Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы
1.1. Разработка и применение препаратов иммуностимуляторов при иммунодефицитах животных., 18
1.2. Применение интерферона и его индукторов в ветеринарии 42
1.3. Использование биологически активных добавок в ветеринарии и животноводстве 63
1.4. Комплексное использование биологически активных препаратов... 67
Глава 2. Собственные исследования
2.1. Материалы и методы исследований 68
Глава 3. Разработка и изучение препарата лигавирин
3.1. Технология получения 91
3.2. Токсические свойства 95
3.3. Интерфероногенная активность 118
3.4. Противовирусная активность .126
3.5. Иммуномодулирующие свойства 133
3.6. Лечебно-профилактическая эффективность 147
Глава 4. Разработка и изучение препарата иммуноферон
4.1. Технология получения 162
4.2. Токсикологические оценка препарата 166
4.3. Биологическая активность 168
4.4. Лечебно-профилактическая эффективность 178
Глава 5. Разработка и изучение Биостима-К
5.1. Технология получения препарата, его токсикологическая оценка и биологическая активность
5.2. Лечебно-профилактическая эффективность
Глава 6. Разработка и изучение препаратов промивит и фармавит
6.1. Технология получения 199
6.2. Токсикологическая оценка препаратов 201
6.3. Лечебно-профилактическая эффективность 204
Глава 7. Разработка схем комплексного применения интерферонов с биологически активными препаратами
7.1. Классификация биологически активных веществ 212
7.2. Рекомендации по использованию БАЛ на крупном рогатом скоте 214
7.3. Рекомендации по использованию БАЛ на свиньях...217
Глава 8. Обсуждение результатов 223
Глава 9. Выводы 253
Глава 10. Практические предложения 257
Список использованной литературы 260
Приложения 298
- Использование биологически активных добавок в ветеринарии и животноводстве
- Лечебно-профилактическая эффективность
- Технология получения препарата, его токсикологическая оценка и биологическая активность
- Рекомендации по использованию БАЛ на крупном рогатом скоте
Введение к работе
Актуальность темы. Постановлением координационного совещания Юбилейной Международной конференции «Теоретические н практические аспекты возникновения и развития болезней животных и защита их здоровья в современных условиях», посвященной 30-летию создания Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института патологии, фармакологии и терапии (3-4 октября 2000 г) были определены основные направления исследований болезней молодняка сельскохозяйственных животных:
разработка комплексной диагностики иммунодефицитных состояний молодняка всех видов животных и эффективных лечебно-профилактических и иммунокоррегирующих препаратов для предупреждения патологии органов пищеварения и дыхания и терапии больных животных;
создание экологически безопасной системы ветеринарной защиты молодняка от нарушений обмена веществ и возникающих на этой основе желудочно-.кишечных л респираторных js факторных инфекционных болезней с применением высокоэффективных лечебно-профилактических я -иммунпмодулируда-щих препаратов.
Инфекционные заболевания животных вирусной и бактериальной этиологии, ^ссоциирпванныр заболевания потгугиологическдй природы, незаразные
fiOHfrwffi ж^пгоплу притупят у таатгатіу|іл« штурм, вследствие .пядежя, чяАо-
леваемосга, потери продуктивности- Многие вирусы, бактерии-и другие патогенные микроорганизмы, являющиеся причиной ассоциативных вирусно-бактериальных заболеваний телят, поросят, сельскохозяйственной птицы, клеточных пушных зверей, болезней невыясненной этнологии, создают объективные нудности Jia пути глазрабогки средств спепифической и неспеттфичеекпй лрофилякхики влечения инфекционных 55 лезаразных болезней животных
Цяжтпдм чтипттгичегким фяктпрпм мвшттдяпи имфетпутнимтг болезней -является снижение уіхгайчивосхи организма животного х .возбудителям болезней, возникающее на фоне иммуыддефицитов различной этиологии.
Анализ причин заболеваемости животных в последние годы показывает, что на фоне спорадических случаев, небольших вспышек или эпизоотии отдельных классических инфекций и появления новых малоизученных болезней основной ущерб животноводству наносят факторные инфекции, клинически проявляющиеся у маточного поголовья нарушениями воспроизводительной функции, а у молодняка диарейным и респираторными синдромами. Практически ловсеме-стная энзоотия л стационарность факторных инфекций свидетельствуют о том, что они не случайны и возникают как следствие постоянно присутствующих в среде обитания животных неблагоприятных факторов, закономерно вызывающих неспецифические изменения в организме., и обязательного носшедьгтва у животных возбудителей. Последние выполняют роль конечного эффектора (разрешающего фактора), определяя дюзологически дифференцируемую патологию {264, 265].
Зги проблемы, которые стоят в таком относительно благополучном регионе как Центрально-Черноземная зона, имеют место и в Северо-Восточном регионе Нечерноземной зоны РФ, к которому относятся Кировская, Костромская, Нижегородская, Свердловская и Пермская области, республики Коми, Марий Эл, Мордовия, Чувашия, Удмуртия. Серьезную угрозу в регионе представляют инфекционные же_іулі>чно-кишечньіе _и респираторные болезни .молодняка Широкое распространение получили вирусные и смешанные вирусно-бактериадьные инфекции молодняка, который рождается гипотрофичным, заболеваемость телят раннего зюзраст^ дх>стиглет баоее 50 %, а падеж - 40^50%,
Широкое бессистемное применение антибиотиков, лшрюфуранов, хульфа-ниламидных препаратов (без учета чувствительности к ним микроорганизмов, циркулирующих в хозяйствах) не всегда лает положительный результат, но, как правило, приводит к угнетению иммунного ответа у животных.
В связи с вышеизложенным актуальным становится применение препаратов, обладающих свойствами иммуномолуляторов, проявляющих противовирусное и антибактериальное ^действие непосредственно или опосредованно за счет
стимуляции иммунной системы, препаратов, повышающих иммуногенность существующих вакцин.
В настоящее время большие надежды связывают с препаратами интерферо-нов, являющихся неспецифическими средствами защиты организма от вирусных инфекций. Для интерферонов характерными являются противовирусные, иммуностимулирующие, антибактериальные и антипролиферативные свойства.
