Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Физико-географическая характеристика озера Байкал 8
1.2. История изучения районов естественных нефтепроявлений на озере Байкал 10
1.3. Химический состав байкальской нефти и характеристика районов естественных нефтепроявлений на озере Байкал 13
1.4. Разнообразие углеводородокисляющих микроорганизмов в воде и донных осадках различных экосистем мира 18
1.5. Механизмы окисления углеводородов нефти микроорганизмами и ферментативные системы 24
1.6. История изучения углеводородокисляющих микроорганизмов на озере Байкале 32
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Объекты исследования и методы отбора проб 35
2.2. Методы исследований
2.2.1. Микробиологические методы исследования 37
2.2.2. Молекулярно-биологические методы исследования 39
2.2.3. Химические методы исследования 42
ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯ
3.1 Численность культивируемых углеводородокисляющих микроорганизмов в водной толще и донных осадках двух районов естественных нефтепроявлений
3.2. Естественное нефтепроявление у устья р. Б. Зеленовская 44
3.3. Естественное нефтепроявление у м. Горевой Утес
ГЛАВА 4. Молекулярно-генетическая идентификация углеводородокисляющих микроорганизмов в районах нефтепроявлений
4.1. Филогенетическое разнообразие культивируемых углеводородокисляющих микроорганизмов двух районов естественных нефтепроявлений по данным анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов гена 16S рРНК 65
4.2. Филогенетическое разнообразие природных микробных сообществ в двух районах естественных нефтепроявлений по данным анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов гена рРНК 83
4.2.1. М. Горевой Утес 84
4.2.2. Устье р. Б. Зеленовская 97
4.3. Исследование alk генов у культивируемых углеводородокисляющих микроорганизмов 105
ГЛАВА 5. Роль микроорганизмов в биодеградации нефти
5.1. Деградация нефти и ее компонентов в лабораторных условиях чистыми культурами 112
5.2. Деградация нефти и ее компонентов в экспериментах природным микробным сообществом 117
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 124
ВЫВОДЫ 126
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 128
ПРИЛОЖЕНИЯ 149
- История изучения районов естественных нефтепроявлений на озере Байкал
- Объекты исследования и методы отбора проб
- Естественное нефтепроявление у устья р. Б. Зеленовская
Введение к работе
Актуальность исследований. Известно, что решающую роль в трансформации нефти до простых соединений выполняют микроорганизмы (Квасников, Клюшникова, 1981; Барышникова и др., 2001; Назина и др., 2002; Head et al., 2006; Muyzer et al., 2008), многие из которых способны разрушать углеводороды. Углеводородокисляющие микроорганизмы (УВОМ) широко распространены в природе, их пищевые потребности разнообразны, среди них нет узкоспециализированных форм (Шлегель, 1987). В настоящее время известно, что, по крайней мере, 79 родов бактерий, 9 родов цианобактерий, 103 рода грибов и 14 родов водорослей способны использовать нефть и ее производные в качестве единственного источника углерода и энергии (Head et al., 2006).
На озере Байкал различными методами идентифицированы грязевые вулканы, метановые и нефтяные сипы (Кузьмин и др., 1998; Клеркс и др., 2003; Конторович и др., 2007; Хлыстов и др., 2007). По оценкам А. Э. Конторовича с соавторами (2007), ежегодно из донных осадков районов естественных нефтепроявлений в воду озера Байкал поступает от 2 до 4 т. нефти. Несмотря на то, что нефть поступает на поверхность воды непрерывно, нефтяное пятно не увеличивается, что свидетельствует о ее биодеградации (Конторович и др., 2007; Хлыстов и др., 2007а). Районы нефтепроявлений на Байкале известны с XVIII века, тем не менее, исследования естественного микробного сообщества озера проводились лишь эпизодически (Талиев и др., 1985; Гоман и др., 1986; Петрова, Мамонтова, 1986; Павлова и др., 2008).
В связи с этим весьма актуально изучение распространения и определение численности УВОМ в комплексе с другими группами бактерий, а также исследование видового разнообразия микробного сообщества в разных по времени источниках формирования нефти и наличие ферментативных систем, обеспечивающих деградацию н-алканов в ультрапресном озере.
