Содержание к диссертации
Введение Глава I. I.I.
1.1.1.
I.I.2. I.I.3.
I.I.4. I.I.5.
I.I.6.
ил.
I.I.8.
I.I.9.
1.2.
1.2.1.
1.2.2.
1.2.2.1.
1.2.2.2.
1.2.3.
1.3.
Глава П. II. 1. 11.1.1.
Обзор литературы 9
Эмульсионная и дисперсионная полимеризация как методы
получения полимерных микросфер 9
Механизм процесса эмульсионной полимеризации 9
.Монодисперсные латексы 14
Особенности безэмульгаторной эмульсионной
полимеризации 15
Функциональные группы на поверхности частиц 16
Поверхностная морфология частиц, полученных методом
эмульсионной сополимеризации 20
Полимерные частицы размером более 1 мкм 23
Механизм процесса дисперсионной полимеризации в
полярных средах 23
Влияние условий дисперсионной полимеризации на
характеристики частиц 24
Поверхностная морфология частиц, полученных методом
дисперсионной полимеризации 32
Взаимодействие биолигандов с поверхностью полимерных
микросфер 33
Адсорбция 33
Ковалентное присоединение биолигандов 36
по карбоксильным поверхностным группам 36
по альдегидным поверхностным группам 38
Адсорбция и хемосорбция синтетических пептидов 39
Преимущества и перспективы метода реакции агглютинации
латекса 42
Объекты и методы исследования 44
Исходные реагенты 44
Мономеры 44
П. 1.2. Прочие реагенты 44
И.2. Методы синтеза 47
11.2.1. Получение микросфер полистирола методом дисперсионной
полимеризации в полярных средах 47
И.2.2. Получение микросфер поли(стирол/акролеин)а методом
безэмульгаторной эмульсионной полимеризации 48
ІІ.З. Методы изучения процесса полимеризации и характеристик
образуемых полимерных частиц 48
И.3.1. Изучение кинетики (со)полимеризации методом газовой
хроматографии 48
11.3.2. Определение молекулярной массы полимеров 49
И.3.3. Определение содержания гель - фракций в сополимерах
поли(стирол/акролеин)а 50
П.3.4. Определение размеров микросфер методом электронной
микроскопии 50
ІІ.3.5. Определение содержания сухого вещества в латексе 50
ИЗ.6. Определение поверхностной концентрации функциональных
групп латексов 50
П.3.6.1. Кондуктометрическое титрование карбоксильных групп 50
П.3.6.2. Кондуктометрическое титрование альдегидных групп 52
П.3.7. Определение адсорбционных характеристик латекса методом
непрерывного потенциометрического титрования 53
П.3.8. Анализ полученных полимеров 53
П.3.8.1. Анализ сополимерной структуры микросфер ПСАК 53
ІІ.3.8.2. Анализ полимерного состава привитых сополимеров 54
П.3.9. Анализ полимеров методом ИК-спектроскопии 54
Н.3.10. Изучение электрофоретической подвижности микросфер
методом микроэлектрофореза 56
ІІ.4. Метод связывания белка 57
П.4.І. на поверхности карбоксилированных латексов ПС 57
П.4.2. на поверхности частиц ПСАК с альдегидными группами 58
J*
II.5. Определение концентрации белка на поверхности частиц
латексов 58
Н.5.1. методом Лоури-Фолина 58
И.5.2. методом высокоэффективной монолитной дисковой
хроматографии (ВЭМДХ) 59
Глава III Результаты и их обсуждение 61
III. 1. Безэмульгаторная эмульсионная сополимеризация стирола с
акролеином 61
Ш.2. Дисперсионная полимеризация стирола 70
Ш.З. Связывание биолигандов с частицами ПСАК и ПС, влияние
на их электроповерхностные свойства 81
Ш.3.1. Электроповерхностные свойства микросфер
поли(стирол/акролеин)а до модификации белком 81
III.3.2. Связывание белка с частицами ПСАК 84
Ш.3.3. Электроповерхностные свойства микросфер
поли(стирол/акролеин)а после модификации белком 93
Ш.З .4. Электроповерхностные свойства микросфер полистирола до
и после модификации белком 107
Ш.З.5. Конструирование латексных тест-систем для определения
возбудителей легионелеза 118
Ш.З.6. Конструирование латексных тест-систем для определения
антител к ВИЧ 118
Выводы 132
Библиографический список 134
Введение к работе
Монодисперсные полимерные микросферы применяются в различных областях науки и техники. Их правильная сферическая форма и монодисперсность позволяют широко использовать полимерные микросферы в качестве модельных коллоидов при изучении реологического поведения, стабильности, седиментации, электрокинетики и агрегации коллоидов. Достаточно крупные монодисперсные полимерные частицы с диаметром более 1 мкм могут быть использованы в качестве сорбентов для анализа и разделения биологически активных веществ (БАВ) методами жидкостной хроматографии. В последние годы монодисперсные полимерные микросферы эффективно применяются в иммуноанализе в качестве носителей иммунореагентов, среди которых главную роль играют белки. Молекулы БАВ содержат в своем составе разнообразные ионогенные группы, поэтому они не только могут вступать в специфические взаимодействия с поверхностью полимерного носителя, но и влиять на распределение поверхностного заряда. Поверхностный заряд полимерных частиц определяет коллоидно-химическое поведение дисперсий, весь комплекс их электроповерхностных свойств. При этом, наряду с величиной заряда, немаловажное значение имеет и химическая природа полимерной поверхности - степень ее гидрофобности, наличие тех или иных функциональных групп, их кислотно-основные свойства и т. д. Микросферы служат для визуализации иммунохимических реакций, в которых образование комплекса антиген-антитело проявляется как агрегация частиц латекса, несущих на поверхности один из взаимодействующих компонентов. На специфичность и чувствительность такой реакции определяющее влияние оказывает конформация макромолекул белка, она меняется в зависимости от структуры поверхности микросфер и их электроповерхностных свойств. Монодисперсные частицы являются хорошей моделью для изучения механизма специфической адсорбции биолигандов на поверхности носителя. В связи с этим проведение комплексного исследования, позволяющего установить взаимосвязь между условиями синтеза полимерных частиц и их поверхностной структурой, а также разработка методов, позволяющих получать частицы с заданными свойствами, с целью эффективного экспонирования на их поверхности биоспецифических лигандов является актуальной задачей.
