Содержание к диссертации
Введение
2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
2.1 Действие низкой температуры на организм 10
2.2 Адаптация растений к низким температурам 13
2.3 Антифризные белки растений 16
2.4 Индуцируемые закаливанием белки водорослей... 18
2.5 Молекулярные шапероны и дегидрины. 19
2.6 Разобщающие белки .24
2.7 Молекулярные и физиологические механизмы адаптации рыб к обитанию в условиях пониженной температуры 31
2.7.1 Физиологическая адаптация обмена веществ рыб31
2.7.2 Антифризные белки рыб 36
3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 45
3.1 Особенности температурного режима байкала 45
3.2 Объекты исследования 48
3.2.1 Биологическая характеристика исследуемых злаковых растений 48
3.2.2 Биологическая характеристика исследуемых высших водных растений 49
3.2.3 Биологическая характеристика исследуемых эндемичных байкальских рыб 51
3.3 МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 60
3.3.1 Выделение белка 60
3.3.2 Иммунохимические методы. 61
3.3.3 ЭлектроцЬоретическиеметоды. 64
4 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 6&
4.1 ПОИСК БЕЛКОВ, ИММУНОХИМИЧЕСКИ РОДСТВЕННЫХ СТРЕССОВОМУ БЕЛКУ ОЗИМОЙ РЖИ 68
4.1.1 Идентификация и определение характеристик белков, иммунохимически родственных БХШ 310 среди цитоплазматических белков ряда культурных и дикорастущих злаков 69
4.1.2 Поиск белков, иммунохимически родственных стрессовому белку озимой ржи 310 кД, у водных растений 77
4.1.3 Поиск белков, иммунохимически родственных стрессовому белку озимой ржи 310 кД, в спектрах нативных белков эндемичных байкальских рыб 80
4.1.4 Поиск белков, иммунохимически родственных стрессовому белку озимой ржи 310 кД, в спектрах денатурированных белков эндемичных байкальских рыб. 83
4.2 Поиск белков, иммунохимически родственных термостабильным (дегидриноподобным) белкам растений у адаптированных к низкой температуре байкальских рыб 86
4.2.1 Поиск белков, иммунохимически родственных термостабильным (дегидриноподобным) белкам растений в спектрах нашивных белков адаптированных к низкой температуре байкальских рыб. 87
4.2.2 Поиск белков, иммунохимически родственных термостабильным (дегидриноподобным) белкам растений в спектрах денатурированных белков адаптированных к низкой температуре байкальских рыб. 89
5 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 93
6 ВЫВОДЫ 97
7 ЛИТЕРАТУРА 99
- Адаптация растений к низким температурам
- Биологическая характеристика исследуемых высших водных растений
- Идентификация и определение характеристик белков, иммунохимически родственных БХШ 310 среди цитоплазматических белков ряда культурных и дикорастущих злаков
Введение к работе
Проблема адаптации организмов к температурным условиям их среды обитания уже давно привлекает внимание исследователей. С одной стороны, интерес ученых к этой проблеме объясняется тем, что температурный фактор в значительной степени определяет развитие растений и лимитирует распространение ценных в хозяйственном отношении видов растений. С другой стороны, изучение биоразнообразия способов адаптации животных, в частности, адаптированных к низким температурам видов эндемичных байкальских рыб, позволяет более глубоко понять механизмы температурной адаптации организмов.
Активная жизнь бионтов возможна во всем диапазоне температур, в пределах которого вода сохраняет жидкое состояние (Александров, 1975). Согласно современным представлениям, поддержание векторного гомеостаза метаболических функций организмов, обитающих в таком диапазоне температур достигается путем сочетания трех основных типов биохимических адаптации (Hochachka, Somero, 1973):
изменение типа макромолекул;
изменение концентрации макромолекул;
адаптивная регуляция функций макромолекул. Универсальность клеточной реакции на стресс путем синтеза
новых полипептидов указывает на ее фундаментальность, а разнообразие факторов, индуцирующих этот синтез, говорит о
существовании единой системы восприятия и преобразования сигналов.
