Введение к работе
Актуальность исследования.
Острые нарушения мозгового кровообращения, как и многие другие заболевания центральной нервной системы, становятся в последние годы все более актуальной медико-социальной проблемой. Инсульт занимает одно из ведущих мест среди причин смертности и всегда первое место среди причин стойкой утраты трудоспособности. Изучение динамики заболеваемости за последние десятилетия указывает на существование устойчивой тенденции к росту (0,5-1 % в год) числа острых нарушений мозгового кровообращения.
Высокая медицинская и социальная значимость острой сосудистой патологии головного мозга определяет приоритетность научных исследований, связанных с созданием оптимальных схем лечения, а также возможностью подбора препаратов, осуществляющих нейрозащитное действие в условиях ишемии. Существующая неудовлетворенность результатами современной комплексной терапии ишемии мозга объясняется сохранением высокого уровня летальности, значительной инвалидизацией и социальной дезадаптацией пациентов, перенесших инсульт, что во многом связано с отсутствием в арсенале клиницистов эффективных нейропротекторов (Верещагин с соавт., 2002). Данное обстоятельство заставляет более детально изучать механизмы ишемического повреждения структур мозга, а также стимулирует на поиск новых фармакологических агентов для оптимизации всего комплекса лечения больных с инсультами с целью более продуктивного оказания экстренной помощи, снижения летальности, сокращения длительности острого периода, ранней активизации больных и уменьшения инвалидизирующих последствий заболевания.
В качестве перспективной группы соединений для разработки потенциальных нейропротекторов нами были выбраны эндоканнабиноиды (ЭК) и их синтетические аналоги. Эндоканнабиноиды и их рецепторы, входящие в состав эндогенной каннабиноидной системы (ЭКС), обеспечивают тонкую регуляцию синаптической активности и пластичности за счет снижения выброса большинства известных нейромедиаторов, в том числе возбуждающего нейромедиатора - глутамата (Kogan and Mechoulam, 2007). Поэтому представляется целесообразной разработка на основе модуляторов эндогенной каннабиноидной системы новых терапевтических подходов к коррекции повреждений нервной ткани, связанных с нарушениями регуляции нейромедиаторных процессов.
Ведущую роль в запуске каскада цитотоксических реакций, приводящих к ишемической гибели клеток при острых расстройствах мозгового кровообращения, играет чрезмерная стимуляция рецепторов глутамата, которая вызывается его усиленным выбросом из пресинаптических терминалей и приводит к накоплению в нейронах ионов кальция, поступающих через ионные каналы. Стойкое повышение внутриклеточной концентрации Са2+ инициирует деструктивные липо- и протеолитические реакции, сопровождается генерацией свободных радикалов и реактивных форм кислорода, что в конечном итоге приводит к необратимым повреждениям нервных клеток по пути некроза и/или апоптоза. Повреждению нервной ткани сопутствуют воспалительные реакции, которые также усугубляют течение нейродеструктивного процесса (Гусев с соавт., 1997).
Одним из наиболее изученных эндоканнабиноидов является N-арахидоноилэтаноламин (анандамид). Было показано увеличение содержание анандамида и его предшественника в ткани мозга при ишемическом воздействии (Panikashvili et al., 2001; Schbitz et al., 2002). Анандамид защищает нейроны в культуре от цитотоксического действия глутамата (Shen and Thayer, 1998), а также снижает выраженность ишемических повреждений в некоторых моделях ишемии in vivo (Schbitz et al., 2002; Franklin et al., 2003; Muthian et al., 2004; Degn et al., 2007; Amantea et al., 2007), что свидетельствует о несомненном нейропротекторном потенциале представителей семейства эндоканнабиноидов.
Важно отметить, что в тканях млекопитающих были обнаружены и другие производные жирных кислот, взаимодействующие с белками эндоканнабиноидной системы. На сегодняшний день это довольно большая группа соединений, представленная преимущественно амидами ненасыщенных жирных кислот с биогенными аминами (этаноламин, аминокислоты, нейротрансмиттеры). Физиологическая роль подавляющего большинства представителей данного семейства и их метаболитов остается до конца не изученной.
Недавно из мозга крысы был выделен новый эндоканнабиноид N-арахидоноилдофамин (АД). В ряде работ было показано, что АД и другие N-ацилдофамины способны ингибировать агрегацию тромбоцитов, стимулируют мозговую микроциркуляцию (Васильева с соавт., 2002), проявляют противовоспалительное и антиоксидантное действие (Бобров с соавт., 2006), однако нейрозащитное действие N-ацилдофаминов практически не изучалось.
Существенным недостатком анандамида и родственных соединений является их низкая метаболическая стабильность и, как следствие, быстрая инактивация. Под действием различных клеточных гидролаз, в частности гидролазы амидов жирных кислот (ГАЖК), анандамид распадается на арахидоновую кислоту и этаноламин (Vandevoorde and Lambert, 2007). N-ацилдофамины также являются субстратом этого фермента, хотя их гидролиз протекает с меньшей скоростью. Поэтому использование ингибиторов гидролазы амидов жирных кислот может рассматриваться как способ повышения эффективности действия эндоканнабиноидов с нейропротекторными свойствами.
Таким образом, изучение механизмов действия агонистов каннабиноидных рецепторов позволит расширить представление о функционировании и роли ЭКС в организме, а также разработать на основе модуляторов ЭКС новые терапевтические подходы к коррекции повреждений нервной ткани, связанных с нарушениями регуляции нейромедиаторных процессов.