Целью настоящей работы является: разработка методов направленного формирования в процессе синтеза поверхностной структуры монодисперсных полимерных микросфер с альдегидными и карбоксильными группами, выяснении механизмов образования смешанных структур при встраивании БАВ в поверхностные слои таких частиц, а также в изучении влияния поверхности полимерного носителя на эффективность специфического взаимодействия биолигандов в латексной тест-системе. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
исследовать безэмульгаторную эмульсионную сополимеризацию (БЭП) стирола и акролеина, инициированную персульфатом калия;
исследовать дисперсионную полимеризацию (ДП) стирола в спиртовых средах, инициированную карбоксилсодержащим азоинициатором в присутствии стерического стабилизатора поливинилпирролидона (ПВП);
выявить факторы, влияющие на дисперсность и поверхностную структуру полимерных частиц в процессе их формирования;
исследовать адсорбционное и ковалентное связывание биолигандов (бычьего сывороточного альбумина (БСА) и синтетических пептидов) с полученными микросферами полистирола (ПС) и поли(стирол/акролеин)а (ПСАК);
провести сравнительное изучение электрофоретической подвижности полимерных частиц, полученных в разных условиях синтеза, до и после их модификации биолигандами;
определить эффективность протекания иммунохимических реакций на поверхности образцов микросфер ПС и ПСАК, модифицированных биолигандами.
Научная новизна работы. Впервые проведено комплексное исследование полимерных частиц - носителей иммунореагентов на основе полистирола и сополимеров стирола с акролеином. В результате установлена взаимосвязь между условиями их синтеза, дисперсными характеристиками и поверхностными свойствами (^-потенциал, положение изоэлектрической точки, адсорбционная емкость), а также способностью эффективно экспонировать диагностически значимые биолиганды для их участия в реакциях молекулярного узнавания. В ходе
исследования разработаны новые методы направленного регулирования в процессе БЭП и ДП характеристик частиц-носителей на основе ПСАК и ПС; впервые проведено углубленное изучение их поверхностной структуры и ее влияния на адсорбционное и ковалентное связывание биолигандов и их реакционную способность. В частности, получены частицы ПСАК с повышенной концентрацией альдегидных групп и показано влияние соотношения альдегидных и карбоксильных групп в их поверхностном слое, а также рН раствора белка на величину его хемосорбции. Впервые получены частицы ПС с усложненной структурой поверхности, содержащей как карбоксильные группы для ковалентного связывания биолигандов, так и привитые сополимеры полистиро/поливи-нилпирролидон (ПС/ПВП). Определено строение данных сополимеров и их влияние на стабильность поверхности и эффективность экспонирования на ней БСА и синтетических антигенных детерминант вируса иммунодефицита человека (ВИЧ).
Практическая значимость:
Получен широкий спектр монодисперсных микросфер на основе ПС в диапазоне размеров 1-5 мкм и сополимеров стирола с акролеином - 0.4-0.7 мкм. Выявлены факторы, позволяющие регулировать в процессе синтеза диаметр частиц, поверхностную концентрацию функциональных групп и структуру поверхностного слоя. Проведена серия экспериментов, направленных на оптимизацию процессов связывания БАВ частицами ПС и ПСАК. Выявлены условия получения полимерных носителей и связывания с ними биолигандов, обеспечивающие их экспонирование на границе раздела фаз, сохранение биологически активной конформации иммунореагента и, следовательно, высокую чувствительность тест-систем. Показана эффективность применения полученных частиц в качестве носителей синтетических антигенных детерминант поверхностных белков и белков ядра ВИЧ в тест-системах, предназначенных для выявления ВИЧ-инфицированных.
Основные положения, выдвигаемые на защиту:
Способы регулирования в процессах БЭП стирола с акролеином и ДП стирола в спиртовых средах дисперсности формируемых полимерных микросфер,
поверхностной концентрации карбоксильных и альдегидных групп или структуры привитых сополимеров ПС/ПВП.
Подходы к оптимизации условий связывания биолигандов путем адсорбции и хемосорбции БСА на частицах ПС и ПСАК в зависимости от структуры их поверхностного слоя.
Метод оценки эффективности экспонирования биолигандов, основанный на комплексном изучении величин ^-потенциалов и положения изоэлектрических точек поверхности частиц-носителей ПСАК и ПС.
Методы повышения чувствительности модельных латексных тест-систем для определения антител к ВИЧ на основе антигенных детерминант ВИЧ и монодисперсных частиц ПСАК и ПС.
Структура диссертации:
Диссертационная работа состоит из введения, трех глав (обзор литературы, объекты и методы исследования, результаты и их обсуждение), выводов, списка цитируемой литературы (178 наименований). Работа изложена на 149 страницах, содержит 28 рисунков и 23 таблицы.
