Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 3
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
-
Характеристика озера Байкал 7
-
Геолого-географические характеристики района газовых 9 гидратов озера Байкал
-
Распределение метана в воде и донных осадках озера Байкал 13
-
Характеристика химического состава поровых вод донных 17 осадков озера Байкал
-
Общая характеристика микроорганизмов донных осадков 19 пресных озер и история их исследования в Байкале
-
Идентификация бактерий в донных осадках озера Байкал 23
-
Молекулярно-биологические методы исследования 26 структуры микробных сообществ
-
Определение нуклеотидной последовательности рРНК 27
-
Гибридизация рРНК с олигонуклеотидными зондами 31
ГЛАВА 2.0БЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
-
Объекты иссле
-
Физико-химическая характеристика районов исследования 39
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
-
Численность метанотрофных бактерий в районах 54 приповерхностного залегания газовых гидратов
-
Изучение морфологии бактерий, обитающих в придонной 60 воде подводного грязевого вулкана «К-2» (ст. Кукуйский каньон) методом электронной микроскопии
-
Определение видового состава микробного сообщества 64 района приповерхностного залегания газовых гидратов по данным анализа фрагментов гена 16S рРНК
-
Анализ аэробного метанотрофного сообщества озера Байкал, 79 методом анализа гена мембрансвязанной метанмонооксигеназы (ртоА)
-
Филогенетическое разнообразие архейного компонента 84 кристаллов газовых гидратов и осадков, ассоциированных с ними
-
Исследование биоразнообразия микробного сообщества в 92 районе подводного термального источника в бухте Фролиха (Северный Байкал) методом анализа последовательностей reHal6SpPHK
-
Определение таксонов некультивируемых бактерий, 100 способных активно развиваться в донных осадках при определенных условиях, методом гибридизации нативной ДНК, меченной 32Р
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 107
ВЫВОДЫ Ш
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Введение к работе
Большая часть атмосферного метана, если не весь на Земле -биогенного происхождения, и не смотря на то, что его концентрация на протяжении последних 300 лет стабильно повышалась, количество метана все таки остается на низком уровне. Существует два главных процесса поддержания баланса метана на нашей планете - метаногез и метанотрофия, осуществляемые микроорганизмами. Известные метаногены принадлежат множеству различных филогенетических групп в архейском домене (архебактерии), царстве эуриархеот, большинство видов которых строго анаэробны. Метанотрофия осуществляется двумя разными способами, аэробным и анаэробным и различными группами микроорганизмов, метанотрофными представителями Proteobacteria (Малашенко и др., 1978) и метанотрофными представителями Archaea (Hoehler et al., 1994).
Озеро Байкал - является единственным пресноводным водоемом, в котором обнаружены значительные запасы гидратов метана (Кузьмин, 1998; Клерке и др. 2003). С помощью геофизических и геохимических методов определено, что они занимают обширные пространства Южной и Средней котловины Байкала, образуя, таким образом, сплошную «подошву» в донных осадках озера. К настоящему времени установлено, что байкальские гидраты состоят из СНЦ (99%), а изотопное отношение 8 С = - 60 %о указывает на его биогенное происхождение (Клерке и др., 2003). В Байкале также обнаружены районы, где из донных осадков идет высачивание минерализованных вод, насыщенных метаном (Crane et al., 1991). Источником углерода для развивающихся здесь бентосных сообществ является органическое вещество, образуемое на основе метана биогенного происхождения (Кузнецов и др., 1991; Гебрук и др., 1993).
Цель работы: Изучение биоразнообразия микробного сообщества районов залегания газовых гидратов и б. Фролиха, с использованием молекулярно-биологических методов.
Задачи исследования.
Разработать эффективные методы выделения суммарной ДНК из природных образцов донных осадков озера Байкал.
Исследовать морфологию микроорганизмов природного образца в районах грязевых вулканов с помощью световой и электронной микроскопии.
Определить численность метанотрофных микроорганизмов в районах приповерхностного залегания газовых гидратов и в районе подводного источника б. Фролиха.
Изучить разнообразие бактерий исследуемых районов методом анализа гена 16S рРНК и функционального гена ртоА.