Цель работы.
Исследование нейропротекторных свойств эндоканнабиноидов семейства N-ацилдофаминов, а также комбинации N-ацилдофаминов с ингибиторами их гидролиза на моделях повреждений нейронов в культурах клеток различных структур головного мозга и при экспериментальной церебральной ишемии in vivo.
Задачи исследования.
-
Оценить на светооптическом уровне влияние N-ацилдофаминов N-арахидоноилдофамина и N-докозагексаеноилдофамина на степень повреждения нейронов при индукции апоптоза и цитотоксическом действии глутамата в культурах клеток мозжечка и новой коры, исследовать нейропротекторный эффект этих соединений, а также выявить возможные механизмы этого эффекта.
-
Исследовать развитие культуры клеток гиппокампа на мультиэлектродной матрице и оценить влияние каннабиноидов N-арахидоноилдофамина и N-докозагексаеноилдофамина на вызванные глутаматом изменения биоэлектрической активности нейронов в функциональной нейронной сети, сформированной клетками гиппокампа.
-
Изучить влияние на выживаемость клеток N-ацилдофаминов, используемых совместно с ингибиторами их гидролиза в модели нейронального апоптоза in vitro.
-
Провести патоморфологическое исследование зоны ишемического повреждения коры головного мозга крыс при действии модуляторов ЭКС и выявить их влияние на ультраструктурные изменения в клетках при фокальной ишемии, индуцированной фототромбозом.
Научная новизна.
В результате проведенного исследования получены новые данные о нейропротекторных свойствах и возможных механизмах защитного действия модуляторов эндоканнабиноидной системы из семейства N-ацилдофаминов при моделировании апоптотического повреждения и цитотоксическом действии глутамата в культуре клеток различных структур головного мозга. Применение современной технологии культивирования клеток на мультиэлектродной матрице позволило показать роль активации каннабиноидных рецепторов (КР) в нормализации биоэлектрической активности нейронной сети, подвергнутой цитотоксическому воздействию глутамата. Впервые получены данные о нейрозащитном действии N-ацилдофаминов при ишемическом повреждении коры головного мозга крыс. Предложен подход для повышения эффективности нейрозащитного действия за счет применения N-ацилдофаминов в комбинации с ингибиторами их гидролиза.
Научно-практическая значимость.
Полученные данные расширяют представления о механизмах нейропротекторного действия модуляторов ЭКС и могут служить экспериментальным обоснованием разработки фармакологических агентов, способных уменьшать или предотвращать нейродегенеративные изменения при ишемических формах церебральной патологии, а также активировать репаративные процессы в постишемический период.
Положения, выносимые на защиту.
1. Исследованные N-ацилдофамины при индукции апоптоза и цитотоксическом действии глутамата в культуре клеток мозжечка и новой коры оказывают дозозависимый нейропротекторный эффект, опосредуемый каннабиноидными рецепторами 2-го типа.
2. N-арахидоноилдофамин и N-докозагексаеноилдофамин нормализуют вызванные глутаматом изменения биоэлектрической активности нейронов в функциональной нейронной сети, сформированной клетками гиппокампа на мультиэлектродной матрице.
3. Повышение нейропротекторного потенциала модуляторов эндогенной каннабиноидной системы достигается благодаря совместному использованию агонистов каннабиноидных рецепторов и ингибиторов их гидролиза.
4. Исследованные модуляторы эндогенной каннабиноидной системы оказывают нейропротекторный эффект и активируют репаративные процессы в коре головного мозга крыс при ее ишемическом повреждении in vivo.
Внедрение результатов исследования.
Перспективой внедрения результатов исследования является возможность их использования в материалах семинаров и лекций для студентов биологических и медицинских специальностей и школ для молодых ученых по вопросам экспериментальной и клинической неврологии. Исследованные соединения могут послужить прототипами новых лекарственных средств коррекции нейродеструктивных процессов при ишемических формах церебральной патологии.
Апробация диссертации.
Работа апробирована и рекомендована к защите на совместном заседании лабораторий Отдела исследований мозга Научного центра неврологии РАМН, НИИ Физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, Института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (ноябрь 2011 г.). Материалы диссертации были представлены на XIII научной школе-конференции молодых ученых по физиологии высшей нервной деятельности и нейрофизиологии (Москва, 2009), IV Международной научной конференции молодых ученых-медиков (Курск, 2010), 6-м Международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, Украина, 2010), Всероссийской конференции «Современные направления в исследовании функциональной межполушарной асимметрии и пластичности мозга» (Москва, 2010), конференции молодых ученых НЦН РАМН (Москва, 2011), Всероссийской конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2011), 3-м Международном симпозиуме "Topical Problems of Biophotonics-2011" (Нижний Новгород, 2011).
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 2 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ, 5 – в сборниках статей, 2 тезиса докладов на международных конференциях.
Объём и структура работы.
Диссертация изложена на 144 страницах машинописного текста, содержит 5 таблиц и иллюстрирована 24 фотографиями и рисунками. Работа включает введение, обзор литературных данных, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, их обсуждение, выводы и библиографический указатель, состоящий из 19 отечественных и 246 зарубежных источников.
Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам Отдела исследований мозга ФГБУ НЦН РАМН и научной проблемной группы «Клеточные технологии» НИИ прикладной и фундаментальной медицины Нижегородской Государственной медицинской академии под руководством д.б.н., профессора И.В.Мухиной.