Интерферонизация может быть пассивной, когда организм насыщается экзогенным, полученным в другой биологической системе готовым препаратом интерферона и активной, когда при помощи различных стимуляторов (индукторов) организм сам вырабатывает собственный эндогенный интерферон.
Использование интерферонов в комплексе лечебно-профилактических мероприятий не следует противопоставлять их вакцинам, сывороткам и другим биологическим и фармакологическим препаратам. В настоящее время актуальным является дальнейшее углубленное изучение показаний к применению интерферонов и индукторов его образования, отработка схем и методов их введения, в том числе и в комплексе с другими биологически активными препаратами.
Концепция существования в организме животных высококомпетентной системы интерферона, сформировавшейся в процессе эволюции, и многообразие обнаруженных и изученных к настоящему времени физиологических функций интерферона несомненно указывает на их контрольно-регуляторную роль в сохранении гомеостаза [80].
По значимости система ИФН приближается к системе иммунитета, а по универсальности даже превосходит ее [77]. Именно универсальность интерферона, делающего его важнейшим фактором неспецифической резистентности, послужила основанием для предложения интегрального понятия «интерфероно-вый статус».
Необходимость исследования динамики изменений иитерферояового статуса (ИФН-статуса) при испытаниях новых препаратов интерферона и иммуно-модуляторов, разработке схем их применения диктуется концептуальным подходом, предусматривающим правильное и рациональное использование систе-
мы интерферона (ИФН) как терапевтического средства, формирующего неспецифическую резистентность к вирусным заболеваниям в норме и действующую при естественном выздоровлении при патологии.
Роль факторов (БАВ), способствующих повышению питательности и усвоению корма, всегда была в центре внимания ученых и животноводов. Продуктивность животных зависит не только от наличия в достаточном количестве в рационе ііротсина, жиров и углеводов, во и от количества и соотношения витаминов, макро- и микроэлементов и других биологически активных веществ (БАВ), Одной из главных причин возникновения факторных инфекций является необеспеченность высокопродуктивных животных полноценными кормами и несоответствие качества кормов физиологическим потребностям животных, выражающееся феноменом антропогенных аномалий микроэлементного соста-ва почв, воды, кормов, микробиоценоза почв, пищеварительного тракта животных [265]. Установлено также, что при использовании большого числа БАВ с разными свойствами может усиливаться или ослабляться их активное начало, стимулируются или ингибируются первоначальные свойства основных компо-'йвшш гедрвюв «tew тайнам таменяетск атеиста, их иснцяьзонаиия в процессе образования продукции.
Учитывая вышеизложенное, для профилактики массовых болезней животных основные усилия целесообразно направить на стабилизацию и оптимизацию кормовой базы животноводства, за счет введения в рацион премиксов, содержащих БАВ и препаратов, повышающие резистентность организма и обладающих лечебно-профилактическими свойствами.
Разработка схем комплексного применения иммуностимуляторов (препаратов интерферона) в комбинации с другими БАЛ позволит решить многие вышеперечисленные проблемы ветеринарии и животноводства.
Учитывая перспективность данной группы препаратов, в соответствии с требованиями к лекарственным средствам (приказ да МСХиП т*Ф № М от 13.10.95) нами проведены комплексные исследования по выяснению фармакологических, токсикологических и биологических свойств препаратов лигави-
11 рин, иммуноферон, биостим, промивит, фармавит с целью их внедрения в ветеринарную практику.
Работа выполнена в соответствии с государственным заданием и была включена в следующие темы:
НТП ВГНКИ ветпрепаратов «Изучить активность индукторов интерферона на животных», Jfe гос. регистрации 01840063396 за 1981 -1985 гг.;
НТП «Интерферон», раздел 02.17.Д. ВГНКИ ветпрепаратов за 1986-1990 тт., задание 02.13. Д. Всесоюзной межведомственной программы «Интерферон»;
Общесоюзной научно-технической программы «Молодняк»; «Разработать и внедрить комплексные экологически чистые системы получения и выращивания высокорезистентного молодняка с/х животных», раздел 03.26.М ВНИИНБЖза І990-1995 гг.;
Программа фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению Агропромышленного комплекса РФ на 1996-2000 гг. РАСХН, по разделу «Ветеринарная медицина» 04. «Разработать общую теорию патологии сельскохозяйственных, промысловых и диких млекопитающих, птиц, рыб, пчел и на ее основе создать экологически чистую систему их ветеринарной защиты».
Н* ик иг г псований. Разработать и изучить препараты интерферонов (лига-вирин, иммуноферон), биологически активную добавку биостим-К и витамин-но-минеральные добавки промивит и фармавит н внедрить их в ветеринарную практику и животноводство.
В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:
разработать технологию получения лигавириыа, иммуноферона, биостима, промивита и фармавита;
изучить токсические свойства препаратов;
изучить интерфсроногенные, противовирусные и иммуностимулирующие свойства препаратов интерферона;
рачрябптэть тткягятя v примета-ниш пр^^зрзтрп;
- разработать схему комплексного применения препаратов интерферона с
биологически активными добавками.
Научная новизна. Впервые теоретически и экспериментально обоснована возможность применения биологически активных препаратов с разным механизмом действия для повышения естественной резистентности и иммунобиологической реактивности организма, сохранности и продуктивности животных, в том числе интерферонов (лигавирин и иммуноферон) для профилактики инфекционной и незаразной патологии и лечения больных животных; биостима для профилактики нарушений обмена веществ, повышения естественной резистентности и продуктивности животных, профилактики желудочно-кишечных заболеваний и лечения больных животных; промивита и фармавита - для нормализации обменных процессов, профилактики и лечения гипо- и авитаминозов, лтомикроэлементозов. Изучен механизм действия препаратов.
Установлено, что лигавирин и иммуноферон обладают противовирусными и иммуномодулирующими свойствами; препараты биостим, промнвит и фарма-вит нормализуют обменные процессы у животных.