Цель работы: исследовать пространственно-временную и молекулярно-генетическую структуру микробных сообществ в двух районах естественных нефтепроявлений на озере Байкал и оценить их способность к биодеградации н-алканов нефти.
Задачи:
1. Исследовать численность и распределение УВОМ способных использовать в качестве единственного источника углеводородов нефть и н-алканы в районах естественных выходов нефти на озере Байкал.
2. Изучить молекулярно-генетическое разнообразие культивируемых аэробных микроорганизмов, выделенных из воды и донных осадков и суммарного микробного сообщества в двух районах естественных нефтепроявлений на озере Байкал с использованием анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов гена 16S рРНК.
3. Оценить способность природного микробного сообщества и чистых культур байкальских микроорганизмов, изолированных из воды м. Горевой Утес деградировать н-алканы нефти в условиях лабораторного моделирования.
4. Исследовать у чистых культур аэробных бактерий наличие alk генов, обеспечивающих биодеградацию углеводородов с определенной длиной цепи.
Научная новизна. Впервые исследована численность микроорганизмов, способных деградировать нефть и н-алканы в районах естественных выходов нефти на озере Байкал. Установлено, что как в водной толще, так и в донных осадках по численности среди культивируемых микроорганизмов доминируют УВОМ. Показано, что распределение УВОМ определяется концентрацией углеводородов в воде и донных осадках.
Впервые исследована генетическая структура природного микробного сообщества в двух районах естественных нефтепроявлений на озере Байкал. Среди культивируемых бактерий выявлены представители следующих родов: Pseudomonas, Bacillus, Brevibacillus, Paenibacillus, Micromonospora, Acinetobacter, Rhodococcus, Sphingomonas, Mycobacterium, Bosea, Micrococcus, Microbacterium, Aeromonas, Kocuria, Enterobacter, Arthrobacter, Novosphingobium, Methylobacterium, Curtobacterium, Acidovorax, Acinetobacter. А также некультивируемые представители филумов: Clorobi, Chloroflexi, Acidobacteria, Nitrosirae, Bacteroides, Actinobacteria, Proteobacteria, Firmicutes, Verrucomicrobia, Planctomycetes. Анализ нуклеотидных последовательностей alk генов показал, что у исследованных культивируемых УВОМ содержаться гены представителей р. Rhodococcus, ответственные за деградацию широкого спектра алканов.
В лабораторных условиях подтверждена способность чистых культур и природного микробного сообщества окислять н-алканы нефти.
Практическая значимость. Полученные данные свидетельствуют о способности микробного сообщества участвовать в биодеградации нефти и ее производных, что позволило оценить степень воздействия нового нефтепроявления на экосистему озера Байкал. Сформирована коллекция УВОМ, выделенных из двух районов нефтепроявлений, которая может быть использована в процессах биоремедиации. Результаты, данные по исследованию alk генов у культивируемого микробного сообщества, могут быть использованы для понимания механизмов окисления нефти и ее производных в природных экосистемах и при создании биотехнологических препаратов.
Положения, выносимые на защиту:
1. В районах естественных нефтепроявлений на озере Байкал обитает динамичное микробное сообщество, способное использовать углеводороды нефти в качестве единственного источника углерода и энергии. Состав культивируемого микробного сообщества в давно известном районе нефтепроявления отличается большим генетическим разнообразием представленных родов бактерий в сравнении с новым районом, где нефть является не биодеградированной.
2. Чистые культуры аэробных микроорганизмов, выделенные из водной толщи и донных осадков и природное микробное сообщество, способны окислять н-алканы нефти в лабораторных условиях. УВОМ, выделенные из районов естественных нефтепроявлений, имеют различный набор alk генов, ответственных за деградацию нефти
Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на следующих конференция и симпозиумах: II международном Байкальском микробиологическом симпозиуме «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек и водохранилищ» (Иркутск – п. Листвянка, 2007); международном симпозиуме «Контроль и реабилитация окружающей среды: КРОС – 2008» (Томск, 2008); Научно-практическом семинаре молодых ученых и специалистов, приуроченном к проведению технологической экспедиции ООО 'ВНИИГАЗ' 'Байкальские гидраты' (Иркутск – п. Листвянка, 2008); XIX Гольдшмидт конференции (Давос, Швейцария, 2009); X съезде Гидробиологического общества при РАН (Владивосток, 2009), XVIII Международной школе морской геологии «Геология морей и океанов» (Москва. 2009). По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ, из них 2 статьи в рецензируемых журналах.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзорного анализа литературы, трех глав, изложенных на основании собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы (173 источников, из них 93 - зарубежных). Объем работы составляет __ страниц машинописного текста, включающего 13 таблиц, 43 рисунка.