К настоящему времени известно много способов адаптации
организмов к действию низких температур. Это и накопление в
тканях и тканевых жидкостях определенных криопротекторных
веществ, в частности, Сахаров, и изменения в оптимумах
активностей ферментов, и изменения свойств клеточных мембран.
Относительно недавно, в 70-е - 80-е годы, был открыт еще один
защитный механизм, связанный с синтезом так называемых
адаптационных и стрессовых белков. Б ходе его изучения было
установлено, что синтез белка в клетках многих организмов быстро
и значительно изменяется под действием внешних условий (Nover et
al., 1984; Войников и др., 1985а; Войников и др., 19856; Войников и
др., 1987). Этот факт, а также хорошо изученный феномен ответа на
тепловой шок у насекомых (Ashburner, Bonner, 1979) позволили
предполагать, что изменения в синтезе мРНК и белков являются
результатом индукции определенных генетически
детерминированных регуляторных механизмов. Действительно, повышение окружающей температуры вызывает как в клетках дрозофилы (Ashburner, Bonner, 1979), так и в клетках других организмов (Baszczynsky et al., 1982; Lin et a!., 1984; Minton et ai., 1982) прекращение (или уменьшение) синтеза «нормальных» полипептидов и индуцирует (или усиливает) синтез ряда новых полипептидов, получивших название белков теплового шока (Nover et ai., 1984; Войников и др., 1984; Корытов и др., 1986; Корытов и др., 1987). Показано, что их появление является результатом изменения
экспрессии соответствующих генов (Peiham 1985). Обнаружение белков теплового шока открыло пути к изучению и пониманию генетических и биохимических механизмов термотолерантности клеток. В то же время не только повышение температуры, но и гипотермия (Leenders et al., 1974) приводит к изменению экспрессии генов и, как следствие, к синтезу стрессовых белков, повышающих адаптивные возможности организмов к существованию в условиях низкой температуры среды обитания. К сожалению, в настоящее время изучение этих защитных механизмов происходит в основном на модельных организмах, таких, как Esherichia coii, Arabidopsis, Drosofila melanogaster. Крайне мало изучаются адаптированные к экстремальным температурным условиям дикорастущие растения и эндемичные животные.
Наиболее изученными являются белки холодового шока у злаковых растений. Белки холодовой адаптации байкальских рыб и водных ангарских макрофитов не изучены вообще. Водные макрофиты (элодея канадская, роголистник темно-зеленый), произрастающие в заливах реки Ангара, по своей биологии и температурному режиму обитания сходны со своими сородичами, растущими в мелководных, хорошо прогревающихся летом и почти промерзающих зимой заливах Байкала. Эти водные растения являются эвритермными и могут существовать в широком температурном диапазоне. Поэтому, учитывая их эвритермность, логично предположить, что у них в процессе эволюции сформировались определенные биохимические механизмы адаптации к сезонным перепадам температур. Исходя из этого, для
более глубокого понимания процессов адаптации организмов было важно установить, имеются ли у элодеи канадской и роголистника темно-зеленого белки, обеспечивающие их выживание в низкотемпературных условиях. Б связи с этим задачей данного исследования было обнаружение белков, иммунохимически родственных белку холодового шока с молекулярной массой 310 кДа (БХШ 310) озимой ржи, а также изучение полиморфизма этих белков у ряда злаков, различающихся по холодоустойчивости, а также у водных растений. Исследовался также вопрос, связано ли присутствие в спектрах растительных нативных белков БХШ 310 и белков его семейства с холодоустойчивостью растений.