Практическая значимость работы. На основании результатов исследований разработаны и утверждены нормативная документация, регламентирующая технологический процесс производства препаратов, показатели качества и методы их контроля, наставления по применению в ветеринарии, которые одобрены Ветфармбиосоветом и утверждены Департаментом ветеринарии Мин-сельхоза РФ и технические условия, согласованные с ВГНКИ ветпрепаратов и Департаментом ветеринарии Минсельхоза РФ:
- «Наставление по применению препарата лигавирин в ветеринарии», одоб-рено Ветфармбиосоветом (протокол № 2 от 24.04.97), утверждено ДВ МСХ РФ 02.06.97 и ТУ 9337-001-32886413-97, согласованные с ДВ МСХ РФ и ВГНКИ вешренараюв, утверждены НПФ «Агробиоцентр»;
* «Наставление по применению препарата иммуноферон в ветеринарии», одобрено Ветфармбиосоветом (протокол № 5 от 17.12.97) № 000627-О, утвер-
ждено ДВ МСХ РФ 15.05.98 и ТУ 9337-002-32886413-98, согласованные с ДВ MCX РФ и ВГНКИ ветпрепаратов, утверждены НПФ «Агробиоцентр»;
«Наставление по применению Биостима-К в ветеринарии», одобрено Ветфармбиосоветом (протокол № 4 от 28.09.99) № 001371-ОП, утверждено ДВ МСХ РФ 19.03.02 и ТУ 9337-002-52333343-02, согласованные с ДВ МСХ РФ и ВГНКИ ветпрепаратов, утверждены НПФ «Биофид»;
- «Наставление по применению промивита в ветеринарии», одобрено
Ветфармбиосоветом (протокол № 3 от 24.05.95) Jfe 001321-ОП, утверждено ДВ
МСХ РФ 25.12.01 и ТУ 9337-001-52333343-01, согласованные с ДВ МСХ РФ
и ВГНКИ ветпрепаратов, утверждены НПФ «Биофид»;
- «Наставление по применению препарата фармавит для профилактики и ле
чения гиповитаминозов, нарушений обмена веществ и повышения продуктив
ности животных и птиц», одобрено Ветфармбиосоветом (протокол № 2 от
15.05.2001 г.). Регистрационные номера: ПВР-2-2Л/00697; ПВР-2-2.1/00698;
ПВР -2-2.1ДЮ699; ПВР-2-2.1ЯЮ700;ПВР-2-2ЛЯЮ701; ПВР -2-2.1/00702; ПВР -
2-2.1/00703; ПВР-2.2.1/00704; ПВР-2-2.1ЛЮ705; ПВР-2.2ЛЛЮ706. Утверждено
ДВ МСХ РФ 05.ОТ. 2001 г и ТУ 9355-001-10920471-01, согласованные с ДВ
МСХ РФ и ВГНКИ ветпрепаратов, утверждены ЗАО «Фармакс».
По результатам лабораторных исследований, широкого производственного испытания и экспертной оценки препаратов и документации Ветфармбиосоветом и ВГНКИ ветпрепаратов, а также обобщения данных литературы, разработаны:
Методические рекомендации по определению интерферонсинтезирующей активности лейкоцитов сельскохозяйственных животных. - ВГНКИ ветпрепаратов. - ВАСХНИЛ. -1986;
Методические рекомендации по испытанию индукторов интерферона на сельскохозяйственных животных. -ВГНКИ ветпрепаратов. - ВАСХНИЛ. -1986;
Методы тестирования естественной неспецифической резистентности животных /Методические рекомендации/. - НПФ «Агробиоцентр», Комитет сельского хозяйства Кировской области. — 1997;
Определение иммунологического статуса сельскохозяйственных животных /Методические рекомендации/. — НПФ «Агробиоцентр», Комитет сельского хозяйства Кировской области. - 1997;
«Методические рекомендации по проведению научно-хозяйственных опытов по применению комплексных кормовых добавок в кормлении молодняка свиней». — НПФ «Агробиоцентр», НИИСХ Северо-Востока. — РАСХН. -1997;
* «Методические рекомендации по профилактике и лечению болезней минеральной и витаминной недостаточности у свиней». - НПФ «Агробиоцентр», НИИСХ Северо-Востока - РАСХН -1997;
- «Методы тестирования иммунологической резистентности сельскохозяйст
венных животных» /Методические рекомендации/. — ВНИВИПФиТ. —
РАСХН. -1999;
«Применение новых биологически активных препаратов в ветеринарии и животноводстве»/Рекомендации/. -ВНИВИПФиТ. -РАСХН. - 1999;
«Витаминная недостаточность пушных зверей, ее профилактика и лечение» Рекомендации/. -ВПЖИ вегпрепаратов, ВНИВИПФиТ. -РАСХН - 2000.
«Лечение и профилактика инфекционных болезней собак» /Рекомендации/. — ВЮЙЗИПФиТ. - РАСХН. - 2001;
«Физиология, биохимия и иммунология млекопитающих (пушных зверей)» (Допущено МСХ РФ в качестве учебного пособия для студентов высших учебных заведений но зооветеринарным специальностям). - Киров. - 2002;
«Изучение физиологических показателей крови животных с использованием современных биохимических и иммунобиологических тестов» (Допущено МСХ РФ в качестве учебного пособия для студентов высших учебных заведений по зооветеринарным специальностям). -Киров. -2003;
- «Физиологическая потребность клеточных пушных зверей в витаминах и
# применение витаминных препаратов в звероводстве» (Допущено МСХ РФ в ка
честве учебного пособия для студентов высших учебных заведении по зоовете
ринарным специальностям). - Киров. — 2003.
Указанные методические рекомендации и учебные пособия позволяют объ
ективно оценивать биологические и токсические свойства препаратов, а также
" совершенствовать все этапы испытания и внедрения в практику ветеринарной
медицины высокоэффективных и безопасных средств, которые необходимы для исследователей, лроводящих скрининг новых биологически активных веществ.
Препарат Фармавит, не имеющий аналогов, удостоен золотой и платиновой медалей Госстандарта РФ.
Материалы диссертационной работы внедрены в учебный процесс при чтении курса «Физиология гепьскохгпяйственных животных» на биологическом факультете Вятской государственной сельскохозяйственной академии и могут быть использованы в дру гмх вузах при подготовке специалистов биояогическо-го, ветеринарного и зоотехнического профиля.