Автор выражает благодарность и искреннюю признательность научному руководителю д.б.н. Земской Т. И., за постановку задач и помощь в проводимых исследованиях, а также к.б.н. Павловой О. Н., к.б.н. Шубенковой О. В., к.б.н. Черницыной С. М., к.х.н. Горшкову А. Г., Иванову В. Г., к.б.н. Морозову И. В., Хлыстову О. М., пилотам ГОА «Мир» за отбор проб воды и донных осадков, Фонду содействия сохранению озера Байкал и всем сотрудникам лаборатории водной микробиологии за оказанную помощь при выполнении работ.
Работа выполнена при финансовой поддержке Интеграционных проектов СО РАН № 27, 58, программ Президиума РАН 18.10, 17.9, гранта РФФИ 08-05-00709-а.
История изучения районов естественных нефтепроявлений на озере Байкал
В литературе первые сведения о находках нефти на Байкале появились в работах И. Г. Георги (1772-1773 гг.). Позднее И. Г. Гмелиным были описаны выходы нефти вдоль восточного берега оз. Байкал. Далее эти нефтепроявления описывали А. Л. Чекановский (1869-1871) и И. Д. Черский (1877-1880). (Ломоносов, 2003).
В начале XX века поиски нефти на восточном берегу озера Байкал проводил В. Д. Рязанов (1902-1903, 1908гг.). Им в 1902-1903 г. были отмечены многочисленные выходы газа и признаки нефти в виде восстановленных пленок на воде, озокерита и битумов вдоль юго-восточного побережья от станции Боярская до Чивыркуйского залива (Рязанов, 1928). В Селенгинском районе разведочные работы на нефть были возобновлены в 1907 г. и продолжались до 1909 г., на участках Ключи-Столовая. Здесь было пройдено 6 скважин с максимальной глубиной до 90 м. В скважине 1 в верхних слоях озерных отложений были обнаружены признаки нефти, газов и пластовая залежь озокерита. Скважина 2 в озерных отложениях, представленных песками и глинами, вскрыла несколько горизонтов, содержащих газ. В 1917-1918 гг. на проблему байкальской нефти обратил внимание К. П. Калицкий. В дальнейшем геологические работы, связанные с байкальской нефтью, были продолжены в 1929 г. Институтом Геолкарты ГГРУ, в 1930 г. Ленинградским нефтяным институтом, а в 1931 г. трестом Востокнефть. С 1934 г. в работах принимает участие Академия наук под руководством В.А. Обручева. Результаты этих исследований были изложены в работах Г. Е. Рябухина (Рябухин, 1934 а-в). Было установлено, что между участком Ключи-Стволовая и м. Толстый, на протяжении 14 км в озере Байкал на различном расстоянии от берега имеются многочисленные выходы нефти, сосредоточенные в группы. Наиболее известны две группы выхода нефти: напротив устья р. Стволовая на расстоянии 500 м от берега и напротив pp. Б. и М. Зеленовских, вблизи м. Толстого на расстоянии 1500 м от берега. Исследования показали, что в этих районов в год выделяется не менее 15 т. нефти, с удельным весом 0,965.
В 1934 г. в районе д. Посольск была пробурена скважина глубиной 1000 м. С глубины 876 м началась нефтеносная толща, состоящая из крепких песчаников и темных глин с запахом керосина, из которых удалось извлечь до 0,2% нефти (Ломоносов, 2003).
Позднее, описанию байкальских битумопроявлений были посвящены работы Э. Ю. Березовского, А. Арсентьева, Г. Е. Рябухина и других исследователей. В. А. Успенский, А. И. Горская, Ю. Н. Петрова, В. К. Шиманский изучали состав собранных проб нефтей и озокеритов (1940 гг.).