Байкальские эндемичные рыбы - стенотермные организмы, они могут обитать в довольно узком интервале температур. Действительно, эндемики, живущие в Байкале, эволюционно максимально адаптированы к температурному режиму этого глубоководного озера. Учитывая, что в настоящее время учеными найдены специфические адаптационные белки арктических и антарктических рыб, а также активно изучаются механизмы их синтеза и функции данных белков, очень важно провести поиск и изучение адаптационных белков, которые могут синтезироваться организмами байкальских рыб. Данный вопрос может также представлять определенный интерес в связи с изучением биоразнообразия байкальской эндемичной ихтиофауны.
К тому же необходимо отметить, что изучение белков холодовои адаптации у представителей различных царств проводится практически независимо друг от друга. Одним из
немногих примеров поиска аналогий и гомологии между стрессовыми белками разных царств живой природы является открытие коллективом авторов (Gilmour et ai., 1992; Kurkela, Borg-Franck, 1992) в растениях генов, которые кодируют полипептиды, гомологичные антифризным белкам арктических рыб. Современная наука переживает небывалый подъем в области применения биотехнологических методов. Фундаментальные знания, получаемые в ходе исследований ученых, практически сразу же ставятся на службу народному хозяйству. Например, в мировой науке активно применяются методы трансгенных технологий, при помощи которых в геном картофеля вводят гены антифризных белков рыб, идентичных растительным антифризам, в результате чего у растений повышается толерантность к действию ранее губительных низких температур (Fietcher et al., 1999). Поэтому, учитывая научную и практическую важность этой проблемы, еще одной задачей был поиск у эндемичных байкальских рыб белков, иммунохимически родственных недавно открытым стрессовым (БХШ 310) и термостабильным (дегидриноподобным) белкам растений.
Целью настоящего исследования было путем применения биохимических методов установить присутствие в организмах растений и рыб адаптационных белков, играющих важную роль в защите от низких температур, а также изучить возможность существования общих механизмов термотолерантности у адаптированных к низким температурам рыб и растений.
2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Адаптация растений к низким температурам
Увеличение холодоустойчивости растений при холодовом закаливании является результатом сложных физиологических и биохимических процессов, которые протекают под контролем геномов клеток. Имеется достаточно много сведений (Холодостойкость растений, 1983) о целом ряде изменений в физиологии, метаболизме или энзиматическои активности клеток растений, у которых была индуцирована холодоустойчивость при снижении температуры. Предполагается, что непосредственный контроль за этими изменениями осуществляется генетическими системами через синтез белков, который значительно изменяется под влиянием температуры (Nover et al., 1984).
Эффект адаптации растений к неблагоприятным температурным условиям обеспечивается различными биохимическими механизмами, в частности, при действии низкой температуры происходит синтез ряда групп стрессовых белков (Abromeit et at., 1992; Crosatti et at., 1994; Houdte et al., 1992). В последние годы различными исследователями (Houde et al., 1995; Griffith et al, 1997; Gllmor etal., 1996) установлено, что синтез этих белков играет важную роль в приобретении растением устойчивости к действию неблагоприятного температурного фактора путем включения различных защитных механизмов, в частности, синтеза определенных белков, предохраняющих макромолекулы от повреждения при обезвоживании (синтез дегидринов), а также механизмов, защищающих клетки растения от повреждения кристаллами льда при замерзании внеклеточной воды (синтез аллопластных белков) и некоторых других.
В то же время в исследованиях реакции растения на температурный стресс обычно используется SDS-электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ), хотя он обладает рядом ограничений. Например, он не дает информацию о том, в составе какого нативного белка находится тот или иной полипептид, не позволяет регистрировать изменения, касающиеся структурной перестройки белков, посттрансляционной модификации, ассоциации и диссоциации субъединиц нативных белков. Между тем, эти изменения в структуре полипептидов могут быть весьма важной частью реакции растения на низкотемпературный стресс.
В настоящее время вызывает большой интерес и активно исследуется вопрос об изменении экспрессии соответствующих генов в клетках растений при гипотермии, что ведет к пониманию генетических и биохимических механизмов холодоустойчивости растений. Ранее было показано, что низкотемпературный стресс вызывает изменения в содержании ряда белков у злаковых растений (Войников и др., 1985а; Войников и др., 19856; Корытов, Калачева, 1987).