Основные положения, выносимые да защиту;
о биологической активности препаратов интерферона (лигавирин, иммуно-ферон), биостима, промивита и фармавита;
профилактическая и лечебная эффективность лигавирина, иммуноферона, биостяма, .промивита л фармавита при инфекционных и незаразных болезнях животных;
о комплексном применении препаратов интерферона с биологически актив-
# дыми добавками в ветеринарии
Ашяйцшии тияультато» сслсдчил—вт. Материалы исследований доложены и обсуждены на: заседании секции «Эпизоотология и профилактика инфекционных болезней животных» отделения ветеринарии ВАСХНИЛ, Москва, 1985; Региональном симпозиуме социалистических стран по интерферону,
# Юрмала, 1988; Республиканском семинаре «Использование интерферонов в ве
теринарии», Киев, 3989; J Всесоюзной научной конференции <(Еиологически
ты в профилактике и лечении наиболее распространенных заболеваний человека», Москва, 1999; Международной научно-производственной конференции посвященной 100-летию со дня рождения члена-корр. ВАСХНИЛ В.Т. Котова, Воронеж, 1999; Международной научной конференции, посвященной 70-летию образования зооинженерного факультета, Казань, 1999; Юбилейной конференции посвященной 70-летию зооинженерного факультета ВГСХА, Киров, 2000; Международной конференции «Теоретические и практические аспекты возникновения и развития болезней животных и защита их здоровья в современных условиях», посвященной 30-летию ВНИВИПФиТ, Воронеж, 2000; I Международной конференции «Современные вопросы ветеринарной медицины и биологии», Уфа, 2000; Международной научно-производственной конференции по вопросам ветеринарной медицины и животноводства, Казань, 2001; Заседании секции «Незаразные болезни животных» отделения ветеринарной медицины РАСХН, Воронеж, 1999; Заседании секции «Патологии, фармакология и терапия» отделения ветеринарной медицины РАСХН, Воронеж, 2000; научно-практической конференции «Современные проблемы природопользования, охотоведения и звероводства», посвященной 80-летию ВНИИОЗ, Киров, 2002; Международной конференции «Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях», Воронеж, 2002.
16 активные вещества в звероводстве, кролиководстве и оленеводстве», Москва, 1989; Научно-производственной конференции «Внедрение достижений науки, передового опыта на уровень современных требований», Киров, 1990; Всесоюзной научно-технической конференции «Современные проблемы иммунологии, биотехнологии, генной и клеточной инженерии в ветеринарной медицине», Н. Новгород, 1990; Всесоюзной конференции «Физиология и продуктивность животных - решение продовольственной программы СССР», Таллин, 1990; Научно-производственной конференции «Проблемы интенсификации производства молока», Минск, 1991; Международном симпозиуме «Физиологические основы повышения продуктивности хищных пушных зверей», Петрозаводск, 1991; Региональной межвузовской научной конференции, Киров, 1995; I Всероссийском симпозиуме по машинному доению сельскохозяйственных животных, Оренбург, 1995; Всероссийской конференции, посвященной 100-летию Вятской с/х опытной станции, Киров, 1995; Международном координационном совещании «Экологические проблемы патологии, фармакологии и терапии животных», Воронеж, 1997; Всесоюзной научной конференции, посвященной 75-летию ВНИИОЗ, Киров, 1997; Международной межвузовской научно-практической конференции «Региональные проблемы прикладной экологии», Белгород, 1998; Научно-практической конференции «Эффективность развития свиноводства в современных условиях рыночной экономики», Москва, 1998; П Международном симпозиуме «Физиологические основы повышения продуктивности хищных пушных зверей», Петрозаводск, 1998; Научно-производственной конференции посвященной 190-летию высшего ветеринарного образования в России и 100-летию ветеринарной науки Санкт-Петербурга, С.-Петербург, 1998; Научно-производственной конференции «Теория и практика использования ЄАВ в животноводстве», Киров, 1998; Международной научно-практической конференции «Проблемы патологии, санитарии и бесплодия в животноводстве», посвященной 100-летию со дня рождения академиков АН Белоруссии Х.С. Горегляда и М.К. Юсховца, Минск, 1998; Всероссийской конференции с Международным участием «Пробиотики и пробиотические продук-
Использование биологически активных добавок в ветеринарии и животноводстве
Основой понимания иммунной системы является концепция, что каждый из миллиардов лимфоцитов несет на своей поверхности антигенные рецепторы. Набор рецепторов предполагает возможность для индивидуального лимфоцита отвечать на любой антиген, в котором представлены соответствующие антигенные детерминанты. Антигенные рецепторы развиваются независимо от антигена как результат случайных последовательностей расположения генов [34].
Действие иммунных механизмов основано на реакциях двух типов: клеточного и гуморального. Это связано с наличием двух независимых популяций лимфоцитов: В-клеток, вырабатывающих антитела, и Т-клеток, осуществляющих реакции клеточного типа.
Иммунная система характеризуется, прежде всего, специфичностью ее реакций, спектром специфичности антител и лимфоцитов, а также существованием иммунологической памяти. Уже на ранних стадиях своего развития происходит супрессия В - и Т-клеток, несущих рецепторы для антигенных детерминант собственного организма (возникает состояние естественной иммунологической толерантности), в результате иммунная система в норме способна отвечать только на чужеродные антигены. Связывание чужеродного антигена с лимфоцитом вызывает иммунный ответ, направленный против этого антигена. При этом некоторые из лимфоцитов пролиферируют и дифференцируются в клетки памяти, и при вторичном воздействии того же иммуногена иммунный ответ развивается быстрее и оказывается гораздо сильнее (вторичный иммунный ответ). Оптимальный иммунный ответ реализуется только при Т - и В-клеточноЙ кооперации [248].