В предвоенные годы поисками нефти на восточном берегу Байкала занимались Г. Ю. Верещагин, Г. Е. Рябухин, И. В. Высоцкий, С. П. Ситников, Л. С. Петрова, Н. С. Шацкий. Впервые послевоенные годы изучением нефтеносности Байкала и забайкальских впадин занимались Г. Е. Рябухин, Е. В.. Кравченко, В. Г. Васильев, С. Г. Саркисян, А. И. Левин (Конторович и др., 2003).
В 50-е года с применением глубоководного бурения под руководством В. В. Самсонова проводится изучение нефтеносности Селенгинской депрессии. При бурении на больших глубинах, достигавших 3000 м, неоднократно обнаружились пленки нефти, растворенный и спонтанный газ (Самсонов, 1959; 1963).
Суммируя результаты многолетних нефтегазопоисковых работ на восточном побережье Среднего Байкала, было установлено, что здесь распространены нефть, газы и битумы разнообразного состава (Ломоносов, 2003).
В. Г. Пуцилло и С. И. Миронов (1958), при углубленном химическом изучении байкальских нефтей и озокеритов пришли к заключению, что нефти Байкала генетически связаны между собой, но озерные озокерита не родственны им. Байкальская нефть по химическому составу отличается от битума, обнаруженного в мезозойских отложениях близи Гузинского озера в Забайкалье и по своей природе отличается от нефти из меловых отложений Монголии. Не были найдены сходства байкальской нефти и нефти из кембрийских отложений Сибирской платформы.
Восточное побережье Байкала на участке от дельты р. Селенги до Баргузинского залива - район наиболее значительных и известных нефтегазопроявлений, которые привлекают до настоящего времени исследователей Байкала (Ломоносов и др., 2003). В Байкальской впадине выявлены выходы битуминозных песчаников миоценового возраста у ст. Танхой, всплывание нефти подо льдом в районе Ольхонских Ворот, выделение горючего газа в Змеином, Котельниковском и других термальных источниках на побережье озера Байкал. С. Д. Талиевым и Н. И. Бескровным, С. Д. Талиевым и Т. Е. Афониной (1986) обнаружены неизвестные ранее выбросы и выходы нефти в Малом Море, которые находятся на коренном берегу в районе р. Зундук.
О насыщении углеводородными соединениями толщи донных осадков впадины озера Байкал свидетельствуют и последние данные, полученные в период с 1996 по 1999 гг. в ходе реализации Международного проекта «Байкал-Бурение» (Кузьмин и др., 2001) при опробовании глубоководных скважин (до 600 м) в средней и южной котловинах озера.
С 2004 г. Лимнологическим институтом СО РАН проводятся исследования района естественного нефтепроявления расположенного вблизи р. Б. Зеленовская (м. Толстый) в контакте с сотрудниками Института нефтегазовой геологии и геофизики СО РАН (г. Новосибирск) и Института геохимии СО РАН (г. Иркутск).
В 2005 г. в глубоководных условиях озера Байкал обнаружено новое естественное нефтепроявление, по всем параметрам отличающееся от известных ранее. Это нефтепроявление (Средний Байкал, мыс Горевой Утес) было обнаружено при анализе спутниковых наблюдений весной 2003 г., с помощью которых на льду Байкала было обнаружено темное пятно нефти диаметром 1 км" (Хлыстов и др., 2007 а). Особенностью этого нефтепроявления, в отличие от описанных ранее, является испарение легких фракций, вследствие чего ощущался запах бензина, в водной толще на глубинах 900-500 м регистрировалась газовая струя, оказывающая существенное влияние на режим нефтепроявления. В результате холодного «кипения» на поверхности воды отмечалась пена из волосовидных кристаллов парафинов желтого цвета (Конторович и др., 2007).
Объекты исследования и методы отбора проб
Материалами для диссертации послужили пробы воды и донных осадков, которые были отобраны в экспедициях с 2004 по 2008 гг. в двух районах естественных нефтепроявлений на озере Байкал - в районе устья р. Б. Зеленовская (1 км от побережья; 70 км севернее дельты р. Селенга; координаты 5238 12" с.ш., 10721 10" в.д.) и у м. Горевой Утес (10 км от берега, глубина 900 м, Средний Байкал; координаты 5318 33" с.ш., 10823 46" в.д.) (табл. 1, рис. 4).
