумаге в чашках Петри при температуре 20-25С.
Процент прорастания семян сосны обыкновенной был более высоким (81-83 %), процент прорастания семян сосны меловой колебался от 69 % (у семян из Бекарюковки), 72 % (у семян из урочища Ржевка), 75 % ( у семян из Шебеки но) до 80 % (у семян из Острогожска).
Проросшие семена с длиной корешков не более 1.5 с.м фиксировали в пик митотической активности, приходящейся у сосны на 9 ч утра по зимнему времени, смесью ацеталкоголя (фиксатор Карнуа)- 3 части 96 % этилового спирта : 1 часть ледяной уксусной кислоты. Материал в течение суток выдерживался в комнатных условиях. Окрашивание проростков осуществлялось ацетогематоксилином. Время окрашивания подбиралось эмпирически. Оптимальным для сосны является 45 минут. Для проведения цитогенетических исследований готовились давленно-постоянные препараты по методике A.K.Butorina, N.P.Evstratov, 1986.
Копчик проращенного корешка, длиной не более 1.5 см, помещали на предметное стекло в каплю жидкости Гойера. Корешок слегка раздавливали препаровальной иглой и накрывали покровным стеклом. Препарат подогревали над пламенем горелки и легким надавливанием на покровное стекло добивались равномерного распределения клеток на микропрепарате. Просмотр приготовленных микропрепаратов проводили на микроскопе «Laboval» (Carl Zeiss, Jena) при увеличении 40 х 2.5 х 10.
На микропрепаратах сосны меловой и сосны обыкновенной, произрастающей на меловом и песчаном субстрате, учитывали общее количество просмотренных клеток (в каждом препарате в среднем около 700 клеток), количество делящихся клеток, число клеток, имеющих патологию митоза, клетки с определенным количеством ядрышек, число клеток с микроядрами. Общее число проанализированных клеток на каждый вариант составило по сосне обыкновенной из Усманского бора 36144; по сосне обыкновенной из Бекарюковского бора - 20130; по сосне меловой из Ржевки — 33052, из Бекарюковки — 35194, из Шебекино - 19820, из Острогожска — 15000.
На основе полученных в результате анализа микропрепаратов данных определяли митотическую активность, показателем которой является митотический индекс Ml, т.е. отношение числа делящихся клеток к общему числу меристематических клеток на препарате, в процентах; количество клеток с патологией митоза - от общего числа делящихся клеток, в процентах; процент клеток на разных стадиях митоза; ядрышковую активность - как число клеток с определенным числом ядрышек ( от 1 до 12). Возрастание количества клеток с большим числом ядрышек рассматривали как повышение ядрышковой активности и возрастание количества клеток с меньшим числом ядрышек как снижение ядрышковой активности. При подсчете ядрышек в клетках учитывали и их размер. Для этого вначале определяли цену одного деления ОКМ - окулярмикрометра, совмещая объект микрометр (ОБМ) с окулярмикрометром, вставленным в окуляр микроскопа, и рассчитывали сколько делений окулярмикрометра умещается в одном делении объект микрометра. Затем, совмещая окулярмикрометр с диаметром ядрышка вычисляли его значение в микрометрах.
Цитогенетическое изучение сосны меловой
Проводилось цитогенетическое исследование четырех популяций сосны меловой. Типичная метафазная пластинка сосны меловой, полученная при предобработке корешка 1 % водным раствором колхицина представлена на рисунке 13. Результаты попарного сравнения показателей митотического индекса, патологии митоза, числа ядрышек в интерфазных клетках соснымеловой из Бекарюковского бора, урочищ Ржевка, Шебекино Белгородской области и Острогожска Воронежской области представлены в таблице 2.
Наибольшая митотическая активность у сосны меловой отмечалась в 9 часов утра по зимнему времени. Митоз четырехфазный, завершающийся цитокинезом. Как показывают данные таблицы, по митотическому индексу между популяциями сосны меловой достоверных различий не установлено. По числу и спектру нарушений в митозе также не существует достоверных отличий. Для всех анализируемых популяций сосны меловой преобладающими являются следующие типы патологий митоза: опережающее движение хромосом в метафазе, задержка при расхождении хромосом в анафазе и мосты, обусловленные частичным слипанием хромосом в телофазе. Схематическое распределение спектра патологии митоза у сосны меловой представлено на рисунке 14.
Выявленные достоверные различия по ядрышковой активности между популяциями сосны меловой заслуживают особого внимания, так как выступая важным показателем, ядрышковая активность позволяет сделать предположение об уровне метаболизма клетки в целом (Челидзе, 1988; Муратова, 1993).
Образование ядрышек является морфологическим выражением активности нуклеолярных локусов. По их числу и размерам можно судить об интенсивности функционирования ядрышкообразующих районов, включающих рибосомальные гены. У сосны меловой из Ржевки модальное число ядрышек на клетку составляет 8, из Бекарюковки и Острогожска - 6, из Шебеки но - 3-4. В последнем случае можно предположить снижение уровня метаболической активности. Таким образом, у сосны на мелах наблюдалось варьирование числа ядрышкообразующих районов хромосом. Сравнительная характеристика ядрышковой активности у сосны меловой представлена на рисунке 15.
Различия между популяциями сосны меловой по признаку «ядрышковая активность» можно рассматривать как способ адаптации к специфике их экологических условий, проявляющейся в характере изменчивости этого признака в пределах нормы реакции. Модальное число ядрышек в интерфазных клетках, как правило, соответствует и модальному числу хромосом с ядрышковыми организаторами, локализованными в районах вторичных перетяжек. Ядрышки могут быть автономными и в таком случае незначительными по размерам, но могут и сливаться попарно и даже по несколько штук, принимая при этом более крупные размеры, что, однако, способствует уменьшению их общей активной поверхности и снижению уровня клеточного метаболизма. В прометафазе, представленной на рисунке 16, можно наблюдать слияние ядрышек разных хромосом.
Результаты однофакторного дисперсионного анализа межпопуляционной изменчивости сосны меловой, представленные в таблице 3, показывают достоверное влияние эдафического фактора на признак ядрышковой активности сосны меловой в пределах нормы реакции.
При обсуждении данных цитогенетических исследований необходимо учитывать, главным образом, почвенные, а также климатические условия, позволяющие судить о взаимодействиях в системе «генотип-среда».
Экологические особенности почвообразования на территории Белгородской области определяются ее положением в лесостепной и степной ландшафтных провинциях Среднерусской возвышенности.
В пределах Белгородской области на формирование почв и других компонентов ландшафта исключительно большое влияние оказали особенности литологического состава пород и эрозионный рельеф.