Лимфоциты являются ключевыми клетками иммунной системы, обеспечивающими основные реакции иммунитета [242]. Все лимфоциты происходят из стволовой лимфоидной клетки эмбриональной печени и костного мозга. Реализация различных функций лимфоцитов возможна благодаря наличию отдельных субпопуляций, число которых особенно велико среди Т-клеток [197]. Т-лимфоциты являются эффекторами иммунного ответа на воздействие различных вирусных, бактериальных, грибковых и других агентов [242]. Т-лимфоциты, участвующие во включении В-клеток в антителогенез, названы клетками-помощниками (Т-хеллерами), а Т-клетки, выполняющие функцию помощников при развитии иммунного ответа клеточного типа - Т-усилителями (Т-амплифайерами), Т-лимифоциты, оказывающие цитотоксическое действие на клетки-мишени при трансплантационном или противоопухолевом ответе названы киллерами (Т-киллеры), а ограничивающие силу иммунного ответа — су-прессорами (Т-супрессоры). Т-клетки, ответственные за реакции гиперчувствительности замедленного типа, носят название Тгзт и, наконец, клетки, обнаруженные в каждой из вышеперечисленных субпопуляций, в функцию которых входит усиление ответа при повторном контакте с антигеном, - клетками памяти (Т-намяти) [197]. Чужеродные антигены подвергаются воздействию Т-клеток только в тех случаях, когда они экспрессируются на поверхности клеток и ассоциируются с мембранными глнколротеинами, которые кодируются генами главного комплекса гистосовместимости [92]. Среди В-лимфоцитов имеются также отдельные субпопуляции, из которых наиболее изучены В-супрессоры. Их функциональное назначение заключается в угнетении иммунного ответа. Наиболее важным продуктом В-клеток является большое разнообразие антител, называемых также иммуноглобулинами. Основная функция молекул иммуноглобулинов сводится к специфическому связыванию с чужеродными молекулами (антигенами), обусловливающими инактивацию и (или) удаление токсина, микроорганизма, паразита или каких-либо веществ из организма. Антитела представляют собой сложные гликопротеиновые молекулы и сами по себе могут служить антигенами. При определенных обстоятельствах каскад образующихся антител в сочетании с аугоцитотохсическими Т-лимфоцитами приводит к снятию толерантности к собственным антигенам и развитию иммунопатологического процесса. Существует пять классов иммуноглобулинов: IgA, IgG, IgM, IgD, IgE. У отдельных из них обнаружены подклассы (тотипы), число которых может варьировать в зависимости от вида животного {1Щ. Третий тяя клеток, непосредственно участвующих в формировании клеточного и гуморального ответов, — макрофаги. Основная их функция макрофагов заключается в презентации антигена Т-лямфоцитов и обеспечении тем самым образования антител на тимуезависимые антигены. В результате антиген эффективно эяяиминируется. Ігри этом макрофаг несет двойную функцию: с одной стороны, он традиционно играет роль «мусорщика», убирающего антиген, х другой - перерабатывает антиген и стимулирует Т-лимфоциты [183]. Особое значение для иммунной системы имеет синтез макрофагами интер-лейкина-ї {ILA ) и дополнительных растворимых факторов, которые могут подключать и активировать другие клетки, в частности, покоящиеся Т-клетки. Наиоолее интересными из известных факторов макрофагов являются альфа-интерферон (а-ИФН) и фактор некроза опухолей (ФНО). Через синтез а-ИФН макрофаги регулируют резистентность организма к вирусной инфекции. Существенную роль в резистентности, осуществляемой макрофагами, играет синтез этими клетками колониестимулирующих факторов (G-C3F, GM-C3F) миело- и моноцитопоэза костного мозга (110].
Из других клеї очных факторов защитных реакций необходимо выделить естественные киллеры (ЕК). Их функции следующие: контроль за ростом опухолевых клеток, контроль за инфекционными микроорганизмами (бактериями, вирусами, грибами, паразитами), регуляция иммунного ответа, контроль за пролиферацией и дяфферсниировкой гемоиоэтических, лимфоидных и, возможно, других клеток, секреция медиаторов, осуществляющих цитолиз кдеток-мишеней, нни циация трансплантарного иммунитета и др. Дать характеристику ЕК очень сложно, так как до сих пор не ясно, к какой клеточной линии внутри гемопоэтической системы они принадлежат. Установлено, что ЕК-активностью могут обладать тимоциты, В-лимфоциты, макрофаги и др. клетки [197].
Клетки-киллеры обеспечивают первую линию защиты против опухолевых клеток и внутриклеточных инфекций до включения иммунных механизмов.
Необходимо также обращать внимание на антителозависимую клеточную цитотоксичность (АДСС), являющуюся комбинацией гуморального и клеточного иммунитета. Она предполагает присутствие клеток эффекторов и антител IgO-класса в качестве лиганда между эффектором и клеткой-мишенью. Этот ответ может быть выполнен несколькими типами клеток, включая моноциты, нейтрофилы и эозинофилы. Сравнительная значимость этих клеток как эффекторов АДСС в иммунопатогенезе заболеваний зависит от патогена и антительного ответа на этот патоген [242].
Концепция иммунной защиты требует хотя бы кратко остановиться на местном иммунитете слизистых оболочек. Он связан с субэпителиальной лимфоид-ной тканью, ассоциированной с железами внешней секреции. В субэпителиальном слое слизистых оболочек имеются субпопуляции нефагоцитирузощих макрофагов, которые обладают эффективными функциями [137].
Концепция «общей иммунной системы слизистых оболочек» состоит в том, что секреторные антитела вырабатываются не только на участках слизистых покровов, где имело место антигенное воздействие» но и на отдаленных секреторных поверхностях.
Лечебно-профилактическая эффективность
Продукция ИФН в ЮС зависит от метода культивирования. При роллерном и суспезионном культивировании клеток-продуцентов выход ИФН повышается в 2-Ю раз [50].
На первых этапах исследователи использовали ИФН, индуцированный в ЮС почки эмбрионов или взрослых животных. Так, был получен в достаточно больших количествах ИФН КРС (В.А.Сергеев, 1964)), свиней. Судя по описанным свойствам, это были р-ИФН.
Практический интерес в отношении получения ИФН имеют клетки димфо-идной ткани. Оказалось, что лейкоциты животных активно продуцируют ИФН в ответ на воздействие вирусных индукторов, высоко- и низкомолекулярных природных и синтетических соединений, митогенов, различных продуктов микробного происхождения. Были получены лейкоцитарные ИФН кур, кроликов, КРС, свиней и других животных, установлены основные закономерности биосинтеза, разработаны промышленные технологии получения ИФН.