Отбор проб. Водные образцы отбирали с водной поверхности, покрытой нефтяной пленкой и свободной от нее, а также с глубины 50, 25, 100, 150, 500 м и придонного слоя батометрами с помощью Rosetta по стандартной методике (Романенко, Кузнецов, 1974). Отбор осадков осуществляли с помощью гравитационной трубы (GC) с пластиковым вкладышем, бентосной трубкой (ВС) и дночерпателем «Океан» (Gr). Осадок из срединной части керна отбирали асептически и помещали в стерильные пакеты в жидкий азот до проведения молекулярных анализов в лаборатории. Часть пробы донных осадков использовали для учета численности и изолирования чистых культур УВОМ непосредственно в лаборатории на судне.
В 2008 г. кроме стандартных пробоотборников для получения образцов были использованы глубоководные обитаемые аппараты «Мир-1» и «Мир-2». Для молекулярных и микробиологических исследований в ходе погружений были отобраны образцы воды и донных осадков непосредственно в местах разгрузки нефти и газа, а также битумные постройки и нефть.
Для исследования численности УВОМ в районах естественных нефтепроявлений использовали минеральную среду следующего состава, г/л: КН2Р04 - 2; СаСЬ х 2Н20 - 0,01; MgS04 7Н20 - 0,2; FeS04 - 0,01; NH4NO3 - 2; MnS04 х 5Н20 - 0,02; Na2HP04 - 3; Na2C03 - 0,1; рН 7,2. В качестве единственного источника углерода использовали стерильную нефть и алканы СюН22, Ci2H26, Ci6H34 (Raymond, 1961), 1 мл которых растирали по поверхности агаризованной среды. Учет органотрофных микроорганизмов проводили на рыбо - пептоном агаре, разбавленном в 10 раз (Горбенко, Дзюбан, 1992). Для определения численности микроорганизмов в донных осадках готовили суспензию, перемешивая 1 г донных отложений в 100 мл стерильной дистиллированной воды в течение 30 мин в колбах объемом 200 мл. Затем 1 мл исследуемой суспензии заливали охлажденной средой Раймонда. В 2008 г. в донных осадках естественного нефтепроявления м. Горевой Утес исследовано распределение анаэробных УВОМ. Для учета численности анаэробных УВОМ в донных осадках 1 г пробы суспендировали в 20 мл дистиллированной воды и пропускали суспензию через фильтр с размером пор 0,45 мкм. Затем фильтр помещали на минеральную среду и инкубировали при 22С в бескислородных условиях, используя пакеты (HiMedia Laboratories Pvt. Ltd, HiAnaeroGas Pack).
Родовой состав выделенных аэробных УВОМ устанавливали на основании их морфологических признаков (определитель Берджи, 1997). Всего было выделено 218 штаммов (67 штаммов из района устья р. Б. Зеленовская и 151 штамм из района у м. Горевой Утес), у которых были исследованы следующие характеристики: размер и форма клеток, окраска по Граму, наличие спор, мицелия в соответствии с методиками (Родина, 1965; Романенко, Кузнецов, 1974). Из них для молекулярно-биологических исследований было отобрано 69 штаммов, различающихся по вышеуказанным признакам с целью выявления большего микробного разнообразия.
В районе м. Горевой Утес суммарная ДНК была выделена из 2 слоев осадка, насыщенных нефтью: из поверхностного окисленного слоя (0-5 см) и из восстановленного слоя (180-190 см). Для молекулярного анализа использовали универсальные эубактериальные и архейные праймеры. Из этих образцов ДНК было получено 178 клонов, для 87 из них определены нуклеотидные последовательности фрагментов гена 16S рРНК длиной от 850 до 1300 пар нуклеотидов (п.н.).