Известно, что длительное (от одной до нескольких недель) низкотемпературное закаливание растений приводит к синтезу специфических полипептидов (Guy et al., 1985). В дополнение к этому в работе В.К. Войникова с соавторами показана принципиальная возможность индукции образования стрессовых белков в растительных клетках при непродолжительной гипотермии (Войников и др., 1987). Это свидетельствует о довольно быстром вовлечении генетических систем растительных клеток в ответную реакцию на действие низкой температуры.
Ранее было установлено, что охлаждение (5 С, 1 неделя) растений мягкой пшеницы приводит к индукции (или увеличению) синтеза ряда полипептидов (Войников и др., 19856). Предполагается, что это связано с изменением экспрессии генов. Поскольку обнаруженные изменения происходят во время закаливания озимой пшеницы к холоду, можно предполагать, что вновь синтезированные белки имеют отношение к признаку холодоустойчивости растений.
Известно, что холодо- и морозоустойчивость растений развиваются в ходе закаливания (Холодостойкость растений, 1983) и генетически детерминирована (Синиговец и др., 1979).
Биологическая характеристика исследуемых высших водных растений
Пелагические бычковая рыба, живет преимущественно в прибрежной части открытого озера, в южной и средней частях Байкала. В вертикальном направлении желтокрылка распределяется от прибрежья до глубин в 300 м, лишь изредка отдельные особи отлавливаются на глубинах 400-450 м. Так как желтокрылка является пелагической рыбой, ярко выраженной приуроченности к грунтам у нее не наблюдается. Тем не менее несколько более многочислен этот вид на песчаных, песчанисто-каменистых и илистых грунтах; на участках же с крупнокаменистым дном желтокрылка встречается несравненно реже. Вертикальное распределение этого вида в основном зависит от времени года. В весенний период как нерестующие косяки, так и нагульные стаи желтокрылки встречаются на мелководье (от прибрежья до глубин 40-50 м). Летом при прогревании прибрежных слоев воды свыше 10С, желтокрылка на мелководье обычно отсутствует; в это время она отходит на глубины 100-300 м и держится там распыленно, совершая лишь правильные суточные миграции: в дневное время находится у дна, в ночные часы поднимается в толщу воды (Остроумов и др., 1998). Осенью при понижении температуры прибрежной воды до 8С небольшие нагульные стайки желтокрылки вновь появляются у берегов, придерживаясь, однако, глубин не менее 5-8 м. В начале зимы основные стаи этого вида придерживаются 70-200 м глубины.
На нерестовых площадях первые стайки желтокрылки появляются уже в конце января или в первых числах февраля. Постепенно их количество нарастает, и если в том или ином районе в данный год происходит интенсивный нерест ранее созревающих стай, то уже в половине марта наблюдается массовый ход, который продолжается до конца месяца. Затем количество рыбы на нерестилищах резко сокращается, и новый максимальный подход происходит в середине мая. К началу июня он обычно заканчивается, и в течение всего июня, даже июля, наблюдаются лишь небольшие подходы наиболее молодых генераций этого вида. С момента вымета самкой икры и до выхода из нее личинок кладку охраняет самец. Охраняющие кладки самцы, как правило никуда от них не отходят и не питаются, поэтому они очень сильно истощаются, становятся вялыми и мало реагируют на внешние воздействия. Многие самцы после выхода личинок из икры погибают. Однако в годы с меньшим количеством ветров и, следовательно, с более ранним прогреванием воды на нерестовых площадях, гибель самцов желтокрылки после размножения имеет более массовый характер.
Пища взрослой желтокрылки в летне-осенний период (Базикалова и др., 1937) на 75.1% состоит из типично планктических форм, и лишь 24.9% приходится на придонных и донных животных.