Общая схема получения природных ИФН с.-х. животных складывается из нескольких стадий: выделения клеток-продуцентов, индукции, биосинтеза, отделения клеток продуцентов от ннтерферонсодержащей жидкости, инактивации индуктора, очистки и концентрации ИФН. Методика получения различных видов ИФН неодинакова.
Для промышленного получения а-ИФН применяются лейкоконцентрэт, содержащий все типы лейкоцитов, в качестве индукторов ингерферонообразова-ния - вакцинный штамм «Н» ВБН [50]. р-ИФН вырабатывается фибробластами или эпителиальными клетками в ответ на введение вирусных и синтетических индукторов. Промышленное получение р-ИФН лимитировано выбором диплоидной клеточной культуры, сво 48 бодной от контаминации микоплазмами, бактериями, вирусами, при получении р-ИФН широко используют метод супериндукции. Процесс получения у-ИФН имеет некоторые особенности. В качестве индукторов применяют конканавалин А, фитогемагглютинин и лектин чечевицы, спиртные экстракты семян фасоли, гороха, стафилококковый эндотоксин. Продуцентами у-ИФН являются обогащенные популяции Т-лимфоцитов [121, 274]. Промышленное производство ИФН осущетвляется в стационарных, роллер-ных культурах и ферментерах. В качестве исходного сырья используют лейкоциты периферической крови, лимфоидные клетки селезенки, костного мозга, лимфатических узлов, молозива, амниотическую оболочку, плаценту, различные типы перевиваемых культур клеток. Важное значение при производстве ИФН имеет состав питательной среды. В первых опытах по получению ИФН из лейкоцитов крови использовали питательные среды с добавлением плазмы крови. В последующем плазму заменили сывороткой крови. В состав питательных сред вместо сыворотки и плазмы можно включать аминопептид, гемогидролизат, амниотическую жидкость. Используют также упрощенные питательные среды, представляющие собой сбалансированные солевые растворы [395]. Крупномасштабное производство ИФН требует разработки оптимальных технологий для каждой стадии, снижения затрат труда, расхода средств на оборудование, питательные среды и т.п. [154,169,177,178,273,345,396 и др.]. Одним из перспективных направлений поиска источников получения ИФН животных стало использование методов генной инженерии [207]. Гены лейкоцитарного, фибробластного и имммунного ИФН клонируют и экспрессируют в микробные клетки, получая, микробный продуцент того или иного ИФН. Методами генной инженерии удалось получить бактерии, когорте способны синтезировать до 5 мг ИФН в расчете на 1 л бактериальной суспензии. Это в 5000 раз больше, чем его получают из 1 л крови донора. Спектр клеток-продуцентов, в которые можно клонировать гены ИФН, постоянно расширяется. В организме животных установлены точки, где отмечены постоянные уровни ИФН. Это лимфатические узлы желудочно-кишечного тракта и органов дыхания, что, видимо, обусловлено постоянным контактом с разного рода индукторами - вирусами, бактериями и т.п. В нормальных физиологических условиях эндогенный ИФН вырабатывает плацента. Он может играть определенную роль в эмбриональном развитии, дифференцировке клеток и ингибировании маїеринімл о ямм) ниіе і а против плода [279]. ИФН в низкой концентрации обнаруживается в легком, сердце, коже, скелетных мышцах, мозге плодов, а также в амииотической жидкости. По биологическим свойствам это а-ИФН. Продукция эндогенного ИФН в организме животных во многом зависит от физиологического состояния организма и условий внешней среды, а также от возраста, индивидуальных особенностей и ряда других факторов. Выраженное влияние на продукцию ИФН оказывает воздействие ионизирующей радиации. Введение экзогенного ИФН и индуктора ИФН повышало защищенность животных от различных видов облучения [390]. Интерферон и выздоровление от вирусных «яфскпий Имеется прямая связь между образованием ИФН и выздоровлением, поскольку наибольшая его продукция отмечается в острый период развития инфекции, предшествующий формированию специфического иммунитета. ИФН появляется в первые дни после инфицирования, а антитела — через несколько дней, когда количество вируса в организме значительно уменьшается. Это подтверждено результатами многочисленных исследований. В то же время иногда отмечается и развитие летальной инфекции, несмотря на высокий уровень ИФН в крови. Очевидно, эффективность противовирусного действия ИФН определяется и особенностями патогенеза заболевания, когда в непосредственном окружении зараженных клеток создается на какой-то период времени высокая концентрация ИФН и ускоряет выздоровление. Некоторые неспецифические факторы, связанные с устойчивостью к инфекции, осуществляют свое действие отчасти и посредством влияния на образова 50 ниє ИФН. К таким факторам относятся: температура тела, некоторые стрессоры, действие ряда гормонов. Большую роль ИФН играет при хронических заболеваниях, где равновесие между продукцией ИФН и репликацией вируса в ряде случаев является одним из ведущих патогенетических механизмов. Особое значение имеет местное образование ИФН в течение короткого времени при развитии локальных поражений. Быстрое образование ИФН блокирует распространение инфекционного агента, особенно важно, если быстро и активно образующийся ИФН предотвращает виру семию. Появление ИФН в крови, моче или носовом секрете обычно указывает на хорошую сопротивляемость организма и возможность благоприятного исхода. ИФН является одним из основных, или основным фактором выздоровления от вирусной инфекции [80].
Технология получения препарата, его токсикологическая оценка и биологическая активность
Основным условием эффективного ведения современного животноводства является обеспечение потребности организма животных набором всех питательных веществ, необходимых для оптимального течения процессов обмена веществ. Чем выше продуктивность животных, тем интенсивнее идут процессы обмена веществ, тем выше требования к полноценности питания.
К сожалению до сих пор понятие актуальности полноценного кормления скота для руководителей и специалистов некоторых хозяйств остается понятием неопределенным. Некоторые руководители и специалисты считают, что если животные получают грубые, сочные и концентрированные корма в пределах норм по массе, да к тому же в рационе рассчитан протеин и энергия по табличным данным, то этого и достаточно. Зачастую даже в научном мире при проведении сложных экспериментов ограничиваются этими же показателями «полноценности» рационов. Эта ошибка является одной их основных причин низкой продуктивности и сохранности поголовья животных в хозяйства.