Естественное нефтепроявление у устья р. Б. Зеленовская
Колебания численности микроорганизмов в воде и осадках озера Байкал тесно связаны с гидрологическими, гидрохимическими и гидробиологическими режимами. По литературным данным известно, что общая численность бактерий в водной толще озера Байкал варьировала от сотен тысяч клеток в мл воды до нескольких миллионов, а в донных осадках достигала нескольких миллиардов клеток на грамм влажного грунта (максимум - до 3,5 млрд кл/г), она менялась в зависимости от литологического состава и места отбора осадков. В воде и донных осадках Байкала обнаружены бактерии различных физиологических групп, участвующих в циклах углерода, азота и фосфора: сапрофитные, целлюлозоразрущающие, углеводородокисляющие, бродильные, метанобразующие, метанокисляющие, тионовые и др. (Гоман и др., 1986; Парфенова, Верхозина, 1986; Намсараев и др., 1995; Парфенова и др., 2006; Павлова и др., 2008). В воде крупных притоков озера Байкал (pp. Баргузин, В. Ангара, Кичера, Селенга) количество УВОМ составило 80 - 200 кл/мл (Дрюккер, 1986).
Нами исследовано пространственное распределение культивируемых УВОМ, выращенных на 4 различных источниках углеводородов (нефть, декан, додекан и гексадекан) и органотрофных микроорганизмов.
Естественное нефтепроявление у устья р. Б. Зеленовская Водная толща. В 2004 г. в районе устья р. Б. Зеленовская пробы воды были отобраны на 9 станциях, причем две станции (St2 и 3) находились в зоне нефтяных пятен. При исследовании общей численности УВОМ и органотрофов в пробах воды данного района было установлено, что максимальные показатели характерны для зоны нефтяной пленки. На рисунке 10 представлены данные по
В 2005 г. исследования численности УВОМ и органотрофов было осуществлено на 1 станции. В 2005 г. наблюдалось снижение численности УВОМ по сравнению с предыдущим годом исследования. Так, в поверхностном слое воды выявлено до 20 кл/мл УВОМ и незначительное увеличение всех исследованных групп микроорганизмов в трофогенном слое, на глубине 25-50 м где, как известно, отмечается наиболее высокая численность и биомасса фитопланктона (Поповская, Белых, 2003). Это согласуется с данными Т. V. Ramachandra с соавторами (2009), которые считают, что диатомовые водоросли являются главными составляющими в образовании некоторых н-алканов нефти
Численность микроорганизмов, кл/мл Вертикальное распределение орагнотрофных бактерий и бактерий, использующих различные углеводороды, в водной толще устья р. Б. Зеленовская (2005 г.)
В придонном слое водной толщи численность УВОМ и органотрофов в у устья р. Б. Зеленовская варьировала от 120 кл/мл до 645 кл/мл (рис. 6). В 2005 г. в этом районе нефтепроявления среди УВОМ в поверхностном и придонном слое воды доминировали микроорганизмы, деградирующие нефть. В 2006 г. вода у устья р. Б. Зеленовская была отобрана на 5 станциях. Наибольшее количество УВОМ (до 200 кл/мл) отмечено в поверхностном слое воды, отобранной на расстоянии до 1 км от берега (глубина 158 м). С глубиной, численность УВОМ снижалась до единичных клеток в мл (рис. 7 а). В пробах воды, отобранных на расстоянии 2 км от берега (глубина 600 м), УВОМ выявлены на всех горизонтах, с максимумом (для данной станции) в поверхностном слое воды - 210 кл/мл, микроорганизмов окисляющих додекан (Сі2Н2б) (рис. 7 б). В поверхностном слое воды, на станции, которая находится непосредственно вблизи от выхода нефти, доминировали микроорганизмы, использующие в качестве субстрата нефть, а в придонном слое - дексадекан
Вертикальное распределение углеводородокисляющих микроорганизмов в водной толще устья р. Б. Зеленовская на мелководной станции (а) и глубоководной (б) (2006 г.)
Численность органотрофных микроорганизмов в 2006 г. составила 1610 кл/мл для поверхностного слоя и 547 кл/мл для придонного слоя воды.
В 2007 г. отбор проб воды, в районе устья р. Б. Зеленовская, был осуществлен на четырех станциях. Распределение микроорганизмов в водной толще представлено на рисунках 8 (а, б).