Разработать методику идентификации некультивируемых бактерий методом гибридизации нативной ДНК, меченной Р in vivo, с байкальскими клонами.
Научная новизна. Впервые в пресноводном озере с использованием молекулярных методов исследовано сообщество микроорганизмов, ассоциированное с газовыми гидратами. На основе сравнительного анализа фрагментов гена 16S рРНК установлено, что в осадках преобладают некультивируемые формы бактерий, имеющие низкую степень гомологии с известными в мировой базе данных. Выявлено, что байкальские последовательности образуют отдельные кластеры, которые могут свидетельствовать о наличии "эндемичных" бактерий. В районе повышенных концентраций метана обнаружено большое количество морфологически разнообразных форм бактерий, спор и цист. Наличие внутри клеток внутрицитоплазматических мембран (ВЦМ) позволило идентифицировать метанотрофные бактерии. Эти результаты подтверждены данными сравнительного анализа функциональных генов-метанмонооксигеназ, присущих метанотрофным бактериям. Разработана методика детекции некультивируемых бактерий в донных осадках в конкретно-заданных условиях, минуя стадии ПЦР-анализа и клонирования. Впервые исследовано разнообразие архебактерий в донных осдаках озера Байкал, установлено наличие последовательностей, относящихся к царствам Crenarchaeota и Euryarchaeota.
Практическая значимость. Перед мировым сообществом стоит проблема поиска и использования природных источников энергии. Одним из таких источников являются газовые гидраты (ГГ). В Байкале ГГ имеют биогенное происхождение, поэтому изучение групп бактерий, обеспечивающих этот процесс, имеет большую практическую значимость. Данные по распределению различных видов микроорганизмов, в том числе метанотрофных, могут быть использованы в качестве индикаторных показателей мест разгрузки метана и мониторинга деятельности микроорганизмов. Создан банк данных последовательностей фрагментов гена 16S рРНК и гена ртоА метанотрофных бактерий, 90 из них зарегистрированы в международном EMBL-банке данных и им присвоены следующие номера: AY739914-AY739938, DQ356932-DQ356934, DQ359154-DQ359155, DQ364473-DQ364475, DQ371460-DQ371461, AY839107-AY839135, AY833517-AY833524, DQ178146-DQ17816, DQ338556.
Полученные нуклеотидные последовательности могут служить основой для конструирования зондов для гибридизации, что позволит проводить количественную оценку структуры микробного сообщества донных осадков озера Байкал.
Основные положения, выносимые на защиту: 1. В донных осадках районов грязевых вулканов и выходов метана в Байкале формируется специализированное микробное сообщество. В поверхностных слоях осадка идет активное окисление метана аэробными метанотрофными бактериями, в глубоких слоях осуществляется анаэробное окисление.
2. В донных отложениях обитают представители различных филогенетических групп, в основном они представлены некультивируемыми формами.
3. В глубоководных осадках озера Байкал обитают архебактерии, принадлежащие двум царствам - Crenarchaeota и Euryarchaeota. Большинство последовательностей байкальских архей относятся к царству Euryarchaeota.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы представлены и обсуждены на научно-практической конференции «Оценка современного состояния микробиологических исследований в Восточно-Сибирском регионе», Иркутск, 2002; всероссийской конференции «Биоразнообразие и функционирование микробных систем Центральной Азии», Улан-Удэ, 2003; на международном симпозиуме «Газовые гидраты в экосистеме Земли», 2003; международном Байкальском симпозиуме по микробиологии «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек и водохранилищ», Иркутск, 2003; конференции молодых ученых, посвященная академику М.А.Лаврентьеву, Новосибирск, 2003; международном рабочем совещании «Происхождение и эволюция биосферы», г. Новосибирск, 2005; IV Верещагинской Байкальской конференции, Иркутск, 2005; молодежной конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии, Москва 2005, ИНМИРАН.
Публикации. По результатам исследования опубликовано 18 научных работ, 2 находятся в печати.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста и состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, списка использованной литературы 120 отечественных и зарубежных источников. Диссертация содержит 13 рисунков, 15 таблиц.