Наукой давно доказано, а практика целых стран (США, Израиль и др.) и у нас подтвердила, что высокая молочная продуктивность коров — 6-10 тыс. кг за лактацию по стране в целом, обусловлена, прежде всего, сбалансированным питанием животных и не только по основным элементам - протеин, энергия, Са, Р, но и по всем другим БАВ: витаминам, микроэлементам. Важная роль витаминов теперь уже давно всем понятна, а роль и значение микроэлементов пока остается нераскрытой. Особое значение учету потребности организма продуктивных животных г микроэлементах придается по двум важным показателям: - во-первых, многочисленными исследованиями как у нас в стране, так и за рубежом, установлено, что из 70 микроэлементов, обнаруживаемых современными методами в почвах, растениях и животном организме в очень малых количествах, исчисляемых в мг или мкг в 1 кг массы, ряд из них, и особенно: железо, медь, цинк, марганец, кобальт, йод, селен являются жизненно необходимыми для нормального течения процессов обмена веществ, для функционирования органов и систем и, прежде всего, эндокринной, системы органов воспроизводства. Их значение в биохимии и физиологии организма велико. Достаточно сказать, что цинк входит в состав инсулина гормона поджелудочной железы, определяет его активность, кроме того, он в качестве ко-фактора участвует в 80 ферментных реакциях. Медь — составной компонент ферментов-оксидаз, определяющих интенсивность окислительно-восстановительных реакций в организме. Йод входит в состав гормонов щитовидной железы. Кобальт необходим для жизнедеятельности микрофлоры ЖКТ, синтезирующей кобальтосодержащий витамин В12 и все витамины группы В, а также витамин К. Селен — составная часть молекулы фермента глютатвонпероксидазы, который наряду с витамином Е регулирует процессы свободно радикального окисления, и являясь биоантиоксидантам, обеспечивает оптимизацию накопления продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в организме. Марганец катализирует основные реакции в цикле трикарбоновых кислот. Это только малая часть данных, свидетельствующих об огромной роли микроэлементов в организме продуктивных животных и их крайней иеобходимости для оптимального течения процессов обмена веществ и для обеспечения высокой продуктивности животных.
Во-вторых, наукой также установлено, что биологически активные жизненноважные микроэлементы весьма неравномерно распределены в окружающей среде. Еще в 1957 г известный ученый В.В. Ковальский обобщил многочисленные данные о содержании микроэлементов в почвах, растениях, и составил карту биогеохимических провинций на территории нашей страны, выделив в ней зоны с повышенным и дефицитом отдельных элементов.
По данным В.Т. Самохина (1997) поступление микроэлементов с кормами рациона обеспечивает только от 30 до 70% потребности организма в них. Дефицит микроэлементов в кормовых растениях, недостаточное поступление их в организм вызывает патологическое состояние —хронический комплексный гипомгаероэлементоз, т.е. заниженное содержание меди, цинка и других микроэлементов со всеми неблагоприятными для продуктивности животных последствиями.
К сожалению, этому крайне неблагоприятному проявлению влияния окружающей среды на организм животных не уделяется до сих пор должного внимания. В значительной степени это связано с тем, что диагностика гипомикроэлементозов в организме в организме требует использования сложных методов исследований, с помощью которых определяют не расчетную (по таблицам), а фактическую обеспеченность организма микроэлементами. В настоящее время отработаны вполне доступные даже областными ветлабораториями спектральные и химические методы определения микроэлементов в кормах, в крови и органах животных. Установленное с помощью этих методов заниженное их содержание в кормах рациона, и тем более в цельной крови животных, по сравнению с установленными нормативами, хотя бы на 10-20%, то уже можно и нужно ставить диагноз на гипомикроэлементоз. Важно знать, что в начальной стадии, скрытого (латентного) процесса кроме низкого содержания в крови, в печени, клинически специфических признаков гипомикроэлементозов не отмечают. Однако, уже на этой стадии патологического процесса в организме наступают, и биохимическими методами выявляются, нарушения основных видов обмена, а главное - при этом существенно снижается естественная резистентность и иммунобиологическая реактивность организма и животные, особенно молодняк, легко заболевают респираторными, желудочно-кишечными и другими незаразными болезнями, нарушается функция органов воспроизводства, падает сопротивляемость к инфекционным и инвазионным болезням и чем сильнее выражен дефицит микроэлементов, чем дольше он продолжается, тем ярче и более наглядно клинически проявляются указанные выше нарушения, вследствие чего многие животные гибнут или их преждевременно выбраковывают из стада.
Анализ современного состояния животноводства в хозяйствах всех форм собственности, исследования кормов, крови, органов от животных свидетельствуют, что основной причиной никого воспроизводства, Рождения маложизнеспособного молодняка, преждевременная выбраковка, снижение продуктивности и качества продуктов животноводства - является хронический дефицит комплекса жиэненноважных микроэлементов - меди, цинка, марганца, кобальта, йода и селена в организме продуктивных животных.
К этому необходимо добавить, что при дефиците микроэлементов в организме животных в 5-10 раз снижается их содержание в молохе и молочных продуктах, в мясе, в яйцах, а это создает предпосылки для недостаточного обеспечения через зги продукты потребности организма человека в этих микроэлементах, «о всеми вытекающими отсюда отрицательными последствиями для его здоровья, что еще больше повышает значимость проблемы дефицита микроэлементов во внешней среде и гипомикроэлементозов у животных.
Рекомендации по использованию БАЛ на крупном рогатом скоте
Иммуномодулирующне свойства лигавирина (влияние на клеточные и гуморальные факторы иммунитета) испытывали на белых мышах, применяя его в дозах 0,5 и 0,025 мг/кг.