Приспособляемость желтокрылки к обитанию и ловле добычи в толще воды достаточно совершенна. Она имеет довольно высокий удельный вес (Талиев, 1955), поэтому в своем эволюционном развитии она не пошла по пути пассивного освоения пелагиали и парения в толще воды, а завоевала эту экологическую нишу активно, преимущественно за счет локомоторной функции своих плавников (Талиев, 1955).
Идентификация и определение характеристик белков, иммунохимически родственных БХШ 310 среди цитоплазматических белков ряда культурных и дикорастущих злаков
Как показано в обзоре литературы, к настоящему времени установлено, что низкотемпературный стресс вызывает изменения в содержании ряда белков у ржи и пшеницы (Мишарин и др., 1997). Наиболее значительные изменения среди нативных белков были отмечены для нативного белка с молекулярной массой 310 кДа (БХШ 310) из озимой ржи (Колесниченко и др., 1996). Этот белок был выделен из проростков озимой ржи, была определена его молекулярная масса и субъединичный состав. На этот стрессовый белок была получена специфическая сыворотка. При помощи иммунохимических методов были показаны индукция синтеза БХШ 310 при холодовом шоке (Колесниченко и др., 1996) и при закаливании (Колесниченко и др., 1997), а также выявлено его v присутствие в митохондриях и установлено, что при низкотемпературном стрессе данный белок выполняет в растении функцию "разобщающего белка (Войников и др., 1996). Также ранее / (Мишарин и др., 1997) было показано, что у некоторых других злаков, в частности, у пшеницы, имеются иммунохимически родственные БХШ 310 антигены с близким Rf при иммуноэлектрофорезе в агарозе, но не были установлены их молекулярные массы, субъединичный состав и внутриклеточная локализация.
В связи с этим для решения этой задачи прежде всего было необходимо произвести поиск белков, иммунохимически родственных БХШ 310 озимой ржи среди белков ряда злаков с различной устойчивостью к низким температурам - кукурузы, озимой пшеницы, озимой ржи и пырейника.
Для идентификации и определения характеристик белков, иммунохимически родственных БХШ 310 среди цитоплазматических белков ряда культурных и дикорастущих злаков был применен электрофорез нативных белков со сдвигом заряда с последующим вестерн-блоттингом с поликлональнымн антителами на БХШ 310.
Нативный форез белков озимой ржи (Secale cereale L), пшеницы {Triticum aestivum L.), кукурузы (Zea mays L.) и пырейника (Elymus sibiricus L.}. показал значительные различия в составе нативных белков исследованных видов. Прежде всего, в спектре нативных белков кукурузы имеются значительные отличия от спектров нативных белков представителей родов трибы Triticeae в высокомолекулярной области (рис. 2). В спектре кукурузы содержание белков с молекулярными массами выше 300 кДа меньше, чем у других сравниваемых видов. В то же время у кукурузы имеется четкая линия с молекулярной массой около 230 «Да, практически отсутствующая у остальных видов.
Спектр белков пырейника содержит меньше белков в области 150 - 300 кДа, чем спектры пшеницы и ржи. У пырейника содержание белков с молекулярными массами около 230 и 110 - 140 кДа значительно ниже, чем у ржи и пшеницы. В то же время в области 380 - 320 кДа у пырейника имеются пять четких линий белков, практически отсутствующих у ржи. У пшеницы в некотором количестве в згой области имеется только один белок с молекулярной массой около 360 кДа .
Спектры белков ржи и пшеницы в области ниже 200 кДа очень близки, однако у пшеницы практически отсутствует линия белка с молекулярной массой 310 кДа, присутствующая в спектрах ржи и пырейника. В то же время белок с молекулярной массой около 230 кДа имеется в значительных количествах только в спектрах пырейника и пшеницы.
Спектры белков ржи и пшеницы в области ниже 200 кДа очень близки, однако у пшеницы практически отсутствует линия белка с молекулярной массой 310 кДа, присутствующая в спектрах ржи и пырейника. В то же время белок с молекулярной массой около 230 кДа имеется в значительных количествах только в спектрах пырейника и пшеницы.