Для изучения влияния индуктора на гуморальное звено иммунного ответа, в частности на антнгелопродуоируюкцую функцию В-лимфоцигов селезенки мышей линии С571/6 и тшр гемагглютининов (ГА), иммунгоацию проводили ЭБ в/бр в оптимальной и субошимальной дозах Число ангителообразующих клеток (АОК) в селезенке определяли визуально по зонам гемолиза в агарозе на 5 день, а тшр ГА к ЭБ на 7 и 14 день после иммунизации
Для изучения развития реакции птерчувствигельности замедленного типа (ГЗТ) мышей линии СВА и С57В1/6 нммунгоироналн в/в в дозе 2-Ю5 ЭБ. Раз-решающую дозу ЭБ (1 10 ЭБ в 0,04 мл физраствора) вводили в подушечку задней лапки на 5 день после иммунизации. Местную воспалительную реакцию оценивали через 24 ч по разнице массы опытной (Ро) и контрольной (Рк) лап. Индекс реакции (ИР) рассчитывали для каждого животного по формуле: ИР=[(Ро-Рк):Рк]хЮО%. Для развития реакции етрансплантант против хозяина» (РТПХ) мышам линии (СВАхС57В1) F1 в подушечку правой задней лапы ВВОДИЛИ 2-Ю6 клеток лимфатических узлов родительского генотипа (СВА). В левую лапу вводили такое же число клеток сингенных лимфатических узлов. На 9 день животных убивали и определяли число клеток в 5 мл гомогената правого (опытного) и левого (контрольного) лимфоузлов. Реакцию оценивали по индексу реакции: ИР число клеток в опыте / число клеток в контроле.
При исследовании влияния интерфероногена на фагоцитарную активность перигонеальных макрофагов, мигращпо которых в брюшную полость вызывали 4% раствором гидролизованного крахмала, в качестве объекта фагоцитоза использовали ЭБ. Мышам линии С57В1/6 в/бр вводили 0,5 мл 5% взвеси ЭБ, через 30 мин. извлекали перитонеальный экссудат, осаждали клетки центрифугированием и лизировади бидистиллированной водой нефагоцитированные ЭБ. После отмывания взвесь доводили до концентрации 2-106 кл/мл, готовили мазки и после окрашивания подсчитывали количество (%) фагоцитируемых клеток. Спекгрофогометрически определяли фагоцитарный индекс (ФИ) и индекс завершенности фагоцитоза (ИЗФ).
При изучении иммуномодулирующих свойств препаратов ИФН (лигавирина и ЙФ) на с.-х. животных определяли: Т-клетки в реакции спонтанного розетко-образования с эритроцитами барана (Е-РОК) и общую популяцию В-лимфоцитов в реакции комплементарного розеткообразовання (EAC-FOK) с эритроцитами, образующими иммунные комплексы с комплементом. Количество теофнлинрезнстенгных и теофилинчувствнтельных лимфоцитов определяли, основываясь на том, что Етр-РОК обладают хелперной активностью, а Етт-РОК - супрессорной.
Количество Кон А — индуцированных Т-лимфощтгов хелперов и супрессо-ров определяли с использованием неспецифических стимуляторов бластогенеза в стандартных мигогенных концентрациях: ФГА (фитогемагглютинин) - с активированными супрессорами, ЛПС (липополисахарид) — с активированными хелперами. Феномен трансформации малых лимфоцитов в способные к митозу властные формы под влиянием митогенного или антигенного стимула изучали в РБТЛ с использованием ФГА и ЛПС Фагоцитарную активность нейгрофилов (ФАН) оценивали, используя в качестве фагоцитируемого объекта инертные частицы латекса размером 0,8 мкм, «иммунный фагоцитоз» - микротестом на стекле по отношению к эритроцитам быка, сенсибилизированным Ig G (ЕА-комплекс). При этом определяли фагоцитарное число — процент клеток, участвующих в фагоцитозе, фагоцитарный индекс - количество частиц латекса, поглощенных одним нейтрофилом и распределение клеток по степени фагоцитарной активности. Состояние кислорсдзависимого метаболизма нейгрофилов оценивали с помощью спонтанного н стимулированного пирогеналом теста восстановления ннтросинего тетразолия до нерастворимого формазана (НСТ-тест). Ход определения спонтанного НСТ-теста: к 50 мл крови с гепарином добавляли 20 мкл раствора НСТ и 20 мкл фосфатного буфера. Пробирки встряхивали и ставили на 30 мин. в термостат при 37С. Делали мазки, высушивали, окрашивали метиленовим зеленым - 10 мин., промывали и высушивали. Результат оценивали под микроскопом, используя иммерсионную систему, проводя подсчет 200 ней-трофилов и определяя процент положительно реагирующих. В цитоплазме положительно реагирующих с НСТ отмечали выпадение гранул формазана фиолетово-синего цвета. В цитоплазме отрицательно реагирующих с НСТ клеток гранулы формазана отсутствовали. При оценке результатов НСТ-теста мы подсчитывали процент клеток, содержащих массивные отложения формазана В связи с трудностью определения критериев массивности, мы считали все клетки, содержащие ясно видимые отложения формазана. По степеня активности все клетки были разбиты на 4 группы: 0 — нейтрофилы без гранул; 1 - нейтрофилы, у которых гранулы формазана занимали 1/4 -1/3 часть цитоплазмы (1 степень активности); 2 — нейтрофилы, у которых вся цитоплазма заполнена гранулами формазана, но имелись участки разреженности (2 степень активности); 3 - нейтрофилы, у которых цитоплазма вся заполнена гранулами форма 89 зана, которые иногда перекрывали ядро и клетка напоминала кляксу (3 степень). Количественное исследование иммуноглобулинов классов Gl, G2 и М проводили методом радиальной иммуяодиффузии в геле с использованием иммунных антисывороток против иммуноглобулинов животных (ВИЭВ).
Лизоцимную активность сыворотки крови (ЛАСК) определяли нефеломет-рическим методом с тест культурой Micrococus Lysodecticus, бактерицидную активность сыворотки крови (БАСК) по отношению к кишечной палочке и активность (3-лизннов по избирательному действию по отношению к Bacillis subiluis. Общую комплементарную активность сыворотки крови определяли фотометрическим способом» основанным на способности комплемента в присутствии гемолитической сыворотки вызывать лизис эритроцитов барана.
Похожие диссертации на Разработка и применение препаратов интерферона и биологически активных добавок в ветеринарии
